ESRlIVS1-401位点rSNP的鉴定及其在慢性HBV相关肝病中的意义.doc

《ESRlIVS1-401位点rSNP的鉴定及其在慢性HBV相关肝病中的意义.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《ESRlIVS1-401位点rSNP的鉴定及其在慢性HBV相关肝病中的意义.doc（14页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流ESRlIVS1-401位点rSNP的鉴定及其在慢性HBV相关肝病中的意义.精品文档.ESR1 IVS1 - 401位点rSNP的鉴定及其在慢性HBV相关肝病中的意义晏泽辉 邓国宏 谭文婷 但芸婕 陈文 汤影子 周霞 王小红 毛青 王宇明*第三军医大学西南医院全军感染病研究所 400038 重庆*通讯作者：王宇明教授, Email：wym417 , 电话：023-68754858背景：我们前期在群体水平和流行病学角度证实了ESR1基因外显子1 T29C多态性与慢性HBV感染及慢性HBV感染相关肝病存在显著遗传关联，且T29C杂合子个体的ESR

2、1 mRNA转录本中，两种等位的表达存在差异。但阳性关联的T29C位点为同义SNP位点，其本身不具有功能意义。可能存在与外显子1 T29C位点连锁不平衡的调控区SNP（rSNP）位点，连锁不平衡分析和生物信息提示，ESR1内含子1（IVS1） T-401位点与外显子1 T29C强烈连锁且存在核蛋白结合位点。鉴定此ESR1 IVS1 T-401位点rSNP的功能，对揭示ESR1基因多态性在慢性HBV感染相关肝病中的作用具有积极意义。方法：在我们收集的359名HBV感染相关急性肝衰竭(HBV-ALF)患者，464名HBV感染相关肝硬化(HBV-LC)患者和469例HBV感染无症状携带者(ASC)组

3、成的基于医院的病例-对照人群中，采用限制性片断长度多态性 (PCR-RFLP)和直接测序法对ESR1位点基因3个SNP（IVS1 T-401/C, T29C, A11940G）进行基因分型、连锁不平衡检测、单倍型分析和关联研究。综合采用荧光素酶报告基因试验、电泳移动漂移分析（EMSA）、单倍型等位特异性染色质免疫沉淀技术（HaploChIP）、位点特异性小RNA干扰（SiRNA）等手实验对阳性关联的ESR1 IVS1 -401T/C位点进行功能验证。结果：HBV感染相关ALF患者病例组和HBV感染相关LC患者病例组中IVS1 -401/C和29C的等位频率显著高于HBV感染无症状携带者疾病对照

4、组 (HBV-ALF vs ASC：P = 3.710-4，HBV-LC vs ASC：P = 2.110-5)。经非条件逻辑回归校正年龄、性别等因素后，在显性模式下，IVS1 T-401/C和T29C两个SNP位点与HBV相关急性肝衰竭以及HBV相关肝硬化显著关联。和IVS1 -401T/C或T/T基因型个体相比，IVS1 -401C/C基因型的个体对HBV相关急性肝衰竭以及HBV相关肝硬化易感性显著升高(显性模式；HBV-ALF vs ASC：OR = 1.79, 95% CI = 1.54-2.12, P = 0.000；HBV-LC vs ASC：OR = 2.07, 95% CI =

5、 1.47-2.92, P = 0.000) 。功能实验在多个角度证实了与T29C位点连锁的IVS1 T-401C位点的可以通过结合核蛋白C-myb而发挥对ESR1表达的顺式调控作用；并且IVS1 T-401C位点的两个等位对核蛋白C-myb的结合能力存在差异，-401C等位对核蛋白C-myb的结合能力更强，表现出更强的增强子活性。结论：中国人群中，ESR1 基因多态性（IVS1 T-401/C和T29C）两个SNP与慢性HBV感染者发生急性肝衰竭和关肝硬化的遗传易感性相关。IVS1 -401C等位可能通过影响了ESR1表达（mRNA和蛋白水平）而增加了HBV相关肝衰竭和肝硬化发病的危险因素。

6、前言慢性HBV感染是遗传与环境因素相互作用的复杂疾病。近年来普遍认为宿主因素，尤其是宿主的遗传因素，在慢性HBV感染极其相关肝病的发病机制中起着极为关键的作用2，影响HBV感染和疾病进程的许多阶段3。探讨慢性HBV感染相关肝病的宿主遗传特征，将为我们从另一角度认识慢性HBV感染相关肝病及发病机制提供新的线索，并为临床防治提供新的、合理的策略，而以生物学功能相关基因作为候选基因进行病例-对照关联研究，是当前对复杂疾病进行遗传易感性研究的主要策略。ESR1在慢性HBV感染相关肝病的发生、发展及生存预后中均有重要作用，但其转录和表达存在显著的个体差异。顺式调控位点等位变异的功能影响是当前人类基因组研

7、究的重要内容。本课题组前期研究从群体水平和流行病学角度已经证实了ESR1基因外显子1 T29C多态性与慢性HBV感染及HBV感染相关肝细胞癌的遗传关联。并且发现T29C杂合子个体的ESR1 mRNA转录本中，两种等位的表达存在差异，C等位的表达量显著高于T等位。但T29C位点为同义SNP位点(Ser/Ser)，其本身不具有功能意义。可能存在与外显子1 T29C位点连锁不平衡的调控区SNP(rSNP)位点。初步分析和前期实验提示与T29C高度连锁的内含子1 IVS1 -401T/C SNP位点是最可能影响转录调控的功能位点。鉴定IVS1 -401位点的顺式调控作用，观察C/T等位变异对ESR1启

8、动子使用以及mRNA外显子缺失变异体产生的影响，对认识肝组织中ESR1表达调控个体差异的内在机制具有重要意义。本研究拟采用EMSA、荧光素酶报告基因试验(DLRA)、等位特异性染色质免疫沉淀(HaploChIP)、位点特异性RNA干扰(SiRNA)等手段，证实IVS1 -401位点的等位特异性顺式调控作用，以期深入认识ESR1基因rSNP在慢性HBV感染疾病进程中的功能和作用。研究对象，材料和方法：（略）主要结果：一、ESR1基因SNPs与HBV相关肝病的关联分析(一) 研究对象的临床的人口学资料前期建立的慢性HBV感染肝病标本数据库中无亲缘关系的359名的HBV相关肝衰竭患者(HBV-ALF

9、)、470名HBV相关肝硬化(HBV-LC)和469名无症状慢性HBV携带者(ASC)纳入本部分的研究。研究所用样本的简要社会人口学和临床资料见表2-1。在我们收集的基于医院收集的病例-对照队列中，ASC对照组的男性比例(54.2%)显著低于HBV-LC组(83.0%; 2=100.6; P =0.000)和HBV-ALF组(84.4%; 2=76.1; P =0.000)；饮酒指数上ASC对照组与HBV-LC组(2=45.8; P =0.000)以及HBV-ALF组(2=28.9; P =0.000)差异显著，这可能与两组之间在性别分布上差异显著有关，因为在中国饮酒主要以男性为主；ASC对照

10、组的年龄也显著低于HBV-ALF组(37.412.1 vs 41.0 12.6; P = 0.000)和HBV-LC组(37.412.1 vs 43.011.82; P =0.000)；HBeAg 阳性率在ASC组与HBV-LC组(2=0.375; P =0.541)以及HBV-ALF组(2=1.819; P =0.177)均无明显差异。表2-7 病例对照人群的社会人口学和临床资料CharacteristicAsCHBV-LCHBV-ALF(n =469)(n =468)(n = 359)Gender, no. (%)Men254 (54.2)395 (84.4)298 (83.0)Women

11、215 (45.8)73 (15.6)61(17.0)Age (years), mean (SD)37.412.143.311.841.1 12.7Alcohol drinkers, no. (%) 82 (17.5)174(37.2)121 (33.7)HBsAgAll +All +All +Anti-HBs IgGAll -All -All -HBeAg positive, no (%)120(25.6)128(27.3)107(29.8)Anti-HBc IgGAll +All +All +TBil ( mol / L )13.5 4.3205.2 193.4321.1 166.1ALT

12、 ( IU / L )27.7 10.8284.0 426410.1 541.6注：“Drinker”定义为男性每周饮白酒40 g/week 或女性男性每周饮白酒20 g/week； AsC,无症状携带者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者 (二) 病例及对照标本的ESR1 SNPs分型 采用PCR-RFLP对对所有样本IL-10基因的3个SNP位点进行分型。其中随即选取5%的样本进行直接测序以验证PCR-RFLP方法分型的准确性，结果与测序结果完全吻合(图2-1至图2-5)。图2-6 IVS1 T-401C位点PCR- Pvu II-RFLP分 图2-7

13、 T29C位点的PCR- BamH I-RFLP分型图2-8 ESR1 A11940G位点的PCR- Alw26 I-RFLP分型图2-9 ESR1 IVS1-401T/C位点测序验证(三) ESR1基因3个SNP位点与HBV相关肝病的关联分析1. 分型结果的初步分析ESR1基因3个SNP位点在病例对照人群中分型结果显示(见表2-9)：ESR1 A11940G位点的基因型和等位频率在HBV感染ASC对照组和HBV相关ALF病例组(2=0.357; P =0.550)以及HBV相关LC病例组(2=1.439; P =0.230)之间均无明显差异；但是ESR1 IVS1 T-401C位点的基因型和

14、等位频率在HBV感染ASC疾病对照组和HBV相关ALF病例组(2=5.04; P =0.0246)以及HBV相关LC病例组(2=13.06; P =3.010-4)之间均差异显著；ESR1 T29C位点的基因型和等位频率在HBV感染ASC疾病对照组和HBV相关ALF病例组(2=7.22; P =0.0071)以及HBV相关LC病例组(2=20.69; P =5.410-6)之间均存在显著差异；HBV相关ALF组和LC组中-401C和29C 的等位频率显著高于HBV感染ASC对照组。与未携带有- T-401C和29C等位的个体相比，携带有-401C和29C等位的个体显著的增加了HBV相关ALF和

15、LC易感性。表2-9 病例组和对照组ESR1基因型和等位基频率分布及差异显著性Genotype/alleleAsCHBV-ALFHBV-LC(n = 469)(n =359)(n = 464)pvuII siteT/T, no. (%)166 (35.4)109(30.4)120 (25.9)T/C, no. (%)242 (51.6)182(50.7)251 (54.1)C/C, no. (%)61 (13.0)68(18.9)93 (20.0)T allele, no. (%)574(61.2)400 (55.7)491 (52.9)C allele, no. (%)364 (38.8)3

16、18 (44.3)437 (47.1)P Value 0.02463.010-4T29C6.9T/T, no. (%)228 (48.6)143 (39.8)158 (34.1T/C, no. (%)188 (39.7)160 (44.7)225(48.5)C/C, no. (%)55 (11.7)56 (15.6)91 (17.4)T allele, no. (%)642 (68.4)446 (62.1)541 (58.3)C allele, no. (%)296 (31.6)272 (37.9)387 (41.7)P Value 0.00715.410-6A252966GA/A, no.

17、(%)193 (42.9)135 (37.6)174 (37.5)A/G, no. (%)196 (43.6)184 (51.3)227 (48.9)G/G, no. (%)61 (13.5)40 (11.1)63 (13.6)A allele, no. (%)582 (64.7)454 (63.2)575 (62.0)G allele, no. (%)318 (35.3)264 (36.8)353 (38.0)P Value 0.55000.2302注： AsC，无症状携带者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者；P值由22四格表c2 检验给出，AsC组为

18、对照。2. 阳性关联位点的非条件logisitic回归分析和分层分析经非条件logistic回归校正年龄、性别、饮酒指数等因素后，在显性模式下，ESR1 IVS1 T-401C和T29C两个SNP位点与HBV相关急性肝衰竭和肝硬化显著关联(见表2-10)。和-401T/C或T/T基因型个体相比，-401C/C基因型的个体对HBV相关ALF和LC的易感性显著升高(共显性模式：HBV-ALF，OR = 1.36, 95% CI = 1.09-1.70, P = 0.0061；HBV-LC，OR = 1.48, 95% CI = 1.12-1.83, P = 0.0004) 。和29T/C或29T/

19、T基因型个体相比，29C/C基因型的个体对HBV相关ALF和LC的易感性显著升高(共显性模式：HBV-ALF，OR = 1.29, 95% CI = 1.05-1.61, P = 0.0160；HBV-LC，OR = 1.48, 95% CI = 1.52-1.87, P = 0.0001)。同时,我们对这两个位点进行了年龄(40岁和40岁)和性别分层分析，结果显示(见表2-11)：ESR1 IVS1 T-401C和T29C的等位频率分布没有年龄、性别差异，基因型分布在病例对照之间的差异仍然显著。表2-10 ESR1阳性关联位点与HBV相关肝病的非条件logisitic回归关联分析ESR1 I

20、VS1 T-401CESR1 T29CALF vs AsC LC vs AsC ALF vs AsC LC vs AsC Dominant model(TT+TC/CC)P value0.01130.01590.09870.0357OR (95% CI) 1.70(1.13-2.56)1.62(1.09-2.40)1.44(0.93-2.22)1.55(1.03-2.34)Recessive model(TT/TC+CC)P value0.04670.00120.02440.0000OR (95% CI) 1.37(1.01-1.88)1.66(1.22-2.67)1.41(1.05-1.89

21、)1.83(1.38-2.46)Co-dominant model(TT/TC/CC)P value0.00610.00040.01600.0001OR (95% CI) 1.36(1.09-1.70)1.48(1.19-1.83)1.29(1.05-1.61)1.52(1.24-1.87)注：AsC，无症状携带者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者； Dominant model, 显性模式；Recessive model，显性模式；Co-dominant model，共显性模式；P值采用非条件logisitic回归分析统计方法校正年龄、性别等因素的影响

22、给出；OR(odds ratio)：相对风险度；CI(confidence intervals)95%的置信区间。表2-11 ESR1阳性关联位点与HBV相关肝病的关联分层分析ESR1 IVS1 T-401CESR1 T29CAsCHBV-ALFHBV-LCAsCHBV-ALFHBV-LCMen only.n=254n=298n=392n=254n=298n=392TT98(38.5)94(31.5)101(25.7)120(47.2)120(40.3)136(34.7)TC129(50.7)149(50.0)206(52.6)108(42.5)132(44.3)186(47.4)CC27(1

23、0.6)55(18.5)85(21.7)26(10.3)46(15.4)70(17.9)T allele325(64.0)337(56.5)408(52.0)348(68.5)372(62.4)458(58.4)C allele183(36.0)259(43.5)376(48.0)160(31.5)224(37.6)326(41.6)P Value 0.0122.310-50.0342.610-4Women onlyn=215n=61n=72n=215n=61n=72TT68(31.6)15(24.6)19(26.4)108(50.3)23(37.7)22(30.6)TC114(53.0)34

24、(55.7)45(62.5)79(36.7)29(47.5)39(54.2)CC33(15.4)12(19.7)8(11.1)28(13.0)9(14.8)11(15.3)T allele250(58.1)64(52.5)83(57.6)295(68.6)75(61.5)83(57.6)C allele180(41.9)58(47.5)61(42.4)135(31.4)47(38.5)61(42.4)P Value 0.2630.9160.1390.016Age 40 yn=175n=166n=255n=175n=166n=255TT52(29.7)54(32.5)70(27.5)85(48.

25、6)71(42.8)91(35.7)TC106(60.6)83()50.0129(50.6)72(41.1)74(44.6)120(47.1)CC17(9.7)29(17.5)56(22.1)18(10.3)21(12.7)44(17.3)T allele210(60.0)191(57.5)269(52.7)242(69.1)216(65.1)302(59.2)C allele140(40.0)141(42.5)241(47.3)108(30.9)116(34.9)208(40.8)P Value 0.5120.0350.2570.003Age 40 yn=294n=193n=209n=294

26、n=193n=209TT106(36.1)55(28.5)50(23.9)143(48.6)72(37.3)67(32.1)TC145(49.3)99(51.3)122(58.4)115(39.1)86(44.6)105(50.2)CC43(14.6)39(20.2)37(17.7)36(12.3)35(18.1)37(17.7)T allele357(60.7)209(54.1)222(53.1)401(68.2)230(59.6)239(57.2)C allele231(39.3)177(45.9)196(46.9)187(31.8)156(40.4)179(42.8)P Value 0.

27、0420.0160.0063.410-4注：AsC，无症状携带者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者；P值由22四格表c2 检验给出，AsC组为对照。 3. ESR1基因启动子区3个SNP位点连锁不平衡检测通过LDA软件分析ESR1基因3个SNP位点连锁不平衡情况，得到如下结果：ESR1 T29C与IVS1 T-401C，D=0.734， r2 =0.4248，Q value=0.924；ESR1 T29C与A11940G，D=0.154， r2 =0.024，Q value=0.315；ESR1 IVS1 T-401C与A11940G， D=0.0999

28、， r2 =0.0078，Q value=0.182；提示ESR1基因T29C与IVS1 T-401C位点存在强烈的连锁不平衡。4. ESR1基因启动子区3个SNP位点单倍型分析及关联研究单倍型分析提示ESR1基因T29C与IVS1 T-401C两个SNP位点仅存在四种单倍型(29T-IVS1T、29T-IVS1 C、29C-IVS1 T、29C-IVS1C)。初步统计分析(见表2-12)表明：四种单倍型的单倍型频率在HBV无症状携带对照组和HBV相关ALF组(2=7.86; P =0.049)以及HBV相关LC组之间差异分布显著(2=21.75; P=7.3510-5)。分别以单倍型29T-

29、IVS1或29C-IVS1C为标准，将HBV感染相关性急性肝衰竭患者病例组和HBV感染无症状携带对照组中单倍型29T-IVS1T和29C-IVS1C的携带情况分别进行非条件logisitic回归分析，校正年龄、性别等因素后，在共显性模式下，单倍型29T-IVS1T以及29C-IVS1C与HBV相关急性肝衰竭显著关联(见表2-13)。和29T-IVS1T /-或-/-单倍型个体相比，29T-IVS1T /29T-IVS1T单倍型的个体对HBV相关LC(OR =1.52, 95% CI =1.24-1.88, P =0.0001)和(OR =1.35, 95% CI =1.10-1.67, P =

30、0.0051)ALF易感性显著降低。和29C-IVS1C /-或-/-单倍型个体相比，29C-IVS1C /29C-IVS1C单倍型的个体对HBV相关LC(OR =1.51, 95% CI =1.21-1.90, P =0.0003)和(OR =1.32, 95% CI =1.04-1.66, P =0.0187)ALF易感性显著增高。表2-12 ESR1基因单倍型与HBV相关肝病之间的关联分析HaplotypeAsCHBV-ALFHBV-LC2n=9382n=7182n=92829T-IVS1 T536(57.1)365(50.8)442(47.6)29T-IVS1 C108(11.5)82

31、(11.5)100(10.8)29C-IVS1 T39(4.2)36(5.0)50(5.4)29C-IVS1C255(27.2)235(32.7)336(36.2)27.8621.75P Value 0.0489997.3510-5注：AsC，无症状携带者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者；P值由24列联表c2 检验给出表2-13 ESR1基因单倍型与HBV相关肝病之间的的非条件logisitic回归关联分析AsCHBV-ALFHBV-LC2n=9382n=7182n=92829T-IVS1T/29T-IVS1T(TT/TT)146(31.1)97(27

32、.1)104(22.4)29T-IVS1T/-( TT/-)244(52.1)171(47.6)234(50.4)-/-79(16.8)91(25.3)126(27.2)2 tests29.1218.02P Value 0.0104831.2310-4Dominant modelP Value0.00230.0009OR (95%CI)1.77(1.23-2.56)1.82(1.28-2.58)Recessive modelP Value0.10660.0014OR (95%CI)1.31(0.94-1.81)1.69(1.22-2.32)Co-dominant modelP Value0.0

33、0510.0001OR (95%CI)1.35(1.10-1.67)1.52(1.24-1.88)29C-IVS1C/29C-IVS1C (CC/CC)37(7.9)33(9.2)48(10.4)29C-IVS1C/-(CC/-)181(38.6)169(47.1)240(51.7)-/-251(53.5)157(43.7)176(37.9)2 tests27.8222.84P Value 0.0200271.1010-5Dominant modelP Value0.01160.0000OR (95%CI)1.46(1.08-1.96)1.83(1.38-2.44)Recessive mode

34、lP Value0.38360.3758OR (95%CI)0.79(0.46-1.34)0.80(0.48-1.32)Co-dominant modelP Value0.01870.0003OR (95%CI)1.32(1.04-1.66)1.51(1.21-1.90)注：AsC，无症状携带者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者；“-” 表示其他非ATA单倍型；P值由23列联表c2 检验给出；Dominant model, 显性模式；Recessive model，显性模式；Co-dominant model，共显性模式；P值采用非条件logisitic

35、回归分析统计方法校正年龄、性别等因素的影响给出；OR(odds ratio)：相对风险度；CI(confidence intervals)95%的置信区间。二、ESR1 IVS1 - 401T/C位点的荧光素酶报告基因实验将构建好的pGL3-IVS1 -401 TT或CC的不同长度pGL3系列重组载体荧光素酶报告基因质粒单独转染或与c-myb表达质粒pcDNA-c-myb共转染HepG2细胞，转染24 h后分别测定期荧光素酶活性。Firefly荧光素酶(F值)与Renilla荧光素酶 (R值)比值为每孔荧光素酶比值，将每孔比值除pGL3-Promoter空质粒得到荧光素酶的相对活性。结果提示：

36、在HepG2细胞中，这两种等位片断重组pGL3-Promoter载体荧光素酶活性较pGL3-Promoter空载体明显增强(p0.05)，-401C pGL3-Promoter重组载体荧光素酶表达量显著高于-401T pGL3-Promoter重组载体(p0.05)，提示-到这个片断具有增强子功能。但不同等位片断启动子活性存在差异。结果发现IVS1 -401 C等位存在能显著提高pGL3-promoter的荧光素酶活性，IVS1 -401 C表明出增强子活性，且c-myb表达质粒共转染提高了IVS1 -401 C的增强子活性(图4-10，图4-11，图4-12，图4-13)。图4-10 pGL

37、3-Promoter-IVS1 -40I T/C不同等位载体与pGL3-Promoter空载体的荧光素酶活性比较图4-11 pGL3-Promoter-IVS1-401C /T 不同等位载体与pcDNA3-C-myb质粒共转染与pGL3Promoter空载体的荧光素酶活性比较图4-12 pGL3-Promoter-IVS1-401C /T 不同等位载体单独或共转染pcDNA3.0-C-myb与pGL3-Promoter空载体的荧光素酶活性比较图4-13 pGL3-Promoter-IVS1-401C等位载体单独或共转染pcDNA3.0-C-myb与pGL3-Promoter-IVS1-401T

38、等位载体的荧光素酶活性比较三、ESR1 IVS1 - 401T/C位点的EMSA分析1. 交叉抑制EMSA我们所用的核蛋白来源于雌激素诱导2h的HepG2细胞。交叉抑制EMSA结果见图4-14，结果显示： ESR1 IVS1 -401C、-401T等位探针均可见有一条结合带(箭头所指)，C等位探针与核蛋白的结合能够被C、T两种冷探针所竞争抑制 (泳道3，5)，同样T等位探针与核蛋白的结合也分别被T、C冷探针竞争抑制(泳道7、9)，提示针对IVS1 -401C/T位点的两种等位特异性探针与核蛋白结合是特异的,且两种等位的所结合的核蛋白的种类相同。通过Quantity One分析，C、T等位探针与

39、核蛋白的结合量存在差异，C等位与核蛋白结合量约为T等位的2.3倍。提示IVS1-401C/T的两种等位特异性探针对核蛋白的结合量存在差异，C等位的结合能力强于T等位。图4-14 ESR1 IVS1-401C/T位点EMSA交叉抑制分析2. 超漂移EMSA为鉴定探针结合核蛋白是否为预测的C-myb，我们在结合体系中先加入C-myb单抗孵育，再加入标记探针，观察加C-myb单抗后是否会出现核蛋白-探针结合带的超漂移。结果显示(图4-15)： ESR1 IVS1-401C、-401T等位探针，均可见有一条结合带(Complex箭头所指)，-401C、-401T 等位探针与核蛋白的结合能够被相应的冷探

40、针所竞争抑制，提示针对ESR1 IVS1-401C/T位点的两种等位特异性探针与核蛋白结合是特异的。泳道4、8分别为预先加入C-myb单抗孵育的IVS1-401C、-401T等位探针，均可见有一条“核蛋白-探针”的结合带 (Complex箭头所指)和一条“C-myb单抗-核蛋白-探针”结合带的超漂移带(Shift Band箭头所指)。 通过Quantity One分析，C、T等位探针与核蛋白-抗体复合物(超漂移带)的结合量存在差异，C等位与核蛋白结合量约为T等位的2.5倍。提示ESR1 IVS1-401C/T的两种等位特异性探针与核蛋白C-myb均有结合(还存在与其他的核蛋白的结合)，但两种等

41、位对核蛋白C-myb结合能力存在差异，C等位的结合能力强于T等位。图4-15 ESR1 IVS1-401C/T位点超漂移EMSA分析四、ESR1 IVS1 - 401T/C位点等位特异性染色质免疫沉淀(HaploChIP)1. ChIP ESR1 IVS1 - 401位点T/C杂合的CBMC细胞(11例)经培养24 h后，用-雌二醇刺激和甲醛处理使结合在DNA上的转录因子交联，提取细胞核，分别采用RNA多聚酶H14 mAb和 c-myb单抗，对超声打断的核染色质片断进行ChIP(mock样本采用无关的Anti-T Antigen pAb101对照抗体)，然后采用针对IVS1 401位点的特异性

42、PCR引物检测该区域是否有RNA多聚酶和(或)c-myb结合。免疫沉淀PCR定性检测结果表明，ESR1 IVS1 401T/C 位点附近(-672.-至-38之间)无RNA多聚酶结合，但存在c-myb结合(图4-16)。图4-16 IVS1 401位点的特异性的ChIP定性结果检测2. c-myb等位特异性结合量的检测 c-myb单抗ChIP片段用MGB-TaqMan荧光定量PCR技术方法检测活体状态下IVS1 - 401位点T和C等位myb结合量的差异；两种等位特异性ChIP沉淀产物定量结果显示(图4-17)，11份杂合子细胞中， C等位的沉淀量显著高于T等位(C /A等位，平均比值为1.8

43、9)，提示活体状态下，细胞内ESR1 IVS1 - 401位点T和C等位对c-myb结合能力存在差异，C等位的结合量显著高于T等位。图4-17 11例ESR1 IVS1-401T/C杂合子细胞的等位特异性ChIP鉴定结果五、ESR1 IVS1 - 401T/C位点等位特异性RNA干扰1等位特异性RNA干扰载体的构建 按照干扰靶序列合成回文DNA寡核苷酸(目标序列：IVS1 401TT干扰靶序列：5-tgtcccagctgttttatgc-3；IVS1 401CC干扰靶序列：5-tgtcccagccgttttatgc-3)，5端和3端分别引入BamH I和Hind III酶切位点，克隆至pRNA

44、T-U6.1/Neo干扰载体。构建好的T和C两种等位特异性RNA干扰载体经过测序验证无误(图4-18)，可以用于后续的RNA干扰实验的细胞转染。图4-18 ESR1 IVS1 - 401T/C位点等位特异性RNA干扰载体测序验证2等位特异性RNA干扰载体转染 利用脂质体2 000将构建好的ESR1 IVS1 - 401 T和C两种等位特异性RNA干扰载体分别转染ESR1表达阳性的IVS1 - 401CC和TC基因型的HepG2、 293细胞株，Skov3细胞株，G418筛选稳定转染的细胞。荧光显微镜下显示细胞转然后生长状态良好，荧光强度亮，可稳定表达pRNAT-U6.1/Neo干扰载体自带的绿

45、色荧光蛋白(图4-19)，说明干扰效果理想。图4-19 三种不同基因型细胞的pRNAT-U6.1/Neo-IVS1干扰载体转染左图：HepG2细胞；中图： 293细胞；右图：Skov3细胞(荧光显微镜，200)3. mRNA转录水平检测等位特异性RNA干扰效果 采用Syber Green I 染料荧光定量PCR检测ESR1 mRNA与恒定表达的看家基因-action的mRNA的相对表达量，结果显示(图4-20)：在IVS1 - 401CC纯合的HepG2细胞株中，转染pRNAT/U6.1-CC干扰质粒的ESR1 mRNA 表达量降低了47%(p0.05)；在IVS1 401TC杂合的293细胞株中，转染pRNAT/U6.1-CC和TT干扰质粒的ESR1 mRNA 表达量分别降低了