生物选修一分解纤维素的微生物的分离学习教案.pptx

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1、会计学1生物选修生物选修(xunxi)一分解纤维素的微生物一分解纤维素的微生物的分离的分离第一页，共35页。一、基础知识一、基础知识（一）纤维素和纤维素酶（一）纤维素和纤维素酶1 1、纤维素、纤维素纤维素是一种纤维素是一种(y zhn)(y zhn)由葡萄糖首尾相连而成的高由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。第1页/共35页第二页，共35页。2 2、纤维素的分布、纤维素的分布(fnb)(fnb) 棉花是自然界中纤维素含量最高的天然棉花是自然界中纤维素含量最高的天然(tinrn)(tinrn)产物，此外，木材、作物秸秆等

2、也富含纤产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。但被利用的机会很少、效率低；维素。但被利用的机会很少、效率低； 科学家正致力于研究，怎科学家正致力于研究，怎样将农业样将农业(nngy)(nngy)废弃物、木废弃物、木材及生长材及生长更为迅速的草本植物，转化为更为迅速的草本植物，转化为种类繁多的生物燃料（甚至是种类繁多的生物燃料（甚至是航空燃油）。航空燃油）。纤维素生物燃料：纤维素生物燃料：最有希望替代石油能源最有希望替代石油能源第2页/共35页第三页，共35页。 植物植物(zhw)(zhw)每年产生的纤维素超过每年产生的纤维素超过7070亿吨，其中亿吨，其中40%-60%40%-60%能能被

3、土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。 在草食性动物在草食性动物(dngw)(dngw)等的消化道内，也共生有等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。纤维素，而人没有分解纤维素的能力。3 3、纤维素酶、纤维素酶 纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分种组分(zfn)(zfn)，即，即C1C1酶、酶、CXCX酶和葡萄糖苷酶，前两酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二

4、糖，第三种酶将纤维二糖种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。分解成葡萄糖。纤维二糖纤维二糖C1酶、酶、Cx酶酶葡萄糖苷葡萄糖苷酶酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素第3页/共35页第四页，共35页。P27P27：纤维素酶分解：纤维素酶分解(fnji)(fnji)纤维素的实纤维素的实验验取二支取二支20mL的试管的试管(shgun)各加入各加入(jir)一张滤纸条一张滤纸条各加入各加入pH4.8，物质量为，物质量为0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液的醋酸醋酸钠缓冲液11ml和和10ml在乙试管中加入在乙试管中加入1mL纤维素酶纤维素酶两支试管固定在锥形瓶中，放在两支试管固定在锥形瓶中

5、，放在140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1h结果：乙试管的滤纸条消失结果：乙试管的滤纸条消失甲甲 乙乙讨论：讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？第4页/共35页第五页，共35页。思考思考实验分析：实验分析：P27P27的小实验是如何的小实验是如何构成对照的？构成对照的？滤纸崩溃法滤纸崩溃法自变量是纤维素酶的有无：自变量是纤维素酶的有无：一支试管中添加适量纤维素酶溶液一支试管中添加适量纤维素酶溶液(rngy)(rngy)，另一支试管不添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶，（但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，（但需加入等

6、量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液否则会影响溶液(rngy)(rngy)的的pHpH。）。）第5页/共35页第六页，共35页。（二）纤维素分解（二）纤维素分解(fnji)(fnji)菌的筛选菌的筛选 1 1、筛选、筛选(shixun)(shixun)方法：方法： 刚果红染色法，这种方法能刚果红染色法，这种方法能够通过够通过(tnggu)(tnggu)颜色反应直接颜色反应直接对微生物进行筛选。对微生物进行筛选。2 2、筛选原理：、筛选原理： 刚果红刚果红是一种染料，它可以是一种染料，它可以与像纤维素这样的与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物多糖物质形成红色复合物 ，但并不和纤维二糖、，

7、但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解为中心的透明圈养基中会出现以纤维素分解为中心的透明圈 。这样我们可以通过这样我们可以通过是否产生透明圈是否产生透明圈来筛选纤维素来筛选纤维素分解菌。分解菌。第6页/共35页第七页，共35页。例例1 1 ：下列关于纤维素酶的说法，错误：下列关于纤维素酶的说法，错误(cuw)(cuw)的的是（是（ ）A. A. 纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B. B. 纤维素酶

8、可把纤维素分解成葡萄糖纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C. C. 纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D. D. 葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖D第7页/共35页第八页，共35页。二、实验设计二、实验设计（一）分离分解（一）分离分解(fnji)(fnji)纤维素的微生物纤维素的微生物实验流程实验流程土壤土壤(t(trnrng)g)取取样样选择选择(xu(xunz)nz)培养培养梯度梯度稀释稀释将样品涂将样品涂布到鉴别布到鉴别培养基培养基挑选挑选菌落菌落什么样什么样的环境的环境取样取样? ? 培养的目的培养的目的? ? 选选择培养基的特点择

9、培养基的特点? ?挑选什么挑选什么样的菌落样的菌落? ?鉴别培养基的特鉴别培养基的特点点? ?如何鉴别如何鉴别? ?根据：根据：微生物微生物对生存环境的要对生存环境的要求，到相应环境求，到相应环境中去找；中去找；目的：目的：增加纤维素增加纤维素分解菌的浓度，分解菌的浓度，以确保能够从样品以确保能够从样品中分离到所需要的中分离到所需要的微生物；微生物；刚果红染色法刚果红染色法第8页/共35页第九页，共35页。本实验流程与尿素分解菌的分离实验流程有哪些异同？ 尿素分解菌的分离实验流程是将土样制成的尿素分解菌的分离实验流程是将土样制成的菌悬液直接涂布在选择培养基上菌悬液直接涂布在选择培养基上; ;本

10、课题通过选择本课题通过选择培养使细菌增殖后培养使细菌增殖后, ,再涂布在鉴别培养基上。其它再涂布在鉴别培养基上。其它操作基本操作基本(jbn)(jbn)基本基本(jbn)(jbn)共同。共同。 第9页/共35页第十页，共35页。分布分布(fnb)(fnb)环环境境1 1、土壤、土壤(trng)(trng)取样：取样： 生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。境。原因原因（二）操作步骤（二）

11、操作步骤第10页/共35页第十一页，共35页。实例实例(shl)(shl)讨论讨论(toln) (toln) 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中(jzhng)(jzhng)，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm10cm左右的土壤左右的土壤中。中。树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。叶等。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有

12、什么作用？你认为滤纸应该埋在土将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？壤中多深？第11页/共35页第十二页，共35页。2 2、选择、选择(xunz)(xunz)培培养养 增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品(yngpn)(yngpn)中分离所需要的微生物。中分离所需要的微生物。 目的目的(md)(md)：制备选择培养基制备选择培养基操作：操作：将土样加入装有将土样加入装有30ml30ml选择培养基的锥形瓶选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养荡培养1 12 2天，直至

13、培养液变浑浊。也可重复天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。选择培养。第12页/共35页第十三页，共35页。阅读阅读(yud)(yud)资料二资料二“选择培养基选择培养基”，回答以下几问，回答以下几问题：题：第13页/共35页第十四页，共35页。培养基组成培养基组成纤维素粉纤维素粉 5gNaNO3 1gKCl 0.5g Na2HPO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g酵母膏酵母膏 0.5g水解酵素水解酵素 0.5g溶解后，蒸馏水定容至溶解后，蒸馏水定容至1000mL碳源（能源碳源（能源(nngyun)）氮源、无机盐氮源、无机盐无机盐无机盐碳源、氮源、生长

14、因子碳源、氮源、生长因子氮素、生长因子氮素、生长因子水水提供提供(tgng)主要的营养物主要的营养物质质第14页/共35页第十五页，共35页。提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照, ,或者或者(huzh)(huzh)将纤维素改为葡萄糖。将纤维素改为葡萄糖。A A、旁栏中的配方是液体、旁栏中的配方是液体(yt)(yt)培养基还是固体培养培养基还是固体培养基？基？为什么？为什么？是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）。目的是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）

15、。目的(md)(md)是使纤维素分解菌增殖是使纤维素分解菌增殖, ,含量增多。含量增多。B B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？具有，是如何进行选择的？有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。C C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？作用？第15页/共35页第十六页，共35页。分析分析“纤维素分解菌的选择培养基配方纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配

16、方中的酵母膏也能够提供少量可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量(sholing)的碳的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。说明说明(shumng)：第16页/共35页第十七页，共35页。在选择培养在选择培养(piyng)(piyng)的条件下，可以使那些的条件下，可以使那些能够适应能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微

17、生物的繁殖被抑制，因此适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到可以起到“浓缩浓缩”的作用。的作用。第17页/共35页第十八页，共35页。比较项目比较项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养基基原理原理培养基培养基类型类型目的目的将细菌涂布在只将细菌涂布在只有尿素有尿素(nio s)做氮做氮源的源的选择培养基上选择培养基上将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有(zhyu)纤维素粉做碳源的纤维素粉做碳源的选择培养基上选择培养基上固体固体(gt)培养基培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株增大菌株浓度增大菌株浓度比较：比较：第18页/共35页第十九页，共35页

18、。本实验的流程与课题本实验的流程与课题(kt)2(kt)2中的实验流程有哪些异同？中的实验流程有哪些异同？ 本实验流程与课题本实验流程与课题2 2的流程的区别如下。课题的流程的区别如下。课题2 2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离源的选择性培养基上，直接分离(fnl)(fnl)得到菌落得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。一致。 思考：思考：第19页/共35页第二

19、十页，共35页。按照课题按照课题1 1的稀释操作方法，将选择的稀释操作方法，将选择(xunz)(xunz)培养后培养后的培养基进行等比稀释的培养基进行等比稀释101101107107倍。倍。3 3、梯度、梯度(t d)(t d)稀释稀释101102103104105106第20页/共35页第二十一页，共35页。4 4、将样品、将样品(yngpn)(yngpn)涂布到鉴别纤维素分解菌的培养涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上基上（1 1）制备）制备(zhbi)(zhbi)鉴别培养基鉴别培养基: :培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的主要营养物质CMC-Na 510gCMC-Na 510g碳源

20、碳源酵母膏酵母膏 1g1g碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子KHKH2 2POPO4 4 0.25g0.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁 100mL100mL碳源、生长因子碳源、生长因子琼脂琼脂 15g15g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏水上述物质溶解后，加蒸馏水定容至定容至1000mL1000mL氢元素、氧元素氢元素、氧元素( (水溶性羧甲基纤维素钠水溶性羧甲基纤维素钠) )第21页/共35页第二十二页，共35页。（2 2）涂布平板）涂布平板(pngbn)(pngbn)： 将稀释度为将稀释度为104104106106的菌悬液各取的菌悬液各取0.1mL0.1mL滴加在鉴滴加在鉴别纤维素

21、分解别纤维素分解(fnji)(fnji)菌的培养基上菌的培养基上, ,用涂布器将菌液用涂布器将菌液涂布均匀涂布均匀, ,在在3030倒置培养。每个稀释度下需涂布倒置培养。每个稀释度下需涂布3 3个平个平板板, ,还要注意设置对照。还要注意设置对照。第22页/共35页第二十三页，共35页。5 5、刚果红染色法、刚果红染色法 挑选产生挑选产生(chnshng)(chnshng)透明圈的菌落，一般即为分透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。解纤维素的菌落。常用常用(chn yn)(chn yn)的刚果红染色法有的刚果红染色法有两种：两种：方法方法(fngf)一：一：先先_，再加入刚果红进行颜色反应

22、，再加入刚果红进行颜色反应。方法方法(fngf)二：二：在在_时就加入刚果红。时就加入刚果红。培养微生物培养微生物倒平板倒平板第23页/共35页第二十四页，共35页。颜色颜色(yns)反反应基本上是纤应基本上是纤维素分解菌的维素分解菌的作用作用操作操作(cozu)繁琐繁琐刚果红会使菌落之间刚果红会使菌落之间发生混杂发生混杂操作简便不存操作简便不存在菌落混杂在菌落混杂(hnz)问题问题1.产生淀粉酶的微生物产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈也产生模糊透明圈2.有些微生物能降解色有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。素，形成明显的透明圈。第24页/共35页第二十五页，共35页。漂洗作用，洗去与纤

23、维素结合不牢的刚果漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小以判断酶活力的大小(dxio)(dxio)，实际上刚果红是结合到，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小下大大小(dxio)(dxio)小的透

24、明圈，大的透明圈当然分解纤小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！维素的能就强！ 第25页/共35页第二十六页，共35页。比较项目比较项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法在细菌分解在细菌分解(fnji)尿素的化尿素的化学学反应中，细菌合成的脲反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解酶将尿素分解(fnji)成了氨成了氨，氨会使培养基的碱性增氨会使培养基的碱性增强，强，pH升高。在培养基升高。在培养基中加入酚红指示剂，如中加入酚红指示剂，如果果pH升高指示剂会变红升高指示剂会变红刚果红可以与纤维素形刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤

25、维成红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解素被纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成后红色复合物无法形成(xngchng)，培养基上就会出现以纤培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心的透维素分解菌为中心的透明圈明圈观察菌落周围是否有着观察菌落周围是否有着色的环带出现色的环带出现(chxin)来来鉴定尿鉴定尿素分解菌素分解菌观察菌落周围是否出现观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分透明圈来筛选纤维素分解菌解菌脲酶检测法脲酶检测法刚果红染色法刚果红染色法第26页/共35页第二十七页，共35页。6 6、纯化、纯化(chn hu)(chn hu)培养培养 挑取产生明显的透明圈的菌落，一般即为分挑取产生明

26、显的透明圈的菌落，一般即为分解解(fnji)(fnji)纤维素的菌落。纤维素的菌落。 接种到纤维素分解接种到纤维素分解(fnji)(fnji)菌的选择培养菌的选择培养基上，在基上，在300C300C 370C 370C培养，可获得纯培养。培养，可获得纯培养。第27页/共35页第二十八页，共35页。三、结果三、结果(ji gu)(ji gu)分析与评价分析与评价对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。制作合格。如果观察如果观察(gunch)(gunch)到产生透明圈的菌落，则说明可能到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的

27、微生物。获得了分解纤维素的微生物。1 1、培养基的制作、培养基的制作(zhzu)(zhzu)是否合格以及选择培养基是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落是否筛选出菌落2 2、分离的结果是否一致、分离的结果是否一致由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。第28页/共35页第二十九页，共35页。为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要为了确

28、定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行进行_实验实验(shyn)(shyn)，纤维素酶，纤维素酶的发酵方法有的发酵方法有_ _ 发酵和发酵和_ _ 发酵。纤发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的产生的_ _ 含量进行定量测定。含量进行定量测定。四、课题四、课题(kt)(kt)延延伸伸发酵发酵(f jio)产纤维素酶产纤维素酶 液体液体 固体固体 葡萄糖葡萄糖 第29页/共35页第三十页，共35页。分解分解(fn(fnji)ji)纤维纤维素的素的微生微生物的物的分离分离纤维素酶纤维素酶种类、作用种类、作用(zuyng)(zuyng)

29、、催、催化活力化活力刚果红染色刚果红染色(rns)(rns)筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养涂布培养涂布培养纯化培养纯化培养前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鉴别染色鉴别分离出分解菌分离出分解菌第30页/共35页第三十一页，共35页。1 1、利用刚果红法可以筛选出纤维素分解、利用刚果红法可以筛选出纤维素分解(fnji)(fnji)菌，下列说法错误的是（菌，下列说法错误的是（ ）A. A. 刚果红能与纤维素形成红色复合物刚果红能与纤维素形成红色复合物 B. B. 刚果红能与纤维二糖形成红色复合物刚果

30、红能与纤维二糖形成红色复合物 C. C. 刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D. D. 若培养基上产生了透明圈，则说明已筛若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解选出了纤维素分解(fnji)(fnji)菌菌B第31页/共35页第三十二页，共35页。2 2、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪一生物学观点？（，符合下列哪一生物学观点？（ ）A A、生物结构与功能、生物结构与功能(gngnng)(gngnng)相适应的观点相适应的观点 B B、生物结构与功能、生物结构与功能(gngnng)(gngnng)整体性观点整体性观点C C、生物与环境相适应的观点、生物与环境相适应的观点 D D、生物发展进化的观点、生物发展进化的观点C第32页/共35页第三十三页，共35页。3 3、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（ ）土壤取样土壤取样 梯度稀释梯度稀释 选择培养选择培养(piyng) (piyng) 菌悬液涂布平板菌悬液涂布平板 挑选出单挑选出单个菌落个菌落A A、 B B、C C、 D D、B第33页/共35页第三十四页，共35页。第34页/共35页第三十五页，共35页。