(涂绍勇3、4.5周)发酵工程与设备实验讲义.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流(涂绍勇3、4.5周)发酵工程与设备实验讲义.精品文档.前 言 发酵工程是一门以生物代谢过程和对代谢过程控制，获得生物产品共性原理为研究对象的学科。探讨生物产品生产过程中的共性为目的，从工艺角度阐明细胞的生长和代谢产物与细胞的培养条件之间的相互关系，为生产过程的优化提供理论依据。本实验课程的任务是使学生在已学过微生物、生物化学、化工原理等课程的基础上，把发酵工程的理论和实践结合起来，实现对生物反应器和生物化学产品纯化与分离的操作。深入理解生产过程的工艺原理，进一步深化和提高所学的基本知识，从而使学生具有选育新菌种，探求新工艺、新设备、从事生物

2、产品研发和对生物产品下游技术操作的基本的能力并能够应用基本理论去分析和解决生产过程中的具体问题，改造原有不合理的生产过程，使之更符合客观规律。本实验以霉菌、细菌、酵母菌等常见工业微生物为对象，经过发酵生产植酸酶、谷氨酸、红曲等，并经过进一步的分离提取，得到商品。通过这一过程学习生物工程中的中游和下游技术。实验课程作为发酵工程教学的重要部分，一直是课程建设的重点，特别是经过最近几年的改革与实践，已经形成了基础、综合、创新三个平台的实验教学模式，并以此建立了一整套的实验管理体系，形成了我校发酵工程实验教学的特色。 按照三个平台进行编制实验内容。 基础型实验平台：基础型实验平台旨在培养学生的基本实验

3、技能，掌握基本实验方法，为进一步的实验打下基础。本平台将发酵过程按工艺流程整合成样品采集、菌种诱变、培养基配制、种子扩培、发酵培养、产物分析等单元实验模块，与理论课程同步开设，作为课程实验的基本环节。 综合型实验平台：综合型实验平台指具有一定综合度并带有一定设计性的大实验，是课程实验的提高环节，旨在培养学生的综合实验技能，使学生的实验技能得到系统的训练，掌握较高层次的实验方法。本平台实验内容涵盖酶制剂生产、红曲色素生产、液态发酵、固态发酵、酶反应工程及过程控制检测等诸多领域，学生可以结合自己的兴趣选做其中部分内容。创新型实验平台：创新型实验平台指反映学科发展方向或研究热点的带有探索性的实验环节

4、，鼓励学生自由参加。旨在培养学生的实验创新能力，掌握较好的实验设计方法和数据分析的能力。本实验平台由学院各研究所、研究室提供实验课题，每年动态调整，学生自由选择，让学生接触并参与科研工作，培养科研兴趣，鼓励学生提出新想法、新见解，并付诸实验。基础型、综合型实验环节随发酵工程理论课程同学期开设，基础实验安排4周，综合型实验安排12周；创新实验环节从四年级开始启动，以保证实验的连贯性和效果。参加创新实验的项目可以作为毕业论文（设计）的选题。通过这样一个连贯性的实验教学规划，使学生的实验技能得到系统的训练。目前我们的实验教学体系，显示了较为显著的特点。1）基础型实验掌握扎实：首先通过精心选择安排基本

5、技能训练的实验内容，做到少而精，便于学生掌握，而且在进一步在综合实验环节中，这些基本技能训练重复出现，基本技能得到了巩固和加强。2）综合型实验的比重大；占整个实验环节的70，综合型实验中学生更可部分或全部完成从实验方案设计、实验准备直至实验结果获取的全过程。通过这种系统化的训练，学生的动手能力、综合问题的分析能力得到极大的提高。3）时代感突出：实验内容涵盖了发酵工程的诸多新领域，与学科的发展相适应，激发了学生的实验兴趣。发酵工程实验室规则一、实验前，请自觉对实验内容进行充分的预习，了解实验目的、原理和方法，不清楚或不懂之处，可以查阅有关资料，做到心中有数。二、进入实验室后，应保持良好的秩序，不

6、要随便谈笑、高声说话和随意走动，不做与实验无关的事情。三、实验时，应严格遵守正确的操作方法和按规定的步骤进行，并根据自己观察所得，认真、实事求是地记录实验结果，课后要及时、认真完成实验报告，并按时汇交老师批阅。四、使用化学药品、玻璃器皿和水电等要切实注意安全，以免发生危险和伤害事故。五、使用显微镜、离心机、旋转蒸发仪、摇床、电热蒸汽灭菌锅、培养箱、干燥箱等仪器时，要细心操作和特别爱护。六、对消耗性材料和药品的使用要力求节约，用后归还原处。七、实验室里的一切物品，未经教师许可，不得擅自取用或携出。八、无菌操作前后要用消毒水（3%左右来苏尔液或新洁尔灭等溶液）洗手和擦洗台面。九、损坏物品应及时登记

7、，并照价赔偿。十、实验完毕，必须把所用的仪器、设备等抹净放妥，清理好自己的实验台，把实验用具、器皿洗刷干净，安放妥当，将实验室收拾整洁、干净，然后将手洗净，关好水电门窗等，并向指导教师交待清楚后方可离开实验室。 基础型实验平台 实验1 实验准备知识和基本操作训练一、实验目的1. 理解发酵工程实验技术的基础理论。2. 掌握发酵工程实验技术的基本操作。二、实验原理1. 玻璃器皿的洗涤（1）新购置玻璃器皿的处理新购置的玻璃器皿往往含有游离碱，一般应先在2%盐酸溶液中浸泡数小时后再用清水洗净。洗净后的试管倒置在试管筐或架中，锥形瓶倒置于洗涤架上，培养皿的皿盖和皿底分开，顺序压着皿边倒扣在桌子上或其它地

8、方，晾干或在干燥箱中烘干备用。（2）常用玻璃器皿的洗涤常用的锥形瓶、培养皿、试管、烧杯、量筒、玻璃漏斗等器皿，洗涤时可用鬃刷沾上洗衣粉、肥皂粉或去污粉刷洗，然后用自来水冲洗干净，倒放在洗涤架上自然晾干或放7080干燥箱中烘干备用。移液管和滴管可用自来水冲洗干净后放7080干燥箱中烘干备用。若分析用移液管最好在2%盐酸溶液（或洗液）中浸泡数十分钟，取出后用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗23次，100 干燥箱中烘干备用。（3）带菌玻璃器皿的处理移液管、滴管、玻片等带菌后，使用完毕立即浸入5%石炭酸溶液（或2%来苏尔或0.25%新洁尔灭溶液）中数小时或过夜，再洗涤。锥形瓶、培养皿、试管等应经120 灭菌

9、后再洗涤。注意：琼脂不能直接倒在洗涤池内，必须倒在废桶中，否则阻塞下水管道。2. 发酵工程实验室技术的有关内容发酵工程的开发，首先要在实验室中进行。在实验室里，与发酵工程有关的关键设备有：灭菌设备、超净工作台、摇瓶机、培养箱、小型发酵罐等。在发酵工程研究和生产中，纯培养是最基本的操作。为了实现纯培养的目的，要求从接种到培养结束的整个实验过程不得有杂菌污染，也就是说，要严格满足无菌操作的要求。因此，我们首先碰到的问题就是灭菌。所谓灭菌是指用热或其它物理和化学方法将所有的微生物完全破坏或除去。在实验室里常规的灭菌方式主要包括热灭菌、化学灭菌、紫外线杀菌以及过滤除菌等。为了保证实验过程完全按照无菌操

10、作的要求进行，不仅需要灭菌设备和无菌环境等客观条件的保证，更需要实验者主观上将无菌操作的意识贯穿于操作过程始终，并严格遵守无菌操作规程。发酵工程实验室技术操作很多，最基本也是最常见的操作有以下几项：（1）平板操作（如划线、涂布等）；（2）斜面操作（如划线、接块、穿刺等）；（3）摇瓶操作（如接块、接菌苔、移液等）；（4）菌种保藏操作（斜面保藏、沙土管保藏、冷冻管保藏、固体曲保藏等）。三、实验试剂与仪器1. 材料：棉花、纱布、棉绳、牛皮纸或报纸2. 仪器：试管、烧杯、锥形瓶、发酵瓶、移液管、培养皿、接种环、涂棒等。四、实验步骤 1. 实验准备操作（1）几种棉塞的制作（试管、锥形瓶、发酵瓶棉塞）（2

11、）几种器皿和用具的包扎（移液管、培养皿、试管） 培养皿的包扎。培养皿常用旧报纸紧紧包好，一般610套，包好后干热或湿热灭菌。如果将培养皿放入金属筒内进行干热灭菌，则不必用纸包，金属筒有一圆筒形的带盖外筒，里面放一装培养皿的带底框架（图4），此框架可自圆筒内提出，以便装取培养皿。 移液管的包扎。准备好干燥的移液管，在距其粗头顶端约0.5cm处，塞上1.5cm长的棉花，以免使用时将杂菌吹入其中，或不慎将微生物吸出管外。棉花要松紧适当（过紧，吹吸液体太费力；过松，吹气时棉花会下滑），接着按图5方法包扎，后将移液管集中在一起，用一张大报纸包好，进行干热或湿热灭菌。（3）几种接种用具的制作（接种环、涂棒

12、、接种铲、接种针、酒精灯） 试管和三角瓶的包扎 试管管口和三角瓶瓶口塞上棉花或硅胶塞后，在棉花塞与管口和瓶口的外面用二层报纸包扎好（如有牛皮纸只用单层，效果更好），进行干热或湿热灭菌。试管较多时，一般7支一组，再用双层报纸包扎。2. 培养基的制备与灭菌方法（1）配制培养基的基本过程：药品称量溶解调节pH过滤分装塞棉塞和包扎灭菌 先估算实际需要培养基的用量，然后按比例计算各种组份的用量； 称量药品、溶解。量微不宜直接称量的药品可以先配制母液，然后取适当体积达到规定比例。 调节pH。一般用精密pH试纸测定培养基的pH。 过滤。趁热（60以上）用滤纸或多层纱布在玻璃漏斗中过滤，使培养基清澈透明，以利

13、某些实验结果的观察。一般无特殊要求，此步骤可省略。 分装。试管分装视管大小及需要而定，若所用试管大小为15mm150mm时，液体培养基可分装至试管高度1/4左右为宜；如分装固体或半固体培养基时，在琼脂完全熔化后，应趁热分装于试管中，用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高的1/5，半固体培养基分装量为管高的1/3为宜，见图7。三角瓶的分装若用于振荡培养微生物时，一般装液量为1020，若用于制作平板培养基时，一般以三角瓶容积的1/22/3为宜。 塞棉塞。在试管口或三角瓶口塞上棉塞或耐高温硅胶塞。 包扎。管装培养基可每7支扎成一捆，或排放在铁丝框内。三角瓶加塞后，每只单独用牛皮纸包好，用线绳以活结形

14、式扎紧，使用时容易解开，并用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期等。（2）培养基的灭菌培养基的灭菌时间和温度，应按照各种培养基的规定要求进行，以保证灭菌效果和不破坏培养基的营养成分。通常对普通营养培养基用0.10MPa（121）高压蒸汽灭菌2030min。牛乳培养基用0.07 MPa（115）菌20min。注意培养基中含有糖类、尿素、氨基酸、酶、维生素、抗生素、血清等成分时，因之在高温下易分解、变性，故应单独使用滤菌器过滤除菌，再按规定的温度和用量加入已灭菌的培养基中。3. 平板操作（1）倒平板倒平板分为持皿法和叠皿法。持皿法是先左手持三角瓶，右手反转手掌用中指和无名指拔出棉塞（或不翻转手掌用

15、小指和手掌拔出棉塞），同时将三角瓶转换至右手，而后左手拿平皿，以大拇指和中指将皿盖打开一缝，至瓶口刚好伸入。三角瓶口经火焰灼烧后，倾入灭菌或熔化、冷却至5560的培养基约15mL（勿使瓶口靠在平皿壁上，以免沾染皿壁），迅速盖好皿盖，置于桌上轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿底部，冷凝后即为平板培养基。有时冷凝后的培养基表面有冷凝水，为防止冷凝水过多，亦可将培养基冷却至4550再倒平板。（2）平板划线（3）平板涂布4. 斜面操作（1）摆斜面斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜，如制作半固体或固体高层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝，见图11。（2）斜面接种 斜面活化。从生长良好的微生

16、物斜面试管中挑取少量菌苔接种至空白斜面培养基上。操作过程演示见图12-1，12-2。 斜面接种至摇瓶。将10mL左右的无菌水洗斜面，制作菌悬液，从斜面菌液吸取一定量的菌液接种到摇瓶（液体）培养基中。操作过程演示见图14。 穿刺接种。用来接种厌氧菌，检查细菌的运动能力或用于保藏菌种。五、思考题1. 请将每项操作中应注意的细节列出。2. 谈谈本次实验的体会。 专题实验2 产植酸酶黑曲霉发酵植酸（phytic acid）又名肌醇六磷酸（myo-inostol hexakisphosphate），广泛存在于植物组织和相应的粮食产品中，占其总量的1%3%，其中的磷含量占植物总磷的50%90%。磷是动物生

17、长繁殖、骨骼矿化及代谢所必需的矿物元素之一，而动物摄入的无机磷，大部分以植酸盐形式存在，不易被人和单胃动物所消化利用而随粪便排出体外，致使全球磷的污染越来越严重。一些国家从环保的角度对集约化畜牧场已提出了限制排磷的要求。荷兰于1998年通过了MINAS（一种新的矿物元素结帐系统）的立法，其中严格限制了动物粪便中磷酸盐的排放量。另外，动物体内磷的低利用率，导致了饲料中无机磷添加量的增加，从而使得磷的浪费，增加饲料成本。因为植酸是一种抗营养因子，具有极强的螯合能力，可以与钙、镁、钾、钠、锌、铁、铜、锰等矿物质形成不溶性的盐类，是影响多种矿物质吸收的最重要的因素。植酸在低pH时可与蛋白质分子的碱性基

18、团结合，络合蛋白质，抑制消化酶如胃蛋白酶、淀粉酶和胰蛋白酶的活性。所以植酸的存在使多种常量和微量元素的利用率下降，降低了蛋白质、淀粉、脂类物质等营养因子的消化吸收利用。植酸酶（phytases，myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases），是催化植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸（或盐）的一类酶的总称，系统名称为肌醇六磷酸酶，属于磷酸单脂水解酶，是一类特殊的酸性磷酸酶。饲料中添加植酸酶可以改良磷酸盐的生物利用率，减少无机磷的添加，缓解了我国磷资源缺乏，磷供应不足的局面；消除植酸的抗营养作用，增加了钙、镁、锌、锰、铜和铁的生物利用率，促进了动物对蛋白

19、质、氨基酸及碳水化合物的消化吸收；减少磷在环境中的排泄，由此降低农业生态的负担，减缓水生环境的富营养化。目前全世界己公认，要提高饲料中植酸磷的利用率，减少猪、禽粪便中植酸磷对环境的污染，降低植酸磷对其它微量元素及蛋白质利用率的影响，应用植酸酶是一种有效的方法。目前，已经分离出的产植酸酶细菌相对较少，主要有：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），大肠杆菌（Escherichia coli），假单胞菌（Pseudom onas），克雷伯氏菌（Klebsiella）等。而其中较多研究的则是枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。自然界中产植酸酶的真菌种类很多，目前已有超过200株产植酸酶的丝状真菌被分

20、离到，多数属于曲霉（Aspergillus），毛霉（Mucor），青霉（Penicillum）和根霉（Rhizopus），大多分离的菌株均有较高的酶活，其中最活跃的产酶菌株是黑曲霉（A.niger），而无花果曲霉（A.ficcum）的产酶效率最高。其它曲霉如A.amstelodami，白曲霉（A.candidus），黄曲霉（A.flavus），和A.repens所产胞外酶活性也相当高。一般而言，丝状真菌植酸酶是胞外酶，容易分离提纯，而细菌植酸酶往往是胞内酶（除B.Subtilis和肠杆菌属Enterobacter外）。相对于细菌和丝状真菌，酵母菌植酸酶的报道很少，主要是啤酒酵母（Sacchar

21、omyces cerevisiae）和Schwanniomyces castellii，其中S.castellii的产酶活性在酵母菌中较高。国外对植酸酶的研究较早，已经推出了一些商品化的植酸酶制剂。据报道，最近欧共体推出了当前启用的3种植酸酶制剂：荷兰Gise-Brocades公司推出的“自然磷”（Nahinhas），其特点是对热稳定，且在碱性和酸性条件下均具活性；美国Allzeech公司推出的“澳吉美”植酸酶（Allxyme phytase），是一种黑曲霉发酵产物，其对热和pH稳定性较好；芬兰 Aldo Biotechnolog公司推出的诸多酶系列，如多酶SP、TP、SF等，除节省磷外，还可

22、提高纤维素和植物蛋白的利用率。我国目前对植酸酶的研究正进入高潮，先后有山东大学、华中农业大学、无锡轻工业大学、中国农科院饲料研究所、四川省食品发酵设计院、河南大学、山东农业大学等众多单位进行了这方面的研究，并取得了阶段性的成果。虽然目前我国对植酸应用的研究正进入高潮，并已取得了阶段性的成果。然而，目前对于植酸酶的应用还存在很多问题。首先，植酸酶在天然材料中表达水平太低，难以大量生产及生产成本过高；其次，天然植酸酶的一些性质不能完全适合饲料加工和养殖业的要求，如：抗逆性、在动物体内的有效性等，尤其是热稳定性。虽然现在有大量产植酸酶的微生物被报道，但是嗜热、耐酸、高活性并能够催化多种底物反应的植酸

23、酶仍然没有出现。由于目前植酸酶的产量低、成本高，还无法广泛应用于市场。但是，随着不同微生物表达系统的完善，植酸酶的成本会越来越低。产酶条件和酶学性质是植酸酶应用的基础，本实验专题在对菌株进行鉴定的基础上，针对培养基碳源、氮源、无机盐、接种量、装液量、pH值、培养温度等产酶条件进行了优化，为今后进一步研究和应用打下了良好的基础。实验2-1 产植酸酶黑曲霉的分离一、实验目的1. 掌握从自然界分离目的菌种的基本方法。2. 从土壤中取样分离产植酸酶黑曲霉菌株。二、实验原理植酸即肌醇六磷酸酯。植酸及其盐类是植物中磷的主要贮存形式，其贮存着植物总磷的60%90%。在营养研究中，发现植酸具有比较明显的抗营养

24、作用，且不被人和单胃动物所利用，最终绝大部分从粪尿中排出体外，造成环境的磷污染。植酸酶是催化植酸及其盐类水解成肌醇与磷酸的一类水解酶的总称。植酸酶可将饲料或食品中的植酸及其盐分解成肌醇和磷酸，增加可利用磷的含量，抑制植酸对矿物质和蛋白质的亲和力，解除植酸的抗营养作用。植酸酶广泛存在于小麦、大麦、玉米等植物的种子中，但含量较低。细菌、酵母和丝状真菌等也是植酸酶的重要来源。本实验利用选择培养基（透明圈法），从土样中筛选分离植酸酶的黑曲霉菌种。三、实验试剂与仪器1. 土壤样品 采集自稻米加工厂堆积米糠或谷壳处的土壤，或将少量谷壳和麸皮埋入土壤中2个月后取土样。2. 培养基 （1）1%脱氧胆酸钠溶液。

25、（2）氯霉素注射液或氯霉素眼药水。（3）筛选培养基 0.2%植酸钙（没有植酸钙，可用0.14%植酸代替，用饱和氢氧化钙溶液调pH5.5即可）、 3%葡萄糖、 0.5%NH4NO3、0.05%KCl、 0.05%MgSO47H2O、 0.003%MnSO44H2O、 0.003%FeSO47H2O、 2%琼脂、 pH5.55.7。（1）、（3）分开灭菌，120122灭菌20min。3. 试剂与器皿培养皿、锥形瓶、试管、玻璃珠、涂棒、移液管、接种铲、无菌水等。四、实验步骤 1. 将灭菌好的培养基（3）按每L加（1）号液20mL，加（2）液若干，使最终每L含氯霉素50mg，摇匀，倒平板若干。2. 取

26、适量土样加到已灭菌好带有玻璃珠并加有1020mL无菌水的锥形瓶中，振摇几分钟。3、用无菌移液管吸取0.5ml左右2样加到已凝固好的平板上，然后涂布均匀，于2830培养箱中倒置培养37 d。五、作业1、每天观察菌落生长情况。2、观察菌落特征和透明圈大小。3、绘制菌落形态和计算dH/dC。六、思考题1. 你所培养的平板有没有可能得不到菌落？如果没有得到菌落，怎么办？2. 平板中加入1%脱氧胆酸钠溶液有何作用？3. 氯霉素注射液或氯霉素眼药水为何不需要灭菌，加入有何作用？附：产植酸酶黑曲霉富集培养方法1. 选择性增菌培养基2%植酸、0.2%NH4NO3、0.1%K2HPO43H2O、0.05%KCl、0.05%MgSO47H2O、0.002%CaCl2 、0.001%MnSO44H2O、0.001%FeSO47H2O，用NaOH溶液调节pH5.55.7，250mL锥形瓶每瓶装量50mL，然后于120122灭菌20分钟。2. 操作将采集的土样制成悬液并经玻璃珠打散后（操作方法同前），静置片刻，取上清液约5mL，加到含有50mL增菌培养液的250mL锥形瓶中，于30、160r/min振荡培养35d，从第3d起每天取0.5mL左右涂布一个平板，于2830培养箱中倒置培养35 d，重复该操作共3 d。