第四章-蛋白质--王镜岩《生物化学》第三版笔记文库 .docx

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1、精品名师归纳总结第四章 蛋白质 - 王镜岩生物化学 第三版笔记 完善打印版 文库 .txt假如不懂就说出来， 假如懂了，就笑笑别说出来。贪婪是最真实的贫困，满意是最真实的财宝。幽默就是一个人想哭的时候仍有笑的兴致。第四章蛋白质提要一.概念简洁蛋白、结合蛋白、基本氨基酸、等电点、甲醛滴定法、Edman 降解、一级结构、肽键、构型与构象、二面角、二级结构、超二级结构、结构域、三级结构、四级结构、亚基、别构蛋白、分子病、水化层、双电层、蛋白质的变性与复性、盐析与盐溶二. 氨基酸分类、基本氨基酸的结构、分类、名称、符号、化学反应、鉴定、蛋白质的水解三. 蛋白质的结构一级结构 结构特点、测定步骤、常用方

2、法、酶二级结构 四种 结构特点、数据、超二级结构三级结构 主要靠疏水键维护四级结构 变构现象结构与功能的适应、结构变化对功能的影响、典型蛋白质四. 蛋白质的性质分子量的测定方法、酸碱性、溶解性、变性、颜色反应第一节 蛋白质通论一、蛋白质的功能多样性蛋白质是原生质的主要成分，任何生物都含有蛋白质。 自然界中最小、 最简洁的生物是病毒， 它是由蛋白质和核酸组成的。没有蛋白质也就没有生命。自然界的生物多种多样，因而蛋白质的种类和功能也非常繁多。概括起来，蛋白质主要有以下功能：1. 催化功能 生物体内的酶都是由蛋白质构成的，它们有机体新陈代谢的催化剂。没有酶， 生物体内的各种化学反应就无法正常进行。例

3、如，没有淀粉酶，淀粉就不能被分解利用。2. 结构功能 蛋白质可以作为生物体的结构成分。 在高等动物里， 胶原是主要的细胞外结构蛋白，参与结缔组织和骨骼作为身体的支架，占蛋白总量的 1/4 。细胞里的片层结构，如细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网等都是由不溶性蛋白与脂类组成的。动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。3. 运输功能 脊椎动物红细胞中的血红蛋白和无脊椎动物体内的血蓝蛋白在呼吸过程中起着运输氧气的作用。血液中的载脂蛋白可运输脂肪，转铁蛋白可转运铁。一些脂溶性激素的运输也需要蛋白，如甲状腺素要与甲状腺素结合球蛋白结合才能在血液中运输。4. 贮存功能 某些蛋白质的作用是贮存氨基酸作为生物体的养料

4、和胚胎或幼儿生长发育的原料。此类蛋白质包括蛋类中的卵清蛋白、奶类中的酪蛋白和小麦种子中的麦醇溶蛋白等。肝脏中的铁蛋白可将血液中余外的铁储存起来，供缺铁时使用。5. 运动功能 肌肉中的肌球蛋白和肌动蛋白是运动系统的必要成分，它们构象的转变引起肌肉的收缩，带动机体运动。细菌中的鞭毛蛋白有类似的作用，它的收缩引起鞭毛的摇摆，从而使细菌在水中游动。6. 防备功能 高等动物的免疫反应是机体的一种防备机能，它主要也是通过蛋白质 抗体 来实现的。凝血与纤溶系统的蛋白因子、溶菌酶、干扰素等，也担负着防备和爱护功能。7. 调剂功能 某些激素、一切激素受体和很多其他调剂因子都是蛋白质。8. 信息传递功能生物体内的

5、信息传递过程也离不开蛋白质。例如，视觉信息的传递要有视紫红质参与，感受味道需要味觉蛋白。视杆细胞中的视紫红质，只需1 个光子即可被激发，产可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结生视觉。9. 遗传调控功能遗传信息的储存和表达都与蛋白质有关。DNA在储存时是缠绕在蛋白质组蛋白上的。有些蛋白质，如阻遏蛋白，与特定基因的表达有关。半乳糖苷酶基因的表达受到一种阻遏蛋白的抑制，当需要合成半乳糖苷酶时经过去阻遏作用才能表达。10. 其他功能 某些生物能合成有毒的蛋白质，用以攻击或防卫。如某些植物在被昆虫咬过以后会产生一种毒蛋白。白喉毒素可抑制生物蛋白质合成。二、蛋白质的分类一按分子外形分类1. 球

6、状蛋白 外形近似球体， 多溶于水， 大都具有活性， 如酶、 转运蛋白、 蛋白激素、 抗体等。球状蛋白的长度与直径之比一般小于10。2. 纤维状蛋白 外形瘦长，分子量大，大都是结构蛋白，如胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等。纤维蛋白按溶解性可分为可溶性纤维蛋白与不溶性纤维蛋白。前者如血液中的纤维蛋白原、 肌肉中的肌球蛋白等，后者如胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等结构蛋白。二按分子组成分类1. 简洁蛋白 完全由氨基酸组成， 不含非蛋白成分。 如血清清蛋白等。 依据溶解性的不同，可将简洁蛋白分为以下7 类：清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和硬蛋白。2. 结合蛋白 由蛋白质和非蛋白成分组成，后者

7、称为辅基。 依据辅基的不同， 可将结合蛋白分为以下 7 类：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白和金属蛋白。三、蛋白质的元素组成与分子量1. 元素组成 全部的蛋白质都含有碳氢氧氮四种元素，有些蛋白质仍含有硫、磷和一些金属元素。蛋白质平均含碳 50，氢 7，氧 23，氮 16。其中氮的含量较为恒定，而且在糖和脂类中不含氮，所以常通过测量样品中氮的含量来测定蛋白质含量。如常用的凯氏定氮：蛋白质含量蛋白氮 其中是 16的倒数。2. 蛋白质的分子量蛋白质的分子量变化范畴很大，从6000 到 100 万或更大。这个范畴是人为规定的。 一般将分子量小于6000 的称为肽。 不过这个界限不是

8、肯定的，如牛胰岛素分子量为 5700，一般仍认为是蛋白质。蛋白质煮沸凝固，而肽不凝固。较大的蛋白质如烟草花叶病毒，分子量达 4000 万。四、蛋白质的水解氨基酸是蛋白质的基本结构单位，这个发觉是从蛋白质的水解得到的。蛋白质的水解主要有三种方法：1. 酸水解 用 6MHCl或 4MH2SO，4 105回流 20 小时即可完全水解。酸水解不引起氨基酸的消旋，但色氨酸完全被破坏， 丝氨酸和苏氨酸部分破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解。如样品含有杂质， 在酸水解过程中常产生腐黑质，使水解液变黑。 用 3mol/L 对甲苯磺酸代替盐酸，得到色氨酸较多，可像丝氨酸和苏氨酸一样用外推法求其含量。2. 碱

9、水解 用 5MNaO，H 水解 10 20 小时可水解完全。碱水解使氨基酸消旋，很多氨基酸被破坏，但色氨酸不被破坏。常用于测定色氨酸含量。可加入淀粉以防止氧化。3. 酶水解 酶水解既不破坏氨基酸，也不引起消旋。 但酶水解时间长， 反应不完全。 一般用于部分水解，假设要完全水解，需要用多种酶协同作用。其次节 氨基酸一、氨基酸的结构与分类一基本氨基酸组成蛋白质的 20 种氨基酸称为基本氨基酸。 它们中除脯氨酸外都是- 氨基酸， 即在 - 碳原可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结子上有一个氨基。基本氨基酸都符合通式，都有单字母和三字母缩写符号。依据氨基酸的侧链结构，可分为三类：脂肪族氨基

10、酸、芳香族氨基酸和杂环氨基酸。1. 脂肪族氨基酸共 15 种。侧链只是烃链： Gly, Ala, Val, Leu, Ile后三种带有支链，人体不能合成，是必需氨基酸。侧链含有羟基： Ser,Thr 很多蛋白酶的活性中心含有丝氨酸，它仍在蛋白质与糖类及磷酸的结合中起重要作用。侧链含硫原子： Cys, Met 两个半胱氨酸可通过形成二硫键结合成一个胱氨酸。二硫键对维护蛋白质的高级结构有重要意义。半胱氨酸也常常显现在蛋白质的活性中心里。甲硫氨酸的硫 原子有时参与形成配位键。甲硫氨酸可作为通用甲基供体，参与多种分子的甲基化反应。侧链含有羧基： AspD, Glu E侧链含酰胺基： AsnN, Gln

11、 Q侧链显碱性： ArgR , Lys K2. 芳香族氨基酸包括苯丙氨酸 Phe,F 和酪氨酸 Tyr,Y两种。 酪氨酸是合成甲状腺素的原料。3. 杂环氨基酸 包括色氨酸 Trp,W 、组氨酸 His和脯氨酸 Pro 三种。其中的色氨酸与芳香族氨基酸都含苯环， 都有紫外吸取 280nm 。所以可通过测量蛋白质的紫外吸取来测定蛋白质的含量。组氨酸也是碱性氨基酸，但碱性较弱，在生理条件下是否带电与四周内环境有关。它在活性中心常起传递电荷的作用。组氨酸能与铁等金属离子配位。脯氨酸是唯独的仲氨基酸，是 - 螺旋的破坏者。B 是指 Asx，即 Asp 或 Asn。 Z 是指 Glx ，即 Glu 或 G

12、ln。基本氨基酸也可按侧链极性分类：非极性氨基酸： Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro共八种极性不带电荷： Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr共七种带正电荷： Arg, Lys, His带负电荷： Asp, Glu二不常见的蛋白质氨基酸某些蛋白质中含有一些不常见的氨基酸，它们是基本氨基酸在蛋白质合成以后经羟化、羧化、甲基化等修饰衍生而来的。也叫稀有氨基酸或特殊氨基酸。如4- 羟脯氨酸、 5- 羟赖氨酸、锁链素等。 其中羟脯氨酸和羟赖氨酸在胶原和弹性蛋白中含量较多。在甲状腺素中仍有3,5- 二碘酪氨酸。三非蛋白质氨基酸自然

13、界中仍有 150 多种不参与构成蛋白质的氨基酸。它们大多是基本氨基酸的衍生物，也有一些是 D-氨基酸或、 - 氨基酸。这些氨基酸中有些是重要的代谢物前体或中间产物，如瓜氨酸和鸟氨酸是合成精氨酸的中间产物， - 丙氨酸是遍多酸 泛酸， 辅酶 A 前体 的前体， - 氨基丁酸是传递神经冲动的化学介质。二、氨基酸的性质一物理性质 - 氨基酸都是白色晶体， 每种氨基酸都有特殊的结晶外形，可以用来鉴别各种氨基酸。除胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水中。脯氨酸和羟脯氨酸仍能溶于乙醇或乙醚中。除甘氨酸外， - 氨基酸都有旋光性，- 碳原子具有手性。苏氨酸和异亮氨酸有两个手性碳原子。从蛋白质水解得到的氨基酸都是L-

14、 型。但在生物体内特殊是细菌中，D-氨基酸也存在， 如细菌的细胞壁和某些抗菌素中都含有D-氨基酸。三个带苯环的氨基酸有紫外吸取，F:257nm, =200; Y:275nm, =1400; W:280nm, =5600。通常蛋白质的紫外吸取主要是后两个氨基酸打算的，一般在280nm。可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结氨基酸分子中既含有氨基又含有羧基，在水溶液中以偶极离子的形式存在。所以氨基酸晶体 是离子晶体，熔点在200以上。氨基酸是两性电解质，各个解离基的表观解离常数按其酸性强度递降的次序，分别以K1 、K2 来表示。当氨基酸分子所带的净电荷为零时的pH 称为氨基酸的等电点 p

15、I。等电点的值是它在等电点前后的两个pK 值的算术平均值。氨基酸完全质子化时可看作多元弱酸，各解离基团的表观解离常数按酸性减弱的次序，以pK1、pK2、pK3 表示。氨基酸可作为缓冲溶液，在pK 处的缓冲才能最强， pI 处的缓冲才能最弱。氨基酸的滴定曲线如图。二化学性质1. 氨基的反应1酰化氨基可与酰化试剂，如酰氯或酸酐在碱性溶液中反应，生成酰胺。该反应在多肽合成中可用于爱护氨基。2与亚硝酸作用氨基酸在室温下与亚硝酸反应，脱氨，生成羟基羧酸和氮气。由于伯胺都有这个反应，所以赖氨酸的侧链氨基也能反应，但速度较慢。常用于蛋白质的化学修饰、水解程度测定及氨基酸的定量。3与醛反应氨基酸的 - 氨基能

16、与醛类物质反应，生成西佛碱-C=N- 。西佛碱是氨基酸作为底物的某些酶促反应的中间物。 赖氨酸的侧链氨基也能反应。氨基仍可以与甲醛反应， 生成羟甲基化合物。由于氨基酸在溶液中以偶极离子形式存在，所以不能用酸碱滴定测定含量。与甲醛反应后，氨基酸不再是偶极离子，其滴定终点可用一般的酸碱指示剂指示，因而可以滴定，这叫甲醛滴定法，可用于测定氨基酸。4与异硫氰酸苯酯PITC 反应 - 氨基与 PITC 在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物PTC-AA，后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化， 生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物PTH-AA。这些衍生物是无色的， 可用层析法加以别离鉴定。 这个反应第一为Edma

17、n用来鉴定蛋白质的N- 末端氨基酸， 在蛋白质的氨基酸次序分析方面占有重要位置。5磺酰化氨基酸与 5- 二甲胺基 萘-1- 磺酰氯 DNS-Cl 反应，生成DNS-氨基酸。产物在酸性条件下6NHCl100 也不破坏，因此可用于氨基酸末端分析。DNS-氨基酸有强荧光，激发波长在360nm左右，比较灵敏，可用于微量分析。6与 DNFB反应氨基酸与 2,4- 二硝基氟苯 DNFB在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基氨基酸DNP氨基酸。这一反应是定量转变的，产物黄色，可经受酸性100高温。该反应曾被英国的Sanger 用来测定胰岛素的氨基酸次序，也叫桑格尔试剂，现在应用于蛋白质N- 末端测定。7转氨反应在

18、转氨酶的催化下，氨基酸可脱去氨基，变成相应的酮酸。2. 羧基的反应羧基可与碱作用生成盐，其中重金属盐不溶于水。羧基可与醇生成酯，此反应常用于多肽合成中的羧基爱护。某些酯有活化作用，可增加羧基活性，如对硝基苯酯。将氨基爱护以后， 可与二氯亚砜或五氯化磷作用生成酰氯，在多肽合成中用于活化羧基。在脱羧酶的催化下， 可脱去羧基，形成伯胺。3 茚三酮反应可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结氨基酸与茚三酮在微酸性溶液中加热，最终生成蓝色物质。而脯氨酸生成黄色化合物。依据这个反应可通过二氧化碳测定氨基酸含量。4. 侧链的反应丝氨酸、苏氨酸含羟基，能形成酯或苷。半胱氨酸侧链巯基反应性高：1二硫键

19、disulfide bond半胱氨酸在碱性溶液中简洁被氧化形成二硫键，生成胱氨酸。胱氨酸中的二硫键在形成蛋白质的构象上起很大的作用。氧化剂和复原剂都可以打开二硫键。在讨论蛋白质结构时，氧化剂过甲酸可以定量的拆开二硫键，生成相应的磺酸。复原剂如巯基乙醇、巯基乙酸也能拆开二硫键，生成相应的巯基化合物。由于半胱氨酸中的巯基很不稳固，极易氧化，因此利用复原剂拆开二硫键时，往往进一步用碘乙酰胺、氯化苄、N-乙基丁烯二亚酰胺和对氯汞苯甲酸等试剂与巯基作用，把它爱护起来，防止它重新氧化。2烷化半胱氨酸可与烷基试剂，如碘乙酸、碘乙酰胺等发生烷化反应。半胱氨酸与丫丙啶反应，生成带正电的侧链，称为S- 氨乙基半胱

20、氨酸AECys。3与重金属反应极微量的某些重金属离子，如Ag+、Hg2+，就能与巯基反应，生成硫醇盐，导致含巯基的酶失活。5. 以下反应常用于氨基酸的检验：l酪氨酸、组氨酸能与重氮化合物反应Pauly反应 ，可用于定性、定量测定。组氨酸生成棕红色的化合物，酪氨酸为桔黄色。l精氨酸在氢氧化钠中与1- 萘酚和次溴酸钠反应，生成深红色，称为坂口反应。用于胍基的鉴定。l酪氨酸与硝酸、亚硝酸、硝酸汞和亚硝酸汞反应，生成白色沉淀，加热后变红，称为米伦反应，是鉴定酚基的特性反应。l色氨酸中加入乙醛酸后再缓慢加入浓硫酸，在界面会显现紫色环，用于鉴定吲哚基。在蛋白质中，有些侧链基团被包裹在蛋白质内部，因而反应很

21、慢甚至不反应。三、色谱与氨基酸的分析别离1. 色谱 chromatography 的进展史最早的层析试验是俄国植物学家在1903 年用碳酸钙别离叶绿素， 属于吸附层析。 40 岁月显现了安排层析，50 岁月显现了气相色谱，60 岁月显现 HPLC， 80 岁月显现了超临界层 析， 90 岁月显现的超微量HPLC可别离 ng 级的样品。2. 色谱的分类：按流淌相可分为气相、液相、超临界色谱等。 按介质可分为纸层析、薄层层析、柱层析等。按别离机制可分为吸附层析、安排层析、分子筛层析等3. 色谱的应用可用于别离、制备、纯度鉴定等。定性可通过保留值、内标、标准曲线等方法，定量一般用标准曲线法。氨基酸的

22、分析别离是测定蛋白质结构的基础。在安排层析和离子交换层析法开头应用于氨基酸成分分析之后，蛋白质结构的讨论才取得了显著的成就。现在这些方法已自动化。氨基酸从强酸型离子交换柱的洗脱次序如下：Asp,Thr,Ser,Glu,Pro,Gly,Ala,Cys,Val,Met,Ile,Leu,Tyr,Phe,Lys,His,NH3,Arg第三节蛋白质的一级结构可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结蛋白质是生物大分子， 具有明显的结构层次性， 由低层到高层可分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。一、肽键和肽一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩水形成的共价键，称为肽键。在蛋白质分子中， 氨基

23、酸借肽键连接起来，形成肽链。最简洁的肽由两个氨基酸组成，称为二肽。含有三、四、五个氨基酸的肽分别称为三肽、四肽、五肽等。肽链中的氨基酸由于形成肽键时脱水，已不是完整的氨基酸，所以称为残基。肽的命名是依据组成肽的氨基酸残基来确定的。一般从肽的氨基端开头，称为某氨基酰某氨基酰 . 某氨基酸。肽的书写也是从氨基端开头。肽键象酰胺键一样， 由于键内原子处于共振状态而表现出较高的稳固性。在肽键中 C N 单键具有约 40双键性质， 而 C=O双键具有 40单键性质。 这样就产生两个重要结果： 1肽键的亚氨基在 pH 0-14 的范畴内没有明显的解离和质子化的倾向。2肽键中的 C N单键不能自由旋转，使蛋

24、白质能折叠成各种三维构象。除了蛋白质部分水解可以产生各种简洁的多肽以外，自然界中仍有长短不等的小肽，它们具有特殊的生理功能。动植物细胞中含有一种三肽，称为谷胱甘肽，即- 谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。因其含有巯基， 故常以 GSH来表示。它在体内的氧化复原过程中起重要作用。脑啡肽是自然止痛剂。肌肉中的鹅肌肽是一个二肽， 即 - 丙氨酰组氨酸。 肌肽可作为肌肉中的缓冲剂，缓冲肌肉产生的乳酸对 pH的影响。 一种抗菌素叫做短杆菌酪肽，由 12 种氨基酸组成， 其中有几种是D-氨基酸。这些自然肽中的非蛋白质氨基酸可以使其免遭蛋白酶水解。很多激素也是多肽，如催产素、加压素、舒缓激肽等。二、肽的理化性质小肽的理

25、化性质与氨基酸类似。很多小肽已经结晶。晶体的熔点很高，说明是离子晶体，在水溶液中以偶极离子存在。肽键的亚氨基不解离，所以肽的酸碱性取决于肽的末端氨基、羧基和侧链上的基团。 在长肽或蛋白质中， 可解离的基团主要是侧链上的。肽中末端羧基的 pK比自由氨基酸的稍大，而末端氨基的pK 就稍小。侧链基团变化不大。肽的滴定曲线和氨基酸的很相像。肽的等电点也可以依据它的pK 值确定。一般小肽的旋光度等于各个氨基酸旋光度的总和，但较大的肽或蛋白质的旋光度不等于其组成氨基酸的旋光度的简洁加和。肽的化学性质和氨基酸一样，但有一些特殊的反应，如双缩脲反应。一般含有两个或两个以 上肽键的化合物都能与CuSO4碱性溶液

26、发生双缩脲反应而生成紫红色或蓝紫色的复合物。利用这个反应可以测定蛋白质的含量。三、一级结构的测定一一级结构蛋白质的一级结构是指肽链的氨基酸组成及其排列次序。氨基酸序列是蛋白质分子结构的基础，它打算蛋白质的高级结构。一级结构可用氨基酸的三字母符号或单字母符号表示，从N-末端向 C-末端书写。采纳三字母符号时，氨基酸之间用连字符隔开。二测定步骤测定蛋白质的一级结构，要求样品必需是均一的纯度大于97而且是已知分子量的蛋白质。一般的测定步骤是：1. 通过末端分析确定蛋白质分子由几条肽链构成。2. 将每条肽链分开，并别离提纯。可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结3. 肽链的一部分样品进行完全

27、水解，测定其氨基酸组成和比例。4. 肽链的另一部分样品进行N 末端和 C 末端的鉴定。5. 拆开肽链内部的二硫键。6. 肽链用酶促或化学的部分水解方法降解成一套大小不等的肽段，并将各个肽段别离出来。7. 测定每个肽段的氨基酸次序。8. 从其次步得到的肽链样品再用另一种部分水解方法水解成另一套肽段，其断裂点与第五步不同。别离肽段并测序。比较两套肽段的氨基酸次序，依据其重叠部分拼凑出整个肽链的氨基酸次序。9. 测定原先的多肽链中二硫键和酰胺基的位置。三常用方法1. 末端分析1N 末端蛋白质的末端氨基与2,4- 二硝基氟苯 DNFB在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白质DNP-蛋白质。产物黄色， 可

28、经受酸性 100高温。 水解时， 肽链断开， 但 DNP基并不脱落。DNP-氨基酸能溶于有机溶剂如乙醚中，这样可与其他氨基酸和-DNP 赖氨酸分开。再经双向滤纸层析或柱层析，可以鉴定黄色的DNP氨基酸。丹磺酰氯法是更灵敏的方法。蛋白质的末端氨基与5- 二甲胺基 萘-1- 磺酰氯 DNS-Cl 反应， 生成 DNS-蛋白质。 DNS-氨基酸有强荧光，激发波长在360nm左右，比 DNFB法灵敏 100 倍。目前应用最广泛的是异硫氰酸苯酯PITC 法。末端氨基与 PITC 在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上掉下来。

29、产物可用气 - 液色谱法进行鉴定。 这个方法最大的优点是剩下的肽链仍是 完整的， 可依照此法重复测定新生的N 末端氨基酸。 现在已经有全自动的氨基酸次序分析仪， 可测定含 20 个以上氨基酸的肽段的氨基酸次序。缺点是不如丹磺酰氯灵敏， 可与之结合使用。N 末端氨基酸也可用酶学方法即氨肽酶法测定。2C 末端a) C 末端氨基酸可用硼氢化锂复原生成相应的氨基醇。肽链水解后，再用层析法鉴定。有断裂干扰。b) 另一个方法是肼解法。多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂全部的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼解下来的C 末端氨基酸可用纸层析鉴定。精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬

30、酰胺和谷氨酰胺被破坏。c) 也可用羧肽酶法鉴定。将蛋白质在pH 8.0, 30与羧肽酶一起保温，按肯定时间间隔取 样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，依据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C末端氨基酸的排列次序。羧肽酶A 水解除精氨酸、赖氨酸和脯氨酸外全部肽键，羧肽酶B水解精氨酸和赖氨酸。2. 二硫键的拆开和肽链的别离一般情形下，蛋白质分子中肽链的数目应等于N 末端氨基酸残基的数目，可依据末端分析来确定一种蛋白质由几条肽链构成。必需设法把这些肽链别离开来，然后测定每条肽链的氨基酸次序。假如这些肽链之间不是共价交联的，可用酸、碱、高浓度的盐或其他变性剂处理蛋白质，把肽链分开。假如肽链之间以二硫键交

31、联，或肽链中含有链内二硫键，就必需用氧化或复原的方法将二硫键拆开。最普遍的方法是用过量的巯基乙醇处理，然后用碘乙酸爱护生成的半胱氨酸的巯基，防止重新氧化。二硫键拆开后形成的个别肽链，可用纸层析、离子交换柱层析、电泳等方法进行别离。3. 肽链的完全水解和氨基酸组成的测定。在测定氨基酸次序之前，需要知道多肽链的氨基酸组成和比例。一般用酸水解，得到氨基酸可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结混合物，再别离测定氨基酸。目前用氨基酸自动分析仪，2 4 小时即可完成。蛋白质的氨基酸组成，一般用每分子蛋白质中所含的氨基酸分子数表示。不同种类的蛋白质， 其氨基酸组成相差很大。4. 肽链的部分水解和肽

32、段的别离当肽链的氨基酸组成及N末端和 C末端已知后，随后的步骤是肽链的部分水解。这是测序工作的关键步骤。这一步通常用专一性很强的蛋白酶来完成。最常用的是胰蛋白酶trypsin，它特的水解赖氨酸和精氨酸的羧基形成的肽键，所以生成的肽段之一的 C末端是赖氨酸或精氨酸。用丫丙啶处理， 可增加酶切位点 半胱氨酸 。用马来酸酐顺丁烯二酸酐爱护赖氨酸的侧链氨基，或用1,2- 环己二酮修饰精氨酸的胍基，可削减酶切位点。常常使用的仍有糜蛋白酶，水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水残基的羧基形成的肽键。其他疏水残基反应较慢。用溴化氰处理，可断裂甲硫氨酸的羧基形成的肽键。水解后甲硫氨酸残基转变为C末端高丝氨酸残基。

33、以上三种方法常常使用。胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。前者水解疏水残基之间的肽键，后者水解疏水残基的氨基形成的肽键。金葡菌蛋白酶，又称谷氨酸蛋白酶或V8 蛋白酶，水解谷氨酸和天冬氨酸的羧基形成的肽键， 但受缓冲液影响。在醋酸缓冲液中只水解谷氨酸，在磷酸缓冲液中仍可水解天冬氨酸。梭状芽孢杆菌蛋白酶，水解精氨酸羧基形成的肽键，又称精氨酸蛋白酶。耐变性剂，可经受6M尿素 2 小时。可用于水解不易溶解的蛋白。凝血酶，水解 Arg-Gly肽键。羟胺可水解 Asn-Gly ，但 Asn-Leu 和 Asn-Ala也能部分裂解。以上方法中，酶不能水解脯氨酸参与形成的肽键。多肽部分水解后，降解成长短不一的小肽段，可用

34、层析或电泳加以别离提纯。常常用双向层析或电泳别离，再用茚三酮显色，所得的图谱称为肽指纹谱。5. 多肽链中氨基酸次序的测定从多肽链中部分水解得到的肽段可用化学法或酶法测序，然后比较用不同方法获得的两套肽段的氨基酸次序，依据它们彼此重叠的部分，确定每个肽段的适当位置，拼凑出整个多肽链的氨基酸次序。6. 二硫键位置的确定一般用蛋白酶水解带有二硫键的蛋白质，从部分水解产物中别离出含二硫键的肽段，再拆开二硫键，将两个肽段分别测序，再与整个多肽链比较，即可确定二硫键的位置。常用胃蛋白酶，因其专一性低，生成的肽段小，简洁别离和鉴定，而且可在酸性条件下作用pH2，此时二硫键稳固。 肽段的别离可用对角线电泳，将

35、混合物点到滤纸的中心，在进行第一次电泳， 然后用过甲酸蒸汽断裂二硫键，使含二硫键的肽段变成一对含半胱氨磺酸的肽段。将滤纸旋转 90 度后在相同条件下进行其次次电泳，多数肽段迁移率不变， 处于对角线上， 而含半胱氨磺酸的肽段因负电荷增加而偏离对角线。用茚三酮显色，别离，测序，与多肽链比较，即可确定二硫键位置。四、多肽合成多肽的人工合成有两种类型，一种是由不同氨基酸依据肯定次序排列的掌握合成，另一种是由一种或两种氨基酸聚合或共聚合。掌握合成的一个困难是进行接肽反应所需的试剂，能同时和其他官能团反应。因此在接肽以前必需第一将这些基团加以封闭或爱护，肽键形成后再除去爱护基。这样每连接一个氨基酸残基都要

36、经过几个步骤，要得到较长的肽链就必需每步都有较高的产率。假如每一步反应产率都是 90%，那么 30 次反应后总产率只有 4.24%。可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结爱护基必需在接肽时起爱护作用，在接肽后简洁除去，又不引起肽键断裂。最常用的氨基爱护基 Y是苄氧甲酰基，可用催化加氢或用金属钠在液氨中处理除去。其他仍有三苯甲基、叔丁氧甲酰基等，可用稀盐酸或乙酸在室温下除去。羧基爱护基 Z 通常用烷基，如乙基，可在室温下皂化除去。如用苄基，可用催化加氢除去。肽键不能自发形成，常用缩合剂促进肽键形成。接肽用的缩合剂最有效的是 N,N- 二环己基碳二亚胺 DC CI 。DCCI 从两个氨基

37、酸分子中夺取一分子水， 自身变为不溶的 N,N- 二环己基脲，从反应液中沉淀出来，可过滤除去。接肽反应除用缩合剂以外，仍可用分别活化参与形成肽键的羧基和氨基的方法。羧基活化可用叠氮化物法和活化酯法对硝基苯酯等。氨基活化一般不需特殊手段，通常在接肽时加入有机碱，如三乙胺，保证氨基在自由状态即可。近年来固相多肽合成快速进展。在固相合成中，肽链的逐步延长是在不溶的聚苯乙烯树脂小圆珠上进行的。合成多肽的羧基端先和氯甲基聚苯乙烯树脂反应，形成苄酯。其次个氨基酸的氨基用叔丁氧甲酰基爱护后， 以 DCCI 为缩合剂， 接在第一个氨基酸的氨基上。 重复这个方法，可使肽链按肯定次序延长。最终把树脂悬浮在无水三氟

38、乙酸中，通入干燥 HBr，使多肽与树脂别离， 同时除去爱护基。 整个合成过程现在已经可以在自动化固相多肽合成仪上进行。平均合成每个肽键只需三小时。 此法可用于医药工业。 人工合成的催产素没有混杂的加压素，比提取的自然药品好。已经胜利合成含 124 个残基的蛋白。第四节 蛋白质的高级结构蛋白质的多肽链并不是线形舒展的，而是按肯定方式折叠盘绕成特有的空间结构。蛋白质的三维构象， 也称空间结构或高级结构， 是指蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列、分布及肽链的走向。高级结构是蛋白质表现其生物功能或活性所必需的，包括二级、三级和四级结构。 Primary structure, secondary,

39、 tertiary, quaternary structure一、有关概念1. 构型 configration 与构象 conformation构型指立体异构体中取代原子或基团在空间的取向，构型的转变必需通过共价键的断裂。构象是指这些取代基团当单键旋转时可能形成的不同的立体结构，构象的转变不涉及共价键的转变。2. 二面角由于肽键不能自由旋转，所以肽键的四个原子和与之相连的两个碳原子共处一个平面，称肽平面。 肽平面内的 C=O与 N H呈反式排列， 各原子间的键长和键角都是固定的。肽链可看作由一系列刚性的肽平面通过碳原子连接起来的长链，主链的构象就是由肽平面之间的角度打算的。主链上只有碳原子连接

40、的两个键是单键，可自由旋转。绕C N1 旋转的角称，而绕 C C2 旋转的角称。这两个角称为二面角。规定当旋转键两侧的肽链成顺式时为 0 度。取值范畴是正负180 度，当二面角都是180 度时肽链完全舒展。由于空间位阻，实际的取值范畴是很有限的。二、二级结构一二级结构是肽链的空间走向蛋白质的二级结构是指肽链主链的空间走向折叠和盘绕方式 ，是有规章重复的构象。 肽链主链具有重复结构，其中氨基是氢键供体，羰基是氢键受体。通过形成链内或链间氢键可以使肽链卷曲折叠形成各种二级结构单元。复杂的蛋白质分子结构，就由这些比较简洁的二级结构单元进一步组合而成。二肽链卷曲折叠形成四种二级结构单元1. 螺旋 -h

41、elix螺旋模型是Pauling和 Corey 等讨论 - 角蛋白时于 1951 年提出的。角蛋白是动物的不溶性纤维状蛋白，是由动物的表皮衍生而来的。它包括皮肤的表皮以及毛发、鳞、羽、甲、蹄、角、丝等。角蛋白可分为两类，一类是角蛋白，胱氨酸含量丰富，可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结如角、甲、蹄的蛋白胱氨酸含量高达22。另一类是角蛋白，不含胱氨酸，但甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的含量很高，蚕丝丝心蛋白就属于这一类。角蛋白，如头发，暴露于湿热环境中几乎可以伸长一倍，冷却干燥后又收缩到原先长度。角蛋白就无此变化。 角蛋白的 X 射线衍射图案极其相像，沿长轴方向都有一个大周期结构或重复单位，

42、其长度为 5埃。Pauling等考虑到肽平面对多肽链构象的限制作用，设计了多肽链折叠的各种可能模型，发觉其中一种螺旋模型能很好的说明角蛋白的X 射线衍射图案中的5埃重复单位。在这个模型中，每隔个氨基酸残基螺旋上升一圈，相当于向上平移埃。螺旋的直径是11埃。螺旋上升时，每个氨基酸残基沿轴旋转100，向上平移埃，比完全舒展的构象压缩倍。这与衍射图案中的小周期完全一样。其二面角 =-57 度，=-48 度。在螺旋中氨基酸残基的侧链伸向外侧，相邻的螺圈之间形成链内氢键，氢键的取向几乎与中心轴平行。氢键是由肽键中氮原子上的氢与其N 端第四个羰基上的氧之间形成的。螺旋的结构答应全部的肽键都参与链内氢键的形

43、成，因此相当稳固。 - 螺旋由氢键构成一个封闭环， 其中包括三个残基， 共 13 个原子，称为 n=3螺旋。由 L 型氨基酸构成的多肽链可以卷曲成右手螺旋，也可卷曲成左手螺旋，但右手螺旋比较稳固。由于在左手螺旋中碳与羰基过于接近，不稳固。在自然蛋白质中，几乎全部螺旋都是右手螺旋。只在嗜热菌蛋白酶中发觉一圈左手螺旋。在角蛋白中，3 或 7 个螺旋可以相互拧在一起，形成三股或七股的螺旋索，彼此以二硫键交联在一起。螺旋不仅是角蛋白的主要构象，在其他纤维蛋白和球状蛋白中也广泛存在，是一种常见的二级结构。螺旋是一种不对称的分子结构，具有旋光才能。螺旋的比旋不等于其中氨基酸比旋的简洁加和，由于它的旋光性是

44、各个氨基酸的不对称因素和构象本身不对称因素的总反映。自然螺旋的不对称因素引起偏振面对右旋转。利用螺旋的旋光性，可以测定它的相对含量。一条肽链能否形成螺旋，以及螺旋的稳固性怎样，与其一级结构有极大关系。脯氨酸由于其亚氨基少一个氢原子，无法形成氢键，而且C N键不能旋转，所以是螺旋的破坏者， 肽链中显现脯氨酸就中断螺旋，形成一个 结节 。此外，侧链带电荷及侧链基团过大的氨基酸不易形成螺旋，甘氨酸由于侧链太小，构象不稳固，也是螺旋的破坏者。依据各种残基的特性，可以猜测蛋白质的二级结构。目前常见的猜测方法有Chou-Fasman 法、GOR法、 Lim 法等，都是依据统计信息进行猜测的。假如二级结构的

45、猜测胜利率大于80， 就可以用来猜测高级结构，但目前只能到达70左右。 Chou-Fasman 法比较直观，与二级结构形成的实际过程接近，但胜利率不高。Chou-Fasman 法依据各个氨基酸在一些已知结构的蛋白质中的表现，按构象参数P 表示形成螺旋的才能 由大到小将他们分为六组，依次为：最强的形成者 H ： Glu、Met、Ala 、 Leu中等的形成者 h ： Lys 、Phe、Gln、 Trp 、Ile 、Val很弱的形成者 I ： Asp、His中立者 i ： Cys、Ser 、Thr 、Arg较弱的破坏者 b ： Asn、Tyr最强的破坏者 B ： Gly 、Pro如肽链中 6 个连续的残基中有4 个 h即可形成核心，然后向两侧延长，遇到四肽破坏者时中止。形成螺旋时有协同性，即一旦形成核心，其它残基就简洁加入。2. - 折叠 -pleatedsheet - 折叠也叫 - 片层，在 - 角蛋白如蚕丝丝心蛋白中含量丰富。 其 X 射线衍射图案与- 角蛋白拉伸后的图案很相像。在此结构中， 肽链较为舒展， 假设干条肽链或一条肽链的假设干肽段平行排列，相邻主链骨架之间靠氢键维系。氢键与链的长轴接近垂直。为形成最多的氢键，防止相邻侧链间的空间障碍，锯齿状的主链骨架必需作肯定的折叠 = 139 , = 135 ，以形成一个折叠的片层。 侧链交替位于片层的上方和可编辑资料