病原生物学实验.ppt

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1、病原生物学实验,一、实验目的,1学习、掌握有关病原生物学的基本操作技术，如普通光学显微镜油镜的使用和保养、涂片染色、分离接种与细菌培养、病原菌分离鉴定和免疫学诊断等基本操作技术，树立无菌观念；2通过寄生虫标本的观察和基本实验技术操作，掌握常见人体寄生虫的辨认，掌握具有诊断价值的寄生虫形态特征和常见寄生虫的病原学检查方法；3通过综合性、设计性实验项目，树立实事求是的科学态度和培养独立分析问题与解决问题的能力，为开展有关疾病的诊断与防治以及从事病原生物学的科学研究工作所必需的实验方法与技术打下一定的基础。,二、实验要求,1每次实验前必须做好预习，明确实验目的、原理、方法及操作中的注意事项等，避免和

2、减少发生错误。 2实验过程中必须持严肃认真的态度。 3对实验结果必须进行仔细地观察和认真地记录，然后进行科学分析，得出恰当结论。 4独立认真完成实验报告，书写实验报告格式要规范、字迹要清楚，语言简练，表格清晰，画图应力求反映实际标本的原状。 5切实遵守实验室规则。,1进实验室时必须穿好工作服，离室时需脱下反折，工作服要经常清洗消毒。2书包、衣物等物品请放在实验室的贮物柜中，随身只带必要的实验指导、笔记本和文具，进入实验室后放入实验台的抽屉内。 3实验室内要保持肃静、守秩序，不得高声谈笑和随处走动，玩弄手机等。 4实验室内禁止饮食和吸烟，不得用嘴舔湿铅笔和标签等。 5如遇有盛检验材料的器皿破损或

3、污染其它物品时，应即用3%的来苏儿消毒；皮肤破伤时须向指导教师报告，采取适当的消毒及防止感染措施。,三、实 验 室 规 则,6用过的有菌器材或培养物等，应放于指定的地点，不得随意抛置。 7注意节约实验试剂，爱护实验器材。损坏器材时，应立即报告指导教师，按有关规定处理。 8易燃物品（酒精、二甲苯等）不准接近火源。一旦起火，应迅速用沾水的布类和沙土覆盖扑火。 9实验结束后，将实验台整理好，值日同学打扫室内卫生，并检查水、电等开关是否关好，防止发生安全事故。 10每次实验后均要用肥皂洗手，必要时用消毒液泡手。,实验一 细菌的形态检查（1）,1.掌握显微镜油镜的使用和保养方法；2.学会观察细菌的基本形

4、态和一些特殊结构；3.掌握细菌涂片制作、革兰染色操作方法及意义；,实验目的：,（一）显微镜油镜的使用和保养,1.显微镜基本知识,显微镜的构造 （1）光学部分 （2）机械部分,实验内容：,显微镜的放大倍数和分辨率 1.放大倍数=接物镜放大倍数接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨力：是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为： R=0.61/N.A 式中R：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) N.A =nsin(/2 )为镜口率n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 ：镜口角（即入射角）。目前实用范围内物镜的最大镜口率为1.4, R=0.61*0.5

5、5/1.4=0.25而人眼的分辨率为0.25mm,所以一个大小为0.25 m的微粒需经显微镜放大1000倍便可以观察。,2.油镜的使用和保养（1）油镜头的识别 油镜头的下缘，一般刻有一白色圈，标有油 90、100、oel、oil等字样。 显微镜的接物镜有低倍镜头，高倍镜头和油镜头，其中油镜头的放大倍数最大。,（2）油镜的原理：,当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率1.515与玻片1.52的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。,（3）油镜的使用方法1）将显微镜

6、直立于桌上，不要扳动倾斜关节，使载物台保持水平。2）对光：用低倍镜对光，检查染色标本时光线宜强。要抬高集光器，放大光圈。3）滴加香柏油一小滴于染色标本片上，将标本置于载物台上，移置待检部分于接物镜下。4）换用油镜，眼睛从侧面看着物镜，转动粗调节器，使镜筒下降至油镜头浸入镜油并几乎接触标本片。 5）左眼看接目镜，一面观察，一面缓慢转动粗调节器，使镜筒上升，直到观察到模糊的物像时，再适当转动细调节器，使物像完全清晰，即可正式观察。,1）标本观察完毕，向上转动粗调节器将镜筒提起，取下标本，用擦镜纸将镜头上的油擦净。若油已干，可用擦镜纸沾少许二甲苯擦去油迹，随即用擦镜纸擦去二甲苯。 2）将物镜转成“八

7、字形，以免损坏油镜。降低集光器，竖起反光镜，将显微镜放入镜箱。,（4）油镜的保养方法,葡萄球菌,大肠杆菌,霍乱弧菌,（二）细菌的基本形态与特殊结构观察,1细菌的基本形态观察,细菌的基本形态可分为球菌、杆菌、螺形菌（包括弧菌）三类。,变形杆菌（鞭毛）,肺炎链球菌（荚膜）,破伤风杆菌（芽胞）,2.细菌特殊结构的观察,细菌的形态学检查方法染色标本检查法,观察细菌的形态、大小和排列，还能鉴别细菌。,（三）革兰染色法,该染色法是最常用最重要的染色法。是丹麦细菌学家革兰于1884年创建的，至今仍广泛应用。,1. 革兰染色法的原理,渗透学说：与肽聚糖结构有关。 革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量高，酒精不易渗透，

8、而革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量少，脂类含量高，酒精易渗透进入细胞内，将结合的结晶紫碘复合物脱出。化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关。 革兰阳性菌细胞质中的核糖核酸镁盐与结晶紫-碘结合形成更大的复合物，不易被酒精脱出。等电点学说：与细菌所带电荷有关。 革兰阳性菌等电点低（pI）为2-3，在中性或碱性环境中所带负电荷多；革兰阳性菌pI为4-5，所带负电荷少，影响结合染色的多少。,2.实验材料与方法,（1）材料: 菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌培养物 染液：结晶紫染液、卢戈碘液 95%酒清、稀释复红 其他：玻片、接种环、酒精灯 无菌生理盐水、显微镜等（2） 方法： 细菌涂片的制作：涂片、干燥、固定

9、 革兰染色：初染、媒染、脱色、复染 油镜使用：观察染色结果并记录,染色标本检查的基本程序,涂片干燥固定染色涂片：接种环灭菌、平板取材、细菌涂布干燥：自然干燥、热空气干燥固定：通过火焰外焰三次染色：初染、媒染、脱色、复染,细菌涂片的制作,革兰染色法（Gram染色）,染液组成： 结晶紫染液、卢戈碘液 95酒精、稀释复红染色方法：,结晶紫 初染,卢戈碘液 媒染,95酒精 脱色,稀释复红 复染,1分钟,1分钟,影响革兰染色的关键步骤是脱色,水洗,水洗,水洗,水洗,干燥,30S1min,Procedures of Gram Staining,初染,媒染,脱色,复染,结晶紫1分钟,卢戈氏碘液1分钟,95%

10、酒精30秒,稀释复红30秒,3.革兰染色结果,紫色革兰阳性菌,红色革兰阴性菌,4.革兰染色意义,有助于鉴别细菌有助于选择用药有助于了解细菌的致病性,影响革兰染色的因素,1. 操作因素 涂片的厚薄 脱色时间的长短2. 染液因素 卢戈碘液放置时间过长 95乙醇挥发 结晶紫与草酸铵混合时间太长3. 细菌因素： 细菌种类 细菌菌龄,实验报告：1、显微镜油镜的使用和保养方法以及使用过程中的注意事项。2、请画图示意细菌的基本形态和特 殊结构。（标明：细菌名称、染色法、放 大倍数）,实验报告基本格式,湖州师范学院病原生物学与免疫学实验 实验报告实验项目名称：*一、实验目的要求：二、实验原理：三、实验材料：四、实验方法和操作步骤： 五、实验结果： 六、实验结果分析和总结：,