《53血红蛋白的提取和分离》课件(共32张PPT).ppt

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1、根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分分子的形状和大小、所带电荷的性质和多子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力亲和力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种类不同种类的的蛋白质。蛋白质。 大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖葡聚糖或琼脂糖或琼脂糖）构成的）构成的多孔多孔小球体，小球体，内部有许多贯内部有许多贯穿的穿的通道通道。琼脂糖：用琼脂为原料经加工精制的大分子凝胶琼脂糖：用琼脂为原料经加工精制的大分子凝胶 根据被分离物质的蛋白质根据被分离物质的蛋白质相对分子质量相对分

2、子质量的大小，利用具有的大小，利用具有网状结构网状结构的凝胶，来进行的凝胶，来进行分离。分离。分离蛋白质分离蛋白质相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢的通道，路程较长，移动速度较慢; ;相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。进行体外实验时，如何保证蛋白质不进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发生变性呢？会

3、发生变性呢？ 能够抵制能够抵制外界的酸和碱外界的酸和碱对溶液对溶液PHPH值值的影响，的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。 通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的中配制而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不不同同PHPH范围内范围内使用的缓冲液。使用的缓冲液。磷酸缓冲液磷酸缓冲液, ,成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠 如何证明色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？如何证明色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物大分子，如多肽、许

4、多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，下，这些基团会带上正电或负电。这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离中各种分子的分离。琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺

5、聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。 1 1、在测定蛋白质分子量时常用、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸十二烷基硫酸钠（钠（SDSSDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,NN,N- -亚甲基双丙亚甲基双丙烯酰胺在烯酰胺在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联成的的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。具有三维网状结构的凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙

6、烯酰胺凝胶中的迁移率取决蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 。由几条肽链组成。由几条肽链组成的蛋白质复合体在的蛋白质复合体在SDSSDS的作用下会的作用下会，因此测定的结果只是因此测定的结果只是。SDSSDS能与各能与各种蛋白质形成种蛋白质形成，SDSSDS所带负电荷所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子的量大大超过了蛋白质分子。因而掩。因而掩盖了盖了，使电泳迁移率完，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。全取决于分子的大小。用用SDSSDS测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法样品处理样品处理粗分离粗分离纯化

7、纯化纯度鉴定纯度鉴定（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤血血每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素亚铁血红素基团，基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧一分子氧或一分子二氧化碳，或一分子二氧化碳，血红蛋白血红蛋白因含有因含有血红素血红素而呈而呈红色。红色。 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。分离纯化，洗涤次数不可过少。1 1、采集血样。、采集血样。2 2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分

8、离的效果）3 3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.90.9的氯的氯化钠溶液洗涤。化钠溶液洗涤。5 5、低速离心（低速短时间）、低速离心（低速短时间）6 6、重复、重复4 4、5 5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。表明洗涤干净。（二）操作过程（二）操作过程(2)(2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加4040体积的甲苯体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌，置于磁力搅拌器上充分搅拌1010分

9、钟（加速细胞破裂）分钟（加速细胞破裂）, ,细胞破裂释放出血红蛋白。细胞破裂释放出血红蛋白。将搅拌好混合液转移到离心管内，以将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min2000r/min的速度离心的速度离心10 min10 min。第第1 1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第第2 2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色）；层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色）；第第3 3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色) )；第第4 4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。用滤纸过滤，除去脂

10、溶性沉淀层，于分液漏用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有透析袋放入盛有300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212小时。小时。 除去样品中分子量较小的杂质。除去样品中分子量较小的杂质。 取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨两端需用砂纸磨平。平。底塞的制

11、作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆覆盖尼龙网，再用盖尼龙网，再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管的目尼龙纱包好，插到玻璃管的一一端端。：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。不彻底。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：。组装：将上将上述三者按相应位置组装成一个整体述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。A A、材料：交联葡聚糖凝胶（、材料：

12、交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）。）。B B、代表意义：、代表意义：“G G”表示凝胶的交联程度，膨表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围胀程度及分离范围。7575表示凝胶的得水值，即表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水每克凝胶膨胀时吸水7.57.5克。克。配置凝胶悬浮液：计算并称配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。溶胀后，配成凝胶悬浮液。A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻

13、敲动色谱柱，使凝胶谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。填装均匀。注意：注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。分离效果。装填完毕后，装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高的操作压下，用高的操作压下，用300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤平衡）充分洗

14、涤平衡1212小时。小时。1 1、液面不要低、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质流动与最终生物大分子物质的分离效果。的分离效果。2 2、不能发生洗、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的脱液流干，露出凝胶颗粒的现象现象。打开下端出口，使柱内打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。绕

15、移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。加样后打开下端出口，加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口层后，关闭下端出口小心加入小心加入pH=7.0 的的20mmol/l的磷的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。打开下端出口进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端待红色的蛋白质接近色谱柱

16、底端时，用试管收集流出液，每时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构范围内，维持结构和功能正常。和功能正常。血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

17、实验操作。 鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。1.1.样品的处理样品的处理通过洗涤红细胞、血红蛋白通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液2.2.样品的粗分离样品的粗分离经过透析去除分子量较小经过透析去除分子量较小的杂质的杂质3.3.样品的纯化样品的纯化将相对分子将相对分子质量较大的杂质蛋白除去质量较大的杂质蛋白除去4.4.经经进行纯度鉴定。进行纯度鉴定。观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见教科书图（见教科书图5-185-18），），如果分层不明显，可能如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋

18、白的原因。是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。影响后续血红蛋白的提取纯度。1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？描述处理后的样品发生了哪些变化吗？2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质

19、，因此可以在由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，有色物质，例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。除不了时要重新装柱。 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。