植物病毒病的发生_为害及防治研究进展_刘勇.doc

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1、DOI: 10. 16847/j. cnki. issn. 1672-4542. 2003. 02. 006 辣椒杂志 C 季刊 ) LAJIAO ZAZHI 2003 年第 I期 植物病毒病的发生、为害及防治研究进展 刘勇 1张 战 泓 2 (1.砌南省植物保护研究所长沙 410125 2湖南省蔬菜研究所长沙 410125) 摘 *病毒病引起农业生产中的严重损失。目前用于病毒病防治的方法主要有 :种质资源的利 用、利用杀虫药剂防治病毒传毒介体一昆虫或诱导 植物产生抗病毒物质、通过遗传修饰的方法获 得抗病毒病作物品种本文对这些方法进行了综述，并对其优缺点和应用价值进行了评述。 关键调 :植物病

2、毒发生与防治 植物病毒病的发生及危害 病毒病是发生于许多作物上的重要病 害 据统计，全世界每年因病毒病为害造成的 直接损失达 150 亿美元以上。我国许多重要 的经济作物，如烟草、花卉和多种蔬菜作物， 每年因病毒病造成的直接经济损失达 10 亿 美元以上。 病毒为害植物与其它病原物有显著的差 异：即病毒粒子借助其它因素 （ 如昆虫、人为 或自然因 素造成的植物的伤口等 )进入植物 体内后，利用植物细胞的信息、能量和酶系 统，完成病毒自身的复制与增殖，植物病毒的 这种增殖机制给病毒病的防治带来了极大的 困难。 植物病毒病的防治措施 传统的防治植物病毒病的措施主要有： 1 有效利用巳有的抗源材料

3、植物在与病原物长期协同进化过程中， 会产生一些能抵御某些病原物的特殊性状， 这些性状一旦稳定即可遗传给子代。直接利 用这些抗病特性，可以培育出符合生产实际 需要的抗病新品种。但利用抗病资源培育抗 病品种，育种周期很长，而且抗病性与产量、 品质等性状往往很难协调统一。 2 利用化学药剂控制病毒病 通过杀虫剂杀死传毒昆虫介体 ,对防治 某些病毒病有一定的效果，但颇费人力、物力 和时间，对非持久传播的病毒效果较差。 有些化学物质对病毒侵染或病毒在植物 体内的繁殖有一定程度的抑制效果，或者被 植物吸收后，可诱导植物产生一定程度的抗 病性。Schustei研究出的 E30 制剂，通过喷 施到植物表面后，

4、很容易被植物所吸收，吸收 到植物体内的 E30 对侵染植物的多种病毒 具有较好的钝化作用。这些病毒包括 TMV、 CMV、 PVX、PVY、 马铃薯 A 病毒 （ potato virus A， PVA)、甜菜坏死黄脉病毒 （ beet necrotic yellow vein virus, BNYVV)、 番前 花叶病毒 （ tomato mosaic virus， ToMV)、 黄 瓜绿斑驳花叶病毒（ cucumber green mosaic vims, CGMV)、红三叶草斑驳病毒 （ red clover mosaic virus，RCMV)等，防治效果可 达 40% 90%。雷新云

5、等的研究表明， NS83 增 抗剂可有效地防治侵入烟草等植物的 TMV 和 CMV， 其效果可达 30% 50%; Schuster 等 的 研 究 表 明 ， DHT (2，4： 一 dioxohydro _ 1， 3， 5， triazine)对侵染植物的 多种病毒具有治疗作用，但病毒种类不同，其 治疗效果差异很大。目前化学药剂尚无法根 治病毒病，而且由其引起的环境污染和对生 态系统的负面影响已越来越引起人们的担 忧。 收稿日期 2003 3 11 作者简介 :刘勇 （ 1966 ）， 男，博士，副研究员，主要从事植保和无公害蔬菜选育与栽培研究。 13 2003 年第】期 LAJIAO Z

6、AZHI 辣椒杂志 (季刊 ) 3 通过组织脱毒法获得无病鸾病种植材料 这种方法主要适用于无性繁殖的农作 物。将未被病毒侵染的植物组织材料 (如茎 尖，芽尖等），通过组织培养获得大量无病毒 的健康苗，而后再移栽到大田。但是由于成本 高，工作量大，特别是由于田间的再侵染，使 得植株的无毒期不长，往往二三年后“旧病复 发”，具有一定的局限。 总的来说，目前的防治方法尚无法从根 本上解决病毒病的危害。在 20 世纪 80 年代 植物基因工程问世的初期，科学家们即想通 过基因工程的办法来改良作物的抗病毒特 性。目前，植物抗病毒病基因工程已经取得了 一些可喜的成效。 抗病毒植物基因工程研究进展 20 世

7、纪 50 年代 DNA 双螺旋结构的阐 明和 70 年代发展起来的 DNA 体外重组技 术，为人们有效地控制植物病毒病提供了一 条新途径，即利用遗传工程的技术手段改良 现有作物，以培育抗病、优质的新品种。 1986 年， Beachy等人首次获得了抗烟草花叶病毒 感染的烟草，此后在植物抗病毒基因工程方 面取得 了令人瞩目的成就。目前，植物抗病毒 基因工程中采取的策略包括以下几个方面： 1 利用由病毒编码的蛋白所介导的抗性 1.1 病毒外壳蛋白介导的抗病性 利用病毒外壳蛋白基因培育抗病毒病转 基因植物的设想来自于“交叉保护”。“交叉保 护”的概念告诉我们：当植物受到某 一 种病毒 侵染后，可免除

8、其它同源病毒的侵染。许多试 验证明交叉保护和病毒外壳蛋白有关。有的 研究者提出，采用适当的技术或手段，使植物 获得产生病毒外壳蛋白的基因，并且能正常 表达时，即可使植物具备类似于人或动物的 免疫功能。 Powell 等的研究表明这一 设想是 完全可行的，而且具有实际应用的价值。他们 将 TMV 的外壳蛋白 （ CP)基因反转录成互 补 DNA(cDNA)， 体外扩增后构建到质粒 中，形成嵌合质粒。在嵌合质粒中 ，TMVCP 14 基因位于花椰菜花叶病毒 （ CaMV) 的 35SmRNA 强启子的调控之下。将嵌合质粒 转移至农杆菌 （ Af ， 含嵌合质粒的农杆菌与烟草叶盘共培养，将 TMV

9、CP 基因转入烟叶细胞的染色体，形 成转化细胞，转化细胞进一步形成愈伤组织， 最终 分 化 为 完 整 的 转 基 因 植 株 。 通 过 Norrhern blot 测定： TMV CP 基因在烟叶 片中可被转录，其 mRNA 占烟叶片总 RNA 量的 0 005% 0. 01 % Western blot 测定结 果表明 :CP 翻译产物一外壳蛋白占烟叶可溶 性蛋白总量的 . 1% . 2%;以 0.5ug/mL 的提纯TMV 接种转基因烟草测定抗性，结 果表明所有转基因烟草植株均有不同程度的 耐病或抗病性，不少植株接种后 40 50d (天）不显示任何症状，极少数植株 2 3 个月 内未

10、表现症状 -Powell 等认为：转 CP 基因的 植物的抗性是 CP 积累的结果而不是 CP 基 因转录产物积累的结果。他们采用点突变的 方法 获得能阻断 TMV CP 基因转录产物 翻译的突变体，并转化烟草，在转基因植株 中， CP 基因转录体大量存在而没有 CP产 生，转基因植株对 TMV 的侵染没有抗性。 1.2 病毒基因组上的其它基因的产物 (1) 复 制 酶 人 们 根 据 Beachy 的试验 结论推测 :病毒基因组中的其它基因或其衍 生物(如缺失突变体等 )导入植物可能会具有 同样的特征。 Golemboski 等将 TMV U1 株 系核酸第3472 4916 处的一段 RN

11、A 序列 (据推测它编码复制酶复合物的一种成份即 54KD 蛋白）的cDNA 转入烟草后获得了转 基因植 株。利用TMV U1 接种测定转基因 植物抗性，结果表明 :这 种 转 基 因 植 物 不 仅 对 高 浓 度 TMV UHlOO/ig/mL) 具有高抗作 用，而且对TMV/ RNA 接种物同样具有髙 度抗性，甚至当 TMV/RNA 浓度达 300 叫 / mL 亦如此。后来，在 PEBV、 CMV、 PVX、 PVY 等病毒中均报道过类似利用与复制酶 基因有关的组分转化植物获得抗性。 (2) 病 毒 移 动 蛋 白 基 因 病 毒 侵 染 植物 辣椒杂志 (季刊 ) LAJIAO ZA

12、ZHI 2003 年第 1 期 以后，如果仅局限于侵染点， 不产生系统性侵 染 ,则对植物不会形成大的损害。因此，病毒 必须从侵染点向植物其它健康细胞扩散，方 可形成系统侵染。病毒在植物体内的扩散分 为主动扩散与被动扩散。被动扩散是由细胞 与细胞之间进行物质交换或细胞本身新陈代 谢时，病毒粒子通过维管束组织完成的 ;主动 扩散则是由病毒本身的某些因子，主要是移 动蛋白 （ Movement Protein )和植物细胞间 (主要是胞间连丝及其中的一些蛋白）与植物 细胞内的一些因子的互作下，通过胞间连丝 进行细胞间的传播。通过分子生物学技术将 TMV的正常株系缺失突变后，使其 失去产 生移动蛋白

13、的能力，再接种健康普通烟草，不 会产生系统侵染 ;而对照（即正常的 TMV) 则可发生系统性侵染。 Ziegler 等的研究表 明，用 TRV 的正常的移动蛋白基罔所获得 的转基因烟草，对 TRV 不仅没有讀现出抗 性，反而更加容易发病。 Patricio 等将缺失的 移动蛋白基因置于 CaMV35S mRNA 启动 子之下，转化烟草，然后用缺失移动蛋白基因 的 TMV 攻毒，转基因植物不会产生系统侵 染 ;当用正常的TMV 攻毒时，也不会产生系 统侵染，但产生局部枯斑。 Cooper 等将 TMV 的移动蛋白基因缺失后转化烟 草，获得的转 基因烟草不仅对烟草花叶病毒组的多种病毒 具有抗性，同

14、时对烟草脆裂病毒 （ tobacco rattle virus， TRV)、 烟草环斑病毒 （ tobacco ringspot nepovirus，TobRV)、 ALMV、 花生 裡 绿 线 条 病 毒（ peanut chlorotic streak， PCSV)及 CMV具有抗性 .用马铃薯 X 病毒 的移动蛋白基因的缺失突变体获得的转基因 植株，对 PVX 和马铃薯奥古巴花叶病毒 (potato aucuba mosaic potexvirusPAMV) 均具有抗性，但 是对非三分体基因组病毒 PVY 的侵染没有抗病性。 2 RNA 介导的抗病性 2.1 利用病毒的卫星RNA 卫星

15、RNA是一类依赖于辅助病毒才能 复制的低分子量 RNA， 包含于病毒外壳蛋白 内，它可干扰辅助病毒的复制，可以减轻或加 重辅助病毒引起的症状，卫星 RNA 实际上 是病毒的分子寄生物。田波等利用卫星 RNA 作为生防制剂，控制 CMV 引起的病害获得 了成功 生防制剂 CMVS51， CMVS52 在防 治辣椒和烟草病毒病中取得了明显的效果。 周雪平等从田间分离获得了 CMV 卫星 RNA， 并证明可用于番茄和烟草田间病毒病 的防治，Baulcombe 等将 CMV 的卫星 RNA 的 cDNA的单体及双体插入 Ti 质粒，构建 了含CaMV35S mRNA 强启动子、蓝曙红合 成酶终 止 序

16、 列 和 CMV 的 卫 星 RNA 的 cDNA的杂合质粒，成功地转入烟草并获得 了转基因植株，能产生卫星 RNA 的转录产 物，转基因植物对 CMV 的侵染近于免疫。赵 淑珍等 14将 CMV 卫星 RNA 的 cDNA 转 入番茄中获得的转基因番茄对 CMV 具有很 强的抗性。利用病毒卫星 RNA 时，卫星 RNA 只箱低水平表达并且不需要产生新的 异源蛋白就可使转基因植物产生较强的抗 性，可避免 外源基因在植物体内产生异源蛋 白而对植物产生不利影响。但利用卫星 RNA 也存在着局限性，其中最突出的问题是存在 着潜在的危险。因为减轻病毒的症状的卫星 RNA 和增重病毒症状的卫星 RNA之

17、间有 时只有几个甚至一个械基的差异，在自然界， 几个碱基发生自然变异不是很困难的，因此 人们担心使用减轻病毒症状的卫星 RNA会 因 RNA 的突变而加重病毒病的症状 2. 2 利用反意 RNA (Antisense RNA) 反意 RNA是指与 mRNA互补的 RNA。反意 RNA 与其相应的 mRNA 互补， 则该基因的表达受到抑制。反 意 RNA 对原 核生物和动物细胞的基因表达具有抑制作 用。在细胞中，与转录起始区互补的反意 RNA 效果最好，而在动物细胞中，与 3/末端 互补的反意RNA 对基因表达抑制作用最明 显，因此，植物病理学家们也希望利用病毒的 反意 RNA 在控制病毒病中发

18、挥作用。 2.3 病毒 RNA 所介导的抗病性 15 2003 年第 1 期 LAJIAO ZAZHI 辣椒杂志 (季刊 ) 许多研究工作表明：转入植物体内的病 毒的某些基因能正常转录，产生正常的 RNA，但是不能翻译成其所编码的蛋白质， 转基因植物对病毒具有抗病性，而且这种抗 性往往近于免疫。但是，这种 RNA 所介导的 抗病性一般只对同组或同源的病毒具有抗性 作用。由于病毒基因可以正常转录，只是不能 翻译，因此有的研究者也将其称为“转录后的 基 因 沉 默 ”（ post transcriptional gene silencing)。 但是这种“基因沉默”和转入的外 源基因的失活而引起的

19、“基因沉默”完全不 同：后者是由于转入的外源基因完全不能转 录而产生的。 Dougherty 等将烟草蚀纹病毒 TEV 外 壳蛋白基因突变，使其转录的 RNA 失去翻 译外 壳蛋白的能力，将其 5/端非编码区与外 壳蛋白突变体 一 起置于 CaMV35S mRNA 启动子控制之下，转化烟草，获得了 49 株转 基因植物。通过用 TEV 对其中的 8 株进行 攻毒，结果显示：有的植株对 TEV 表现出极 强的抗性，接种后的转基因植株体内没有发 现 TEV 的复制；有的开始表现为感病，但随 后可以恢复到正常；还有的没有抗性。在对 TEV 表现为高抗的转基因工程植物中，转入 的外源基因的转录频率和转

20、录形成的稳定的 RNA 的水平很低均表明：基因沉默介导的抗 病性是由于转录后 RNA 的降解所介导的。 RNA 的降解似乎 是从切割“靶”RNA 序列上 的许多特异性位点开始的。 转录后的基因沉默所介导的抗性，可能 是外 源 基 因 转 录 产 生 的 RNA 具有某种 RNase 的作用，从而特异性地降解病毒的 RNA;或者是外源基因转录产生的 RNA激 活了植 物 的 防 御 系 统 ， 使 植 物 产 生 了 某 种 RNase， 特异性降解了病毒的 RNA, 3 植物本身编码的抗病毒基因 商陆 （ Pokeweed， ) 叶片中的一种核糖体蛋白经体外试验表明它 可以抑制多种病毒侵染商陆

21、和其它许多种类 的植物，这种蛋白称为商陆抗病毒蛋白 16 (PAPpokeweed antiviral protein). Lodge 等人通过克隆编码 PAP 的 cDNA， 转化烟草 能表达 PAP，或其突变衍生物的转基因植物 均能抵抗多种不同病毒的侵染，这种抗性对 机构传播和蚜虫传播的病毒同样有效。将能 表达 PAP 的转基因植株的叶片通过真空抽 滤后发现其胞间液中含有大量的 PAP。 对这 类转基因植物的抗病毒鉴定分析后发现， PAP 在病毒侵染的早期阶段的某 一 时期发 生了作用。利用 PAP基因构建的病毒转基因 植物同以往的转基因植物有着显著的不同： PAP 介导的抗性上有广谱性

22、，可抵抗多种不 同病毒的侵染，因此，在这类转基因植物中只 需 PAP 基因，而一般的抗病毒基因介导的抗 性只对某些或具有亲缘关系的病毒具有抗 性，因此需要在同一转基因植物中引入多种 不同的抗病毒基因。 另外，编码病毒侵染植物后诱发产生的 病程相关蛋白（即 PR 蛋白）的基因也受到人 们的注意，如果能将这些基因分离出来并转 化植物，则有可能提高植物本身内在的抗病 性，这种抗病性是植物诱导抗病性的形式之 一。信号传导在 PR 蛋白产生过程中具有相 当重要的作用，而信号产生和传递的过程非 常复杂，其中包括了植物的许多生理生化 过 程，植物的许多酶系统和能量系统直接或间 接参与了这一过程，因此必需在对

23、植物有关 防御机制进行深入研究后才有可能加深对植 物诱导抗病性的认识。 4 其它抗病毒策略 4.1 利用抗体基因 Tavladoraki 等的研究表明，单链抗体 (Sc)的可变区 （ Fv)基因在转基因植物内的 组成型表达可对病毒产生抗性，可使转基因 植物延迟发病或不发病。表达 TMV 全长单 克隆抗体基因的转基因植物， TMV 攻毒时， 与非转基因植物相比较可产生更加明显的局 部性坏死，并形成更多的枯斑。单链抗体基因 很小，无需装配 ,因此特别适合于在 植物体内 表达，抗体基因在转基因植物内的表达，不会 辣椒杂志 (季刊 ) LAJIAO ZAZHI 2003 年第 1 期 产生重新包装侵入

24、植物体内的病毒而产生新 的病毒的危险。 4.2 千扰素介导的抗病毒策略 在哺乳动物体内，干扰素可提供广泛的 抗病毒特性，由干扰素诱导合成的蛋白质可 直接抑制病毒的增殖。通过克隆鼠体的编码 2,5 寡腺苷酸合成酶的 cDNA 转化马铃 薯，获得的转基因植物在温室和田间均可抵 抗 PVX 的侵染。因此 ,干扰素在植物抗病毒 基因工程中具有潜在的应用价 值。 4.3 核酶 核酶是一类具有催化功能的 RNA 分 子，广泛存在于自然界，任何生物甚至类病毒 的RNA 都可以作为核酶的底物，只要已知 某种RNA 的序列，就可以根据不同要求设 计出用于各种不同目的的核酶。自然存在的 核薄催化反应是在分子内部发

25、生的，即核酶 和其底物为同一 RNA 分子。核酶催化切割 反应时形成纺锤状的二级结构，其底物只需 含有 X、 U、 Y 三个碱基，其中 X 为任一喊基， Y 为 A、 U 或 C。核酶基因工程的潜在危险是 核酶有可能将正常植物的 RNA 作为靶 RNA 切割，从而破坏的正常生理功能，甚至 引起植物生长 发育异常。 参考文献 1 季良 中 国 植 物 病 毒 志 .中国农业出版社，北京， 1992 2 裘维蕃 .我国植物病毒学及病毒病研究三十年植物 病理学报 ,1980,20(4h 1 5 3 bradford, M, A rapid and sensitive method for the q

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33、crops especially in vegetables. There are many methods to control the viral diseases. The application of genotypes is a traditonal way. Some pesticides are usually used to control these viral diseases spread by insect. Since 1980 8, the genetic modification has been largely applied in the production of virus resistant crop varieties. All these methods are summarized in this article. Key words Plant Virus diseases Ocurrence and control 17