海岛棉GbMFT2基因在烟草中的遗传转化.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流海岛棉GbMFT2基因在烟草中的遗传转化.精品文档.石河子大学本科毕业论文海岛棉GbMFT2基因在烟草中的遗传转化学 院： 生命科学学院 专 业： 生 物 技 术 班 级： 生技2010级2班 学 号： 2010506048 学生姓名： 王 芳 指导教师： 黄 先 忠 中国新疆石河子二一四年六月海岛棉GbMFT2基因在烟草中的遗传转化学生：王芳 指导老师：黄先忠摘要：已经证明，被子植物共享一个保守的磷脂酰乙醇胺结合（PEBP）结构域来调控开花时间。PEBP家族包括FT-like，TFL1-like和MFT-like三个亚家族，进化分析表明MO

2、THER OF FT AND TFL1 (MFT)是所有PEBP基因的祖先10。蛋白质序列比对发现GbMFT2蛋白的羧基端含有MFT蛋白都含有的脯氨酸，系统进化树分析表明GbMFT2编码产物与拟南芥AtMFT蛋白亲缘关系较近，他们属于同一分支。用不同浓度的ABA处理棉花种子后GbMFT2基因表达变化明显，表明GbMFT2基因的表达受ABA的调节。为了进一步研究该基因的功能，将过量表达载体p35S:GbMFT2叶盘法转化烟草，获得了7株T1代GbMFT2转基因烟草。种植T2代转基因烟草，发现转基因植株的开花时间均晚于非转基因植株。并用不同浓度NaCl胁迫处理T2代转GbMFT2基因烟草幼苗，发现

3、转基因烟草的耐盐性明显高于野生型烟草。进一步分析GbMFT2基因的功能，以便可以利用该基因调节作物的开花时间及耐盐性。关键词：PEBP家族；GbMFT2基因；叶盘法；晚花；耐盐Genetic Transformation of Gossypium barbadense GbMFT2 in tobaccoAbstract:Angiosperm sharing a conserved phosphatidylethanolamine-bindi-ng (PEBP) domain have been shown to be involved in the control of flowering t

4、ime.The family is divided into three subfamilies, FT-like, TFL1-like and MFT-like. Evolution analysis showed that MOTHER OF FT AND TFL1 (MFT) is the ancestral form of all PEBP genes in plant, GbMFT2 gene has a PEBP conserved motif. In consistency with almost all MFT-like proteins, GbMFT2 has a conse

5、rved proline residue near the C-terminussimilarities similar with AtMFT and they all belong to the same clade. Exogenous abscisic acid (ABA) of different concentrations resulted in significant change in GbMFT2 expression in germinating seeds, indicating that the expression of this gene is regulated

6、by ABA. To further study the function of the gene, I transformed the over-expression vector of p35S:GbMFT2 into tobacco. 7 p35S:GbMFT2 transformed tobacco plants were acquired. Analysis showed that the p35S:GbMFT2 transformed tobacco showed latter flower phenotype than non-transgenic wild type plant

7、s. Besides, through salt tolerance analysis I found that the p35S:GbMFT2 transformed tobacco showed stronger salt tolerance than non-transgenic wild type plants. So in the further we can use the GbMFT2 gene for regulating the time of the flowers and the salt tolerance of the crops.Key word:PEBP fami

8、ly;GbMFT2 gene;salt tolerangce;late flowering前 言 金鱼草CENTRORADIALIS(CEN）基因的突变造成正常的无限花序被破坏，茎端形成顶花，克隆研究表明CEN蛋白与动物的磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding proteins，PEBP)很相似1。利用CEN基因作为异源探针从拟南芥中克隆了一个同源基因TERMINAL FLOWER 1 (TFL1)，tfl1突变体开花提早，顶端分生组织由无限生长变成有限生长，表明TFL1具有维持顶端分生组织无限生长的能力2。FLOWERING LOCUS T（F

9、T）是拟南芥中的一个开花位点的控制基因，FT和TFL1氨基酸序列相似性为71%，二者同属PEBP基因家族3。FT和TFL1蛋白晶体结构分析表明二者高度相似，形成一个包含阴离子结合位点的口袋，口袋入口处的关键氨基酸对于FT和TFL1功能的转变起着重要作用4。TFL1的His88/Asp144在结合口袋的入口处形成氢键，而FT的Tyr85/Gln140不能形成氢键，这在决定蛋白的特定功能上起着关键作用，把这个口袋里的单个氨基酸改变，就可以使FT变成TFL1，相反也是这样5。拟南芥基因组的PEBP基因家族还包括Arabidopsis thaliana CENTRORADIALIS(ATC)、BROT

10、HER OF FT AND TFL1 (BFT)、MOTHER OF FT AND TFL 1 (MFT) 和TWINSISTER OF FT (TSF)6。系统进化研究表明，PEBP家族基因主要分为MFT-like，FT-like和TFL1-like3个亚家族，该基因家族成员起着开花促进因子或开花抑制因子的作用。 FT是一个开花促进因子，它整合来自不同途径的信号从而控制开花，已经证明FT蛋白是一个从叶片到顶端分生组织的长距离运输信号，是拟南芥的成花素11。水稻中的HEADING DATE 3a (Hd3a)是拟南芥FT的同源基因，Hd3a蛋白即水稻中的成花激素7，Hd3a基因在叶片中表达并通

11、过微管组织运输到顶端分生组织，同成花素受体14-3-3蛋白结合，然后又附着到另一种转录因子OsFD1上形成成花素激活复合体，使开花基因OsMADS15功能活跃起来8。近年来研究发现，除了对开花的控制功能外，FT-like和TFL1-like还涉及到很多不同功能，如马铃薯块茎的形成、茎的伸长、杨树芽的休眠、顶端分生组织生长前的衰减9等。相对于FT-like和TFL1-like基因，MFT-like 基因的研究仍然很有限。进化分析认为MFT是植物PEBP家族基因的祖先10。MFT基因也具有促进开花的作用，但失去功能的mft突变体在正常生长条件下没有明显的表型9。ABA和GA是种子适应外界环境的生物

12、和非生物胁迫调节种子发芽的2个重要的拮抗激素，近年来的研究表明，MFT参与了ABA和GA信号通道在种子发芽过程中起着重要的调节作用11。拟南芥MFT在种子萌发过程中的胚根和下胚轴的转变区特异表达，MFT的转录分别受到ABA信号通道中的2个关键的转录因子ABA-INSENSITIVE3(ABI3)和ABI5的调节，并且DELLA蛋白RGA-LIKE2 (RGL2)可以明显地促进MFT的转录。Hedman等10研究发现被子植物MFT-like含有两个亚家族：A亚家族和B亚家族，A亚家族在双子叶植物和单子叶禾本科植物都存在，B亚家族仅在双子叶植物中存在，在MFT-like基因的进化过程中其中一类MF

13、T-like基因发生了丢失，而A亚家族基因一般羧基末端都含有保守的脯氨酸残基Pro，B亚家族基因一般都含有保守的谷氨酸残基Glu。棉花是重要的经济作物，开花早晚和产量、品质性状之间存在显著相关，并且影响霜前皮棉产量、纤维长度等。相对于拟南芥和水稻等植物，棉花的PEBP基因家族的功能研究报道较少。东锐等12从陆地棉中克隆了一个FT-like基因GhFTL1，该基因具有FT-like基因的结构，且在拟南芥中过量表达，长日照下明显的促进早花。顾超等13从棉花中克隆得到了一个MFT类似基因并命名为GbMFT1，用不同浓度的ABA处理棉花种子发现GbMFT1基因的表达不受ABA的调节。本研究从海岛棉中克

14、隆得到了一个MFT类似基因并命名为GbMFT2，对棉花种子用不同浓度ABA胁迫，分析GbMFT2的表达情况，发现GbMFT1基因的表达受ABA的调节，此外，将过表达载体p35S:GbMFT2叶盘法转入烟草，统计转基因烟草与野生型烟草的开花时间，并且进一步探索该基因的功能，对T2代转基因烟草进行盐胁迫处理，对其耐盐性进行分析，为进一步完善棉花PEBP基因家族的功能奠定了基础。1材料与方法1.1实验材料1.1.1 植物材料普通烟草（Nicotiana tabacum）为本实验室保存。1.1.2 菌种、载体及试剂含有重组质粒p35S:GbMFT2的甘油农杆菌为本实验室保存；Tris Base、EDT

15、A、CTAB等生化试剂，均购自上海生工生物工程有限公司；10Ex Taq Buffer、2.5 mmol/L dNTP Mixture、rTaq酶、5 Prime Script Buffer、RNase Inhibitor、PrimeScript Transcriptase均购自TaKaRa公司；Trizol试剂盒购自invitrogen公司；DNA分子量Marker购自东盛公司;所用引物均由北京华大基因有限公司合成。1.1.3 培养基LB固体/液体培养基：胰蛋白胨（Tryptone） 10 g/L；酵母提取物（Yeast extract）：5 g/L；氯化钠（NaCl）10 g/L，若配制L

16、B固体培养基需加入15 g/L琼脂粉（Agar A）。若配制LB（Kan+Rif）双抗培养基，则需加入经过过滤灭菌的卡那霉素（Kan）和利福平（Rif）母液，使其工作浓度分别为50 mg/L、25 mg/L。1/2MS培养基：蔗糖（Sucrose） 30.0 g/L；MS（Murashige & Skoog Medium） 2.2 g/L；MES 0.5 g/L；琼脂（Agar A） 8.0 g/L。MS培养基：蔗糖（Sucrose） 30.0 g/L；MS（Murashige & Skoog Medium） 4.4 g/L；MES 0.5 g/L；琼脂（Agar A） 8.0 g/L。烟草培

17、养基：基本培养基MS（Murashige 和Skoog 1962），附加不同浓度的植物激素和抗生素，蔗糖含量为3%，琼脂粉含量为0.8%，pH 5.8。具体如表1：表1 植物培养基一览表（mg/L）培养基类型编号6-BANAACarbIAA预培养培养基MS12.01.0选择分化培养基MS22.00.1300选择生根培养基MS32.00.13000.11.1.4 实验引物表2 引物序列及名称引物名称引物序列（53）GbMFT2-FGGGGTACCATGGCTGCCTCCGTTGATCCTCTCGGbMFT2-RCGGGATCCTCAACGCCTTCGGCTGACGGGCTCTGbMFT2-RTF

18、CTTTGGTGATGACTGACCCTGATGCGbMFT2-RTRGTTGGAACAGCACCAGTATGTAGCGUBQ7FAGAGGTCGAGTCTTCGGACAUBQ7RGCTTGATCTTCTTGGGCTTG1.2 实验方法1.2.1 MFT蛋白序列的比对及分析登录NCBI网站，通过blastp (http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对获得其他物种的MFT蛋白序列；使用Meg-Align软件，选择Clustal W方法进行比对分析，并保存为.msf格式文件，再用GeneDoc软件进一步分析处理。1.2.2 MFT家族蛋白系统进化树的构建用MEGA 5.10

19、软件构建系统进化树14。蛋白序列比对利用Clustal W程序进行，进化树利用Neighbor-Joining方法构建，其中进行1000次Bootstrap分析以使得分枝的结果更可靠。1.2.3 GbMFT2蛋白三维结构的预测用同源模建法构建GbMFT2蛋白质三维结构14，提交GbMFT2基因所编码的蛋白序列到SWISS-MODEL服务器（http:/swissmodel.expasy.org/）进行自动建模（Automated Mode），即可得到其同源三维结构，下载其.pdb格式文件，并用Swiss-PdbViewer 4.1.0软件进行进一步的构建和分析GbMFT2蛋白质的三维结构以及氢

20、键。1.2.4 p35S:GbMFT2在烟草中的遗传转化1.2.4.1 烟草种子的处理及萌发70 %酒精消毒2 min，再加入20 % NaClO消毒7 min，水洗3次，最后一次留少量水，用移液器吸出，均匀点种在含有1/2 MS培养基的平板上，至于暗培养箱中黑暗培养2天，再放入25 光照培养箱培养，两个星期后将无菌烟草幼苗的转接到1/2 MS培养基上，放入25 组培室光照培养30天。1.2.4.2 叶盘法转化烟草（1） 将保存的含有重组质粒p35S:GbMFT2的甘油农杆菌涂板：取约10 L均匀涂布于含有Kan和Rif的双抗LB固体培养基上，28 恒温箱培养48 h，直至长出单菌落。（2）农

21、杆菌的活化：从平板上挑取单菌落，接种到40 ml含有Kan和Rif的双抗LB液体培养基上，置于28 ，200 rpm摇床上，培养至OD600为0.6-0.8。（3）活化的农杆菌侵染烟草：将培养好的农杆菌菌液转入10 ml离心管中，4 ，4000 rpm离心5 min收集菌体；倒去上清，用MS侵染液悬浮菌体，200 rpm振荡培养30 min；把无菌烟草叶片剪切成1 cm2左右的小片放入悬浮液中，200 rpm振荡培养浸染15 min；取出叶片，用无菌滤纸吸干菌液，置于含有MS1共培养培养基上，28 培养箱暗培养两天。（4）MS2培养基上形成愈伤组织：将暗培养两天后的烟草叶片转入MS2选择培养基

22、上，尽量使烟草愈伤浸入到培养基内部，25 组培室培养约15天至愈伤形成。（5）继代培养：将形成愈伤组织的烟草叶片转入新的MS2选择培养基，培养约两周形成大量的丛芽。（6）生根培养：无菌操作的情况下，将侵染烟草叶片的愈伤组织再分化形成的芽用剪刀或镊子取下转入MS3生根培养基中进行生根培养2周。（7）炼苗和移栽：将已经生根的烟草和野生型烟草，去掉封口膜，在组培室内炼苗三天；将驯化好的烟草植株，栽培到经过高压灭菌的土：蛭石=1:1的营养土里，做好编号，放入植物生长间培养8 h光照和16 h黑暗的光照培养间里培养。 1.2.5 CTAB法提取DNA分子检测转基因植株（1）取烟草的叶片约1cm2，用研磨

23、棒充分研磨后，每管加入700 L CTAB提取缓冲液，65 水浴30 min，期间震荡35次；加入等体积的氯仿，剧烈震荡之后，12000 rpm，室温离心10 min；取上清，加入2倍体积的异丙醇，-20 放置2小时，12000 rpm，室温离心10 min；弃上清，加入0.5 mL 70 %的乙醇洗涤两次，待充分吹干后加入50 L DEPC-H2O溶解DNA，-20 保存。（2）PCR扩增时，以叶片的DNA为模板，在20 L的反应体系中加入DNA模板2 L，10 PCR Buffer 2 L，dNTP mix (2.5 mM each) 2 L，正反向引物(GbMFT2- F/GbMFT2-

24、 R，见表2) (10 M) 0.5 L，0.2 uL rTaq DNA聚合酶，ddH2O补齐。PCR反应程序为：94 ，2 min，后94 40 s，55 40 s，72 45 s，35个循环后72 延伸10 min。经琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。1.2.6 棉花GbMFT2基因在ABA胁迫下的表达分析（1）处理棉花种子：分别播种在含不同浓度ABA (0、0.5、1、5和10 mol L1)的1/2 MS固体培养基，其成分含有1%的葡萄糖，2.2 g L1 MS培养基(Duchefa Biochemie Netherland)，0.05 %的MES (Amersham, America)，

25、0.8% Agar，pH 5.8。将播种后培养皿放入28 的恒温培养箱内培养，20 h胚根已经伸出种壳，此时收集不同处理的棉花种子，并将棉花种子立即浸于液氮中，80保存备用。（2）提取烟草RNA：100 mg 棉花种子经液氮研磨后加入抽提液1 ml，65 水浴10 min，其间剧烈震荡2-3次；4 ，12 000 rpm离心10 min后，取上清加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，4 ，12 000 rpm离心15 min；取上清，加入等体积的氯仿，1/10体积的5 mol/L 醋酸钾(pH4.8)，1/10体积的无水乙醇，混匀，4 ，12 000 rpm离心15 min。取上清，加

26、入等体积的氯仿，4 ，12 000 rpm离心10 min；取上清，加入1/4体积的10 mol/L LiCl，0 过夜沉淀；4 ，12 000 rpm离心15 min后，弃上清，质量完好的RNA置于-80保存备用。加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠(pH5.2)，2.5倍体积的无水乙醇，-70，沉淀至少30 min；离心4 ，13 000 rpm离心15 min后，弃上清，70%乙醇洗沉淀2次；干燥后用无RNAse的水溶解。总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测。（3）cDNA第一链的合成参照TaKaRa公司提供的试剂盒将棉花组织总RNA反转录，获得cDNA第一链。反应物用量RNA4 LOligo

27、 (dT)18 primer (0.5 g/L)1 LDEPC-H2O1 L65 ，温育5 min，冰上放置2 min，再加入以下反应液反应物用量5 M-MLV Buffer2 LdNTP Mix( 10 mmol/L)0.5 LRNase Inhibitor (20 U/L)0.25 LRNase M-MLV (200 U/L)0.5 L（5）半定量RT-PCR分析目的基因的表达情况：基因特异引物是GbMFT2-RTF和GbMFT2-RTR，内参基因为ubiquitin 7，进行半定量RT-PCR。以UBQ7F和UBQ7R扩增内参，GbMFT2-RTF和GbMFT2-RTR为扩增目的基因的特

28、异性引物。PCR反应体系（20 L）：10 PCR buffer 2 L、dNTP mix (2.5 mM each) 2 L、引物-F/R (10 M) 0.5 L、 rTaq (5 U/L) 0.2 L。程序：94预变性4 min; 94 30 s, 55 45 s，72 40 s后扩增（内参基因扩增28 Cycles，GbMFT2扩增30 Cycles）；72延伸10 min。1.2.5 T2代转基因烟草表性分析1.2.5.1 T2代烟草种子的处理及种植70 %酒精消毒2 min，再加入20 % NaClO 消毒7 min，水洗3次，最后一次留少量水，用移液器吸出，均匀点种在含有200

29、mg/L Kan 的1/2 MS筛选培养基上。至于暗培养箱中黑暗培养2天，再放入25 光照培养箱培养，两个星期后将幼苗分为两部分：一部分无菌烟草幼苗的转接到分别含0 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L的1/2 MS培养基上盐胁迫处理30天，观察表型；将另一部分野生型烟草与转基因烟草种在含1/2 MS的锥形瓶，光照培养箱中培养30天，再经过两天的炼苗后栽培到经过高压灭菌的土：蛭石=1:1的营养土里，做好编号，放入h光照和16 h黑暗的培养间里培养，统计转基因烟草与野生型烟草的开花时间。1.2.5.2 CTAB法提取T2代转基因烟草的DNA进行的分子检测

30、（1）取烟草的叶片约1cm2，用研磨棒充分研磨后，每管加入700 L CTAB提取缓冲液，65 水浴30 min，期间震荡35次；加入等体积的氯仿，剧烈震荡之后，12000 rpm，室温离心10 min；取上清，加入2倍体积的异丙醇，-20 放置2小时，12000 rpm，室温离心10 min；弃上清，加入0.5 mL 70 %的乙醇洗涤两次，待充分吹干后加入50 L DEPC-H2O溶解DNA，-20 保存。（2）PCR扩增时，以叶片的DNA为模板，在20 L的反应体系中加入DNA模板2 L，10 PCR Buffer 2 L，dNTP mix (2.5 mM each) 2 L，正反向引物

31、(GbMFT2- F/GbMFT2- R，见表2) (10 M) 0.5 L，0.2 uL rTaq DNA聚合酶，ddH2O补齐。PCR反应程序为：94 ，2 min，后94 40 s，55 40 s，72 45 s，35个循环后72 延伸10 min。经琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。1.2.5.3 分析不同浓度NaCl对T2代转基因烟草叶片叶绿素含量的变化（1） 烟草叶片的盐胁迫处理 称取新鲜样品0.2 g左右，擦净组织表面污物。分别放入0 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L NaCl的溶液中。至于光照培养间，放置72h。（2）测定叶绿素a和叶绿

32、素b的含量 将72 h盐处理后的叶片剪碎，分别放入研钵中，加少量石英砂和2 mL 95乙醇，研成均浆，继续研磨至组织变白。静置35 min。取滤纸 1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25 mL棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至 25 mL，摇匀。把叶绿体色素提取液倒入光径1 cm 的比色杯内。以 95乙醇为空白，在波长 665 nm、649 nm 下测定吸光度。将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A6656.88A

33、649；Cb=24.96A6497.32A665。据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：叶绿素的含量（mg/g）= 叶绿素的浓度提取液体积稀释倍数/样品鲜重。1.2.5.4 统计不同浓度NaCl对T3代转GbMFT2基因烟草种子萌发率的影响将转基因烟草种子在70 %酒精消毒2 min，再加入20 % NaClO 消毒7 min，水洗3次，最后一次留少量水，用移液器吸出，均匀点种在含有0 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L NaCl的MS培养基上。至于暗培

34、养箱中暗培养2天，再放入25 光照培养箱培养，统计种子的萌发率。1.2.5.5 分析不同浓度NaCl对T3代转基因烟草幼苗的影响将T3代转GbMFT2基因烟草种子和野生型烟草种子消毒处理，方法见1.2.5.4。将T3代转GbMFT2基因烟草种子点种在含200 mg/L Kan的MS筛选培养基，将野生型烟草种子点种在MS培养基。置于黑暗培养箱中暗培养2天，再放入25 光照培养箱培养。待烟草长出2片子叶，将转GbMFT2基因烟草和野生型烟草分别移栽到含有0 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L NaCl、400 mmol/L NaCl的MS培养基上，统计烟

35、草植株的根长，13天时再次测量烟草植株的根长。2结果与分析2.1 GbMFT2基因的生物信息学分析2.1.1 海岛棉中成花素的类似基因GbMFT2编码的cDNA序列长度为747 bp，含一长度为519 bp的最大ORF，5UTR为75 bp，推测ORF编码172个氨基酸。在NCBI上对海岛棉GbMFT2保守域分析表明GbMFT2蛋白含有磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)保守结构域（图2-1），GbMFT2蛋白在羧基末段都含有保守的脯氨酸残基，且在GbMFT2蛋白的第95位为谷氨酸，说明GbMFT2可能属于MFT-like家族中的A亚家族。图2-1 GbMFT2蛋白的磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP

36、)保守结构域2.1.2 利用软件ProtScale分析预测GbMFT2蛋白氨基酸序列的疏水性/亲水性。多肽链第168位的缬氨酸V具有最低的分值-2.511，有较高的亲水性。第120位的苯丙氨酸F具有最高的分值1.744，有较高的疏水性。可认为棉花的GbMFT2蛋白可能是亲水性蛋白，不符合跨膜蛋白的特征（图2-2）。图2-2 棉花GbMFT2蛋白的疏水性/亲水性预测2.1.3 FT、TFL1、MFT蛋白序列的比对及分析植物的PEBP家族基因分为FT-like，MFT-like和TFL1-like三个亚家族。比对分析表明GbMFT2和AtMFT蛋白的相似性为61.9%。拟南芥PEBP家族含有6个成

37、员：AtFT (GenBanK登录号：AAF03936.1)、AtTFL1 (GenBanK登录号：AAB41624.1)、TSF (GenBanK登录号：AAF03037.1)、MFT (GenBanK登录号：AAD37380.1)、BFT (GenBanK登录号：Q9FIT4.1)及ATC (GenBanK登录号：BAA75931.1)与本研究克隆的棉花GbMFT2、已报道的棉花GhFTL1、GhTFL1a和GhTFL1b的氨基酸序列比对分析发现（图2-3），GbMFT2蛋白含有FT/TFL1家族中都存在的D-P-D-x-P和G-x-H-R结构域，用色氨酸Trp和丙氨酸Ala残基取代了FT

38、亚家族中关键的络氨酸Tyr和谷氨酰胺Gln残基。在GbMFT2蛋白羧基末段存在一个保守的脯氨酸残基，而这个脯氨酸残基只在MFT-like基因家族发现，而在FT-like和TFL1-like基因家族中至今还没有发现类似的保守氨基酸残基，脯氨酸被认为具有改变蛋白质结构的能力。A：D-P-D-x-P基序；B：区分FT/TFL1的关键氨基酸络氨酸Tyr (Y)/His (H)；C：B亚家族中的保守谷氨酸Glu (E)，D：G-x-H-R基序，E：FT/TFL1家族蛋白羧基端保守基序；F：大多数MFT-like中保守的普氨酸Pro (P)。图2-3 FT、TFL1、MFT蛋白家族比对分析2.1.4 海岛

39、棉GbMFT2蛋白系统进化分析从GenBank数据库中下载来自30物种的FT-like、MFT-like、TFL1-like三个亚家族蛋白（表2-1），比较其编码的氨基酸序列，利用蛋白质序列构建系统进化树（图2-4），这些FT/TFL1家族蛋白中本研究中的GbMFT2与葡萄VvMFT蛋白，番茄SP2I蛋白距离较近，都属于MFT-Like家族。表2-1 进化树中各基因的物种信息及其蛋白质在GenBank登录号编号基因物种拉丁名物种名蛋白登录号1GbMFT2Gossypium barbadense海岛棉2GbMFT1Gossypium barbadense海岛棉KC5137443GbFTL1Gos

40、sypium barbadense海岛棉AEW24444.14GhFTL1Gossypium hirsutum陆地棉ADK95113.15GhTFL1a Gossypium hirsutum陆地棉ABW24963.16GhTFL1b Gossypium hirsutum陆地棉ABY62770.17CiFTCitrus unshiu温州蜜柑BAA77836.18FcFTFicus carica无花果BAI60052.19CsFTCucumis sativus黄瓜BAH28253.110PmFTPrunus mume梅花CAQ16124.111CpFTCarica papaya番木瓜ACX8542

41、7.112VvFTVitis vinifera葡萄ABF56526.113ClFTChrysanthemum lavandulifolium甘菊ACY82397.214Hd3aOryza glumipatula水稻BAH56285.115RFT1Oryza sativa Japonica Group水稻BAJ53917.116OsMFT2Oryza sativa Japonica Group水稻组BAG98997.117PnFT1Ipomoea nil牵牛花ABW73562.118PnFT2Ipomoea nil牵牛花ABW73563.119BvFT1Beta vulgaris甜菜ADM926

42、08.110BvFT2Beta vulgaris甜菜ADM92610.121BvCEN1Beta vulgaris甜菜ADM92611.122BvMFT1Beta vulgaris甜菜ADM92616.123MdCENaMalus x domestica苹果BAG31957.124MdFT2Malus x domestica苹果BAI77728.125MdCENbMalus x domestica苹果BAG31958.126MdTFL1Malus x domestica苹果BAD06418.127MdFT1Malus x domestica苹果BAI77730.128SPSolanum lyc

43、opersicum番茄AAC26161.129SP9DSolanum lycopersicum番茄AAO31795.130SP3DSolanum lycopersicum番茄AAO31792.131SP2GSolanum lycopersicum番茄AAO31791.132AtTFL1Arabidopsis thaliana拟南芥AED90661.133ATCArabidopsis thaliana拟南芥AEC08014.134AtMFTArabidopsis thaliana拟南芥AEE29676.135TSFArabidopsis thaliana拟南芥AEE84314.136TSFAra

44、bidopsis thaliana拟南芥AEE84314.137RCN1Oryza brachyantha野生稻CBX25328.138RCN2Oryza brachyantha野生稻BAH01422.139AmCENAntirrhinum majus金鱼草CAC21564.140PtCENL1Populus trichocarpa毛果杨AAQ88444.141StTFL1Solanum tuberosum马铃薯ABC24691.142TaMFTTriticum aestivum小麦BAK78908.143HvMFT1Hordeum vulgare subsp. vulgare大麦BAH241

45、98.144CuMFT1Citrus unshiu温州蜜柑BAF93494.145PaMFT1Picea abies挪威云杉AEH59565.146PaMFT2Picea abies挪威云杉AEH59566.147AhMFT Arachis hypogaea花生AFP33419.148VvMFT Vitis vinifera葡萄ABI99469.149PnFTL4aPopulus nigra钻天杨BAG12904.150PtMFTPopulus trichocarpa欧洲大叶杨ABC26020.151ZEN9Zea mays玉米NP_001106248.152ZEN10Zea mays玉米NP

46、_001106249.153ZCN9Zea mays玉米ABX11011.154LsFTLactuca sativa莴苣BAK14369.155CsTFLCitrus sinensis甜橙AAR04683.1FT1-like CladeTFL1-like CladeMFT-like Clade图2-4 54个植物PEBP蛋白家族系统进化分析2.1.5 GbMFT2编码蛋白三维结构的预测与分析利用同源建模法，构建和分析GbMFT2蛋白质的三维结构（图2-4）。发现GbMFT2蛋白与拟南芥的FT/TFL1家族蛋白的三级结构十分类似。GbMFT2蛋白含有5个反向平行的肽链形成一个大的中心-折叠片，还有连接在两侧的1个较小的-折叠片，形成一个桶装结构。GbMFT2A蛋白整体三维结构，螺旋状代表-sheet，其它线性骨架为无