TORCH产前筛查现状及临床应用.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流TORCH产前筛查现状及临床应用发表时间：2010-09-02 发表者：皮肤科 (访问人次：1263)卫生部临床检验中心    程春玉，王露楠王露楠，研究员，博士，卫生部临床检验中心临床免疫室。多年来一直从事免疫学、分子生物学的质量控制和标准化研究工作。负责全国免疫学、病毒核酸室间质量评价工作的开展；研制了乙型肝炎病毒核酸和丙型肝炎病毒核酸国家标准物质。在病毒核酸检测标准化、室间质量评价、方法学、病毒核酸质评物的研制和检测系统的评价方面开展了较多的研究工作。在室间质量评价、标准物质的研制等方面发表论文多篇。TOR

2、CH一词最早由Nahmias等学者于1971年提出，它是一组病原微生物英文名称的首字母缩写，其中T（Toxoplasma gondii，Toxo）代表弓形虫，R（Rubella Virus，RV）代表风疹病毒，C（Cytomegalovirus，CMV）代表巨细胞病毒，H（Herpes Simplex Virus，HSV）代表单纯疱疹病毒，O（Others）指的是其他有关病毒如EB病毒、人免疫缺陷病毒（HIV）和人细小病毒B19等。这组微生物感染有着共同的特征，即可造成母婴感染，通过干扰遗传物质的稳定性产生致畸效应。孕妇在妊娠早期感染这些病原体，均可能导致胎儿流产、畸形、死胎、早产或发育不全等

3、。由于目前缺乏有效的治疗方法，对孕妇进行产前筛查和感染监测尤为重要。目前临床实验室TORCH检验主要包括免疫血清学和核酸检测，用于TORCH产前筛查的主要检测项目为检测各种病原体的抗体。因为普遍认为TORCH在孕期的原发感染与再发感染相比，更容易传染胎儿且对胎儿造成伤害的几率更大，所以产前筛查的目的也是为区分原发、复发及持续感染，为医生及时做出TORCH感染诊断和采取必要措施提供有力证据，以避免胎儿宫内发育迟滞、畸形、死胎、早产、流产、新生儿死亡等情况的发生。目前，我们国内医院在孕期筛查TORCH时只是初步检测IgM，在实验室检测过程、报告程序及结果解释方面还存在一定的问题。本文就国内医院检验

4、人员在临床应用过程中关心的一些问题，如TORCH的感染途径、孕前和孕中检测的选择、TORCH阳性结果的处理、如何判断孕中还是孕前感染、试剂质量评定及在TORCH检测中的影响因素等问题，作一简要概述和讨论。一、TORCH流行病学特点及致病特点弓形虫（Toxoplasma Gondii，TOXO）是人和动物共患的一种可寄生于细胞内的原虫，猫科动物是其终宿主。弓形虫感染呈世界性分布，欧美国家阳性率较高，我国相对较低。在弓形虫的传播中意义最大的是卵囊和包囊，其次是滋养体。传染途径有先天性和获得性两种。获得性感染指出生后从周围环境获得。可因吃入含有包囊的家畜、家禽的生肉、蛋类、乳类而感染，或卵囊污染了水

5、、食物或手而经口感染。直接与受染动物（其唾液、尿液、粪便中证实有弓形虫）接触，如玩舐、被咬伤、或屠宰时，都有直接感染之可能。此外，输血或器官移植也能传染。孕母感染时弓形虫可经胎盘至胎儿而致先天性弓形虫病。典型的先天性弓形虫病“三联征”包括脉络膜炎、脑内钙化灶形成、脑积水。隐匿型先天性弓形虫病亦较常见，出生时可无症状，而至数月、数年或至成人才出现神经系统或脉络膜视网膜炎症状。风疹病毒（Rubella Virus，RV）为RNA病毒，人是其唯一的自然宿主。RV通过呼吸道传播，人类对风疹病毒普遍易感，一般症状轻，预后佳。但妊娠早期（4个月内的）孕妇感染风疹病毒后，病毒可以通过胎盘传给胎儿引起先天性风

6、疹。典型的CRS三联征为先天性白内障、耳聋、心血管系统缺损。巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）是一种疱疹病毒组DNA病毒，呈全球性分布，对宿主或培养细胞有高度的种特异性，人巨细胞病毒（HCMV）只能感染人，在人纤维细胞中可进行体外培养。多数CMV感染者呈隐性感染，无临床症状，但在一定条件下可侵袭多个器官和系统产生严重疾病，其特征性病变为感染细胞增大，细胞核和细胞质内分别出现嗜酸性和嗜碱性包涵体。病毒可侵入肺、肝、肾、唾液腺、乳腺和其他腺体，以及多核白细胞和淋巴细胞，可长期或间隙地排出病毒，在唾液、乳汁、汗液、血液、尿液、精液、子宫分泌物中均含有CMV，故口腔、生殖道、胎盘、输

7、血或器官移植等均为其途径传播。先天性CMV感染主要表现为多系统多器官损伤，如黄疸、肝脾肿大、小头畸形、运动障碍、脉络膜视网膜炎、大脑钙化等，重症患儿可致死。无症状患儿留下长期的后遗症，如神经系统发育迟滞，耳聋。单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus，HSV）为双链DNA病毒，分为型和型，人是唯一的宿主。HSV在世界各地均有发生，其感染十分普遍。病毒经呼吸道、口腔、生殖器粘膜以及破损皮肤进入体内，潜居于人体正常粘膜、血液、唾液及感觉神经节细胞内。HSV-型主要引起上半身皮肤、口腔粘膜等处感染，经呼吸道传播；HSV-型主要引起生殖器感染，性接触为主要传播途径，并与胎儿先天性感染关系

8、密切。孕程早中晚期的首次感染对胎儿均有严重影响，可发生流产、先天畸形、发育迟缓、智力障碍、视网膜脉络膜炎等。这四种病原体先天感染的共同特点是，孕妇首次感染传染给胎儿的几率远远高于复发感染；怀孕早期（<20周左右）的首次感染给胎儿的风险以及对胎儿造成的伤害远远高于怀孕后期。二、TORCH检测方法、检验程序及结果解释TORCH的检测方法包括病原学检查（包括体液或活组织穿刺物涂片、组织切片、镜检和病原体的分离与培养），血清学检查（免疫荧光实验、免疫印迹实验、直接凝集实验、间接血凝实验、补体结合实验、酶联免疫吸附实验等检测抗原和抗体）和核酸检查（PCR）。常规免疫血清学检测项目包括特异IgM、I

9、gG、IgG抗体亲和力、IgA等，主要的检测方法为ELISA。目前，国内一些医院在孕期筛查TORCH时，部分检验人员对如何判断孕前还是孕中感染（即原发还是复发感染）以及出现TORCH阳性时该如何处理等问题比较关心。参照图（为妊娠期CMV检测程序示意图，其他项目也适用），可以了解到TORCH检测的一般程序，以及筛查结果的各种模式的解释。由图所示，孕期筛查IgM和IgG，通常会选择敏感性较高的试剂盒。结果有四种模式： IgG-IgM-表示未感染过；IgG+IgM-表示既往感染；IgG-IgM+和IgG+IgM+均有近期感染的可能性，需进一步确认。IgM的确认实验通常可采取重复检测、不同试剂盒复检以

10、及免疫印记法复检，以避免由检测引起的假阳性。确定IgM阳性后，并不能说明是近期感染，因为IgM还可出现于复发感染的情况，并且在某些情况下可持续存在。故真正判断近期感染与否，目前主要采用检测抗体亲和力的方法。其基本原理是，机体感染病原体后，初次免疫应答后产生的抗体，通常为低亲合力（有功能的亲和力），经过数周或数月后，经过亲和力成熟的过程，其与抗原的互补更好，而成为高亲合力抗体。在免疫测定中，临床标本中加入尿素或其他变性剂，则可测出可耐受及不能耐受尿素等变性剂作用的抗体，不能耐受的则为低亲合力抗体，该类抗体的出现反映的是急性或近期感染。此外，还可通过监测特异IgG的滴度变化来提供近期感染的证据，通

11、常认为如果前后两次对特异IgG进行检测，第2次检测较第1次检测的滴度上升4倍，则提示为近期感染，需进一步检测其他项目进行确认。孕母感染TORCH后传染给胎儿的风险性不同，例如孕母首次感染CMV后传染给胎儿的几率为35-40%，HSV-为70-85%。孕母血清学TORCH检测结果呈高传染性，还需进一步检测以判断该采取何种措施（治疗、引产或终止妊娠等），可包括以下几个方面的检测：病原体分离和培养，例如CMV可从尿液、唾液、脑脊液、羊水、疱疹液中分离得到，常接种于人的成纤维细胞，最短需7天才能出现可查见的细胞病变效应，即使病毒分离培养阴性也不能完全排除宫内感染；弓形虫从胎盘组织及婴儿组织中分离病原体

12、，常用小鼠接种培养法，需4-6周出现结果；HSV可取疱疹液、皮损处涂片，染色后发现典型的多核巨细胞与核内嗜酸性包涵体，有助于诊断。母体病毒血症评估：尿液PCR、血液PCR，可检测病原体在体内的复制情况。胎儿健康度评估：超声、MRI，检查胎儿是否出现畸形、脑积水、腹水、神经系统发育障碍等情况。侵入性检测：羊膜穿刺、脐穿刺进行IgG、IgM及定量PCR检测，以确定胎儿受感染情况。尽管血清学筛查结果阳性并不代表一定需要终止妊娠，但能够提示其危险性，提早采取措施，以避免新生儿各种先天性疾病的发生，对优生优育具有重大意义。三、TORCH国内检测现状及存在的问题目前国内在TORCH产前筛查中应用最广泛的是

13、ELISA方法的特异IgM，其次为IgG，个别实验室进行抗体亲和力的检测。经SFDA认证的IgG酶联免疫法相关试剂盒多为间接法，IgM有捕获法和间接法两种。而核酸检测方面，除CMV DNA以外，其余三项均没有经过国家食品药品监督管理局批准的商品试剂盒。我国自2002年开展TORCH室间质量评价项目以来，到目前为止，已有260余家医院参加此项活动。从室间质评情况看，国内在TORCH产前筛查中还存在一些问题。（一）检测程序方面：国内医院在孕期筛查TORCH时很多单位只是初步检测IgM，因为特异IgM呈ELISA阳性反应性，并不能说明被检者是否真正处于特定病原体的感染状态，故需要建立一个合适的检测程

14、序，图1是国外实验室进行TORCH筛查的程序，可以借鉴和参考。（二）ELISA检测方面：ELISA方法灵敏，特异性强不需要特殊设备，所以被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但ELISA测定中影响因素较多，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。这也是检验人员临床实际应用过程中比较关心且需注意的方面。以下就TORCH产前筛查中ELISA检测需注意的几个环节做一讨论。（1）标本的影响。标本的采集、处理、保存过程对ELISA检测结果的影响很大。溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISA方法检测易产生假阳性，因为红细胞或血红蛋白中的亚铁血红素具有过氧化物酶的性质，不易洗脱

15、干净，从而使应用过氧化物酶催化底物显色的试剂产生假阳性。被细菌污染的样本同溶血样本一样，禁用。抗凝剂和酶抑制剂对辣根过氧化物酶有影响，如肝素、EDTA、叠氮钠。血清样本的保存管材质对抗体含量有影响，现多使用真空采血管。保存温度和时间对检测有影响，近期检测-4保存，一周以后检测需-20冻存，复溶后需混匀。纤维蛋白原易产生假阳性，故血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清。（2）试剂的影响。目前TORCH经SFDA认证的商品试剂盒除了在方法学上不同（间接法和捕获法），在灵敏度和特异性方面亦存在一定差异，理想的试剂为灵敏度高，特异性好，批间和批内的精密度好，这也是评价试剂质量的标准，国外一些实验室

16、通过收集多种阴性样本（包括一定比例的含有干扰因素的样本）和阳性样本对市售试剂盒进行评价。在TORCH的IgM检测试剂中，通常认为在特异性方面捕获法较间接法高，在灵敏度方面较间接法低。但是一些资料显示，试剂质量不完全取决于方法学。间接法的影响因素包括特异IgG的竞争性抑制，使检测值降低或出现假阴性；IgM型类风湿因子（IgM-RF）或与特异IgG型自身抗体结合的IgM-RF，易产生假阳性；与细胞抗原反应的IgM型抗体，易产生假阳性。一般认为急性期特异IgM含量较高，而特异IgG相对较低，但在血清转化时期特异IgM和IgG含量差距变小，故常通过稀释和加入吸附剂（抗人IgG抗体）的方法降低特异IgG

17、和RF的干扰。但试剂吸附剂的含量和质量对检测结果影响很大。   捕获法在原理上面虽然可以排除特异IgG竞争性抑制的影响，但RF的影响仍较大，因为目前多采用病毒抗原与酶标鼠源性IgG抗体的混合物作为检测特异IgM的酶交联物，若IgM-RF与特异IgG结合，可产生假阳性；同时由于RF是变性IgG的抗体，可与Fc段结合，RF单独存在亦可直接与酶标IgG抗体结合，产生假阳性；抗IgM-RF与IgG型抗核抗体共同存在，易产生假阳性，这是因为某些抗核抗体与TORCH抗体具有交叉反应性，如CMV的UL55与U1-70K（U1 snRNP-70 kDa protein）同源；非特异性IgM

18、可竞争包抗链位点。捕获法也可以通过稀释和加入RF吸附剂来降低干扰。还可以使用单克隆的鼠源IgG酶标抗体、用重组抗原代替粗制病毒以及用切除Fc段后酶标F（ab）取代IgG的方法来提高捕获法的特异性。在选择试剂时，应注意方法学不同而引起的假阳性和假阴性问题。在临床实际应用中，通过分析和确认，避免报告错误结果误导医生和孕妇。（3）操作的影响。ELISA检测的操作相对简便，对操作技术要求不高，并且现在自动化仪器已逐渐取代手工操作。但在实际操作过程中，仍需要人员检验在编号、加样、温育、洗板、读值等重要环节多加注意，避免人为因素引起的错误结果。综上所述，TORCH感染对胎儿的影响比较复杂，并且缺乏有效的治

19、疗措施，产前筛查及对孕妇感染情况的监测是非常必要的。TORCH检测方法、检测项目颇多，目前尚不能依靠单一项目来明确诊断。TORCH产前筛查的目的是及早提示感染情况，准确的检测结果可为医生和孕妇采取何种措施提供有力证据。若临床实验室开展的检测项目单一、对结果解释不当，必然会造成错误的临床决策。目前国内TORCH检测尚缺乏标准化，无法对检测方法和检测过程进行质量控制，还需检验人员在临床实际应用过程中谨慎对待。主要参考文献Maria Grazia Revello and Giuseppe Gerna.Diagnosis and management of human Cytomega-lovirus

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