中国科学院大学,生物单分子技术,张竹青,考试总结.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流中国科学院大学,生物单分子技术,张竹青,考试总结.精品文档.一.单分子技术单分子技术是指在单分子水平上对生物大分子的行为（包括构象变化、相互作用、相互识别等）进行实时动态检测以及在此基础上的操纵调控等，是纳米技术和分子生物物理学的自然延伸和必然趋势。生命单元的基本功能主要取决于单个大分子，单分子操纵方法在研究单个生物分子的性质上有着独特的优势。与测量分子集合体整体性质的传统方法(如光散射，光偏振，粘滞性等)相比，单分子技术具有直接，准确，实时等优点。主要的研究手段有两种：1。单分子光谱学（Single-molecule spectroscop

2、y 和Single-molecule FRET）2。单分子力谱（AFM和光镊）二荧光光谱荧光光谱先要知道荧光，荧光是物质吸收电磁辐射后受到激发，受激发原子或分子在去激发过程中再发射波长与激发辐射波长相同或不同的辐射。当激发光源停止辐照试样以后，再发射过程立刻停止，这种再发射的光称为荧光。1荧光光谱物体经过较短波长的光照，把能量储存起来，然后缓慢放出较长波长的光，放出的这种光就叫荧光。如果把荧光的能量-波长关系图作出来，那么这个关系图就是荧光光谱。荧光光谱当然要靠光谱检测才能获得。荧光光谱。高强度激光能够使吸收物种中相当数量的分子提升到激发量子态。因此极大地提高了荧光光谱的灵敏度。以激光为光源的

3、荧光光谱适用于超低浓度样品的检测，例如用氮分子激光泵浦的可调染料激光器对荧光素钠的单脉冲检测限已达到10-10摩尔/升，比用普通光源得到的最高灵敏度提高了一个数量级。荧光光谱有很多，如原子光谱1905年，Wood首先报道了用含有NaCl的火焰来激发盛有钠蒸气的玻璃管，并得到了D线的荧光，被Wood称为共振荧光。在Mitchell及 Zemansky和Pringsheim的著作里讨论了某些挥发性元素的原子荧光。火焰中的原子荧光则是Nichols和Howes于1923年最先报道的，他们在Bunsen焰中做了Ca、Sr、Ba、Li及Na的原子荧光测定。从1956年开始，Alkenmade利用原子荧光

4、量子效率和原子荧光辐射强度的测定方法，以及用于测量不同火焰中钠D双线共阵荧光量子效率的装置，预言原子荧光可用于化学分析。 1964年，美国的Winefordner和Vickers提出并论证了原子荧光火焰光谱法可作为一种新的分析方法，同年，Winefordner等首次成功地用原子荧光光谱测定了Zn、Cd、Hg。有色散原子荧光仪和无色散原子荧光仪的商品化，极大地推动了原子荧光分析的应用和发展，使其进入一个快速发展时期。荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧

5、光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。2原子荧光光谱的产生气态自由原子吸收光源的特征辐射后，原子的外层电子跃迁到较高能级，然后又跃迁返回基态或较低能级，同时发射出与原激发波长相同或不同的发射即为原子荧光。原子荧光是光致发光，也是二次发光。当激发光源停止照射之后，再发射过程立即停止。3原子荧光光谱的分类原子荧光可分为 3类：即共振荧光、非共振荧光和敏化荧光，其中以共振原子荧光最强，在分析中应用最广。共振荧光是所发射的荧光和吸收的辐射波长相同。只有当基态是单一态，不存在中间能级，才能产生共振荧光。非共振荧光是激发态原子发射的荧光波长和吸收的辐射波长不相同。非共振荧光

6、又可分为直跃线荧光、阶跃线荧光和反斯托克斯荧光。直跃线荧光是激发态原子由高能级跃迁到高于基态的亚稳能级所产生的荧光。阶跃线荧光是激发态原子先以非辐射方式去活化损失部分能量，回到较低的激发态，再以辐射方式去活化跃迁到基态所发射的荧光。直跃线和阶跃线荧光的波长都是比吸收辐射的波长要长。反斯托克斯荧光的特点是荧光波长比吸收光辐射的波长要短。敏化原子荧光是激发态原子通过碰撞将激发能转移给另一个原子使其激发，后者再以辐射方式去活化而发射的荧光。激光扫描共聚焦显微镜1激光扫描共聚焦显微镜简介仪器名称(中文)： 激光共聚焦显微成象系统激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning mi

7、croscope，CLSM）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量, 配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。2用途和信息主要用途： 1细胞及生物荧光样品观察分析。 2绿荧光蛋白分析。 3荧光原位杂交分析。 4光切片扫

8、描。 53D图像处理。6. 时间序列拍摄成像.仪器类别： 0304010104 /仪器仪表 /光学仪器 /显微镜 /研究生物显微镜指标信息： 1共聚焦 2多通道激光检测：例如氩离子激光器488nm，HeNe（G）激光器543nm，HeNe（R）激光器633nm等。 3点扫描。 4高分辨率。 5高清晰图像可达4096X4096Pixel。激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM)是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激光荧光探针，利用计算机进行图像处理，不仅可观察固定的细

9、胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。目前，激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用。3激光共聚焦显微镜的应用领域多重荧光影像 ( Multi-Color Fluorescence Imaging )3D 立体影像重建 ( 3D Reconstruction )3D 动态影像获取与分析 ( Dynamic 3D imaging )神经立体分布影像 ( 3D Neuron imaging )形态与

10、动态分析 ( Morphology )次微米单晶荧光影像技术 ( Nano-crystal )多重荧光蛋白影像技术 ( Multi-Color GFP Imaging )荧光共振能量转移 ( FRET or FLIM, FRAP ) )细胞离子流定量分析 ( Cellular Ion Concentration and Ratio Imaging )长时间影像记录 ( Time-Lapse Recording )Z轴扫描与测量 ( Z-section and measurement )基因影像分析 ( Genetic FISH imaging and quantification )染色体多重

11、荧光原色表现 ( Chromosome spectral analysis )活体胚胎研究 ( Embryo, Zebrafish / Drosophila embryo )穿透光影像 / 反射光影像材料表面分析 ( Surface and roughness analysis )材料显微硬度分析 ( Micro-Hardness analysis )晶园分析 ( Wafer analysis )薄膜分析 ( Thin layer analysis )4.共聚焦扫描显微镜的成像原理采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由

12、双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横切面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。由于焦

13、点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。把X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。激光共聚焦的工作原理简单表达就是它采用激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机控制来进行数字化图像采集和处理的系统。全内反射荧光显微镜1概念全内角反射荧光显微镜（total i

14、nternal reflection fluorescence microscope，TIRFM），利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200 nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标的，能帮助研究者获得高质量的成像质量和可靠的观测数据。故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。2光学原理当一束光从光密介质进入光疏介质时，根据斯涅耳定律一部分光会发生折射，而一部分光会发生反射，当入射角度不断增大，折射角也会不断增大，当折射角刚好达到90度时，就发生了

15、全反射现象。全反射发生后，折射光有一个临界状态沿着折射面传播，这部分光我们称之为隐失波，其能量在Z轴上呈现指数衰减。3技术分类TIRFM的实现是通过改变激光的入射角来实现的，按技术TIRF显微镜分为两种：棱镜型和物镜型。棱镜型TIRF显微镜采用棱镜产生衰逝波，并用物镜收集荧光成像。物镜型TIRF显微镜采用大数字孔径物镜产生衰逝波，同时采用物镜收集荧光成像。与棱镜型TIRF显微镜相比，物镜型TIRF的应用更为广泛。4优势将高清晰图像与使用简便的系统，以及广泛的宽视野显微镜应用相结合。研究者使用该显微镜除了可以完成从高速成像到TIRF的日常试验之外，还可以获得超清的影像。独特的全内反射荧光功能独特

16、的全内反射荧光功能可在多色实验过程中，通过改变波长以智能方式弥补穿透深度，对消散的视野方向进行全自动校准和选择，以确保获得质量最佳的全内反射荧光图像与可靠的实验数据。动态扫描仪动态扫描仪可精确定位激光束，并决定消散视野的准确穿透深度。缩短培训时间使用一些特殊的荧光软件如徕卡 AF7000 荧光软件可全面控制全内反射荧光系统，包括校准与所有显微镜功能，确保减少培训的时间以尽快投入到科学研究中。高级荧光工作站完全集成的全内反射荧光系统可与徕卡显微系统有限公司的高级荧光工作站结合使用，以在有多位用户的实验室中，满足各种成像需要。高质量图像联合全内反射荧光（TIRF）与快速荧光共振能量转移（FRET）

17、 分析技术，适用于细胞膜分析或单分子结构分析；小泡跟踪、荧光活细胞成像或延时成像与其它功能确保生成高质量的图像，从而显著提高了科学研究的结果。近场光学显微镜近场光学显微镜是采用亚波长尺度的探针在距离样品表面几个纳米的近场范围进行扫描成像的技术。如利用孔径在20-90nm的近场探针在样品上进行扫描而同时得到分辨率高于衍射极限的形貌像和光学像的显微镜。传统光学显微镜的分辨率受到光学衍射极限影响，分辨率不超过该波长尺度范围。与传统光学显微镜不同的是，近场光学显微镜利用亚波长尺度探针，可以得到更小分辨率。荧光共振能量转移当一个荧光分子（又称为供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（又称为受体分子） 的激

18、发光谱相重叠时， 供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光， 同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。FRET 程度与供、受体分子的空间距离紧密相关， 一般为710 nm 时即可发生FRET; 随着距离延长， FRET呈显著减弱。 供体和受体之间FRET的效率，可以由E=1/1+(R/R0)exp6反映，其中R表示供体和受体之间的距离，R0表示福氏半径，依赖供体发射谱和受体激发谱的重叠程度，以及供体和受体能量转移的偶极子的相对方位。1发生原理荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体 Donor）的发射光谱与另一个基团（受体 Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当这两

19、个荧光基团间的距离合适时（一般小于100），就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。简单地说，就是在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向受体转移的过程，此过程没有光子的参与，所以是非辐射的，供体分子被激发后，当受体分子与供体分子相距一定距离，且供体和受体的基态及第一电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应时，处于激发态的供体将把一部分或全部能量转移给受体，使受体被激发，在整个能量转移过程中，不涉及光子的发射和重新吸收。如果受体荧光量子产率为零，则发生能量转移荧光熄灭；如果受体也是一种荧光发射体，则呈现出受体的荧光，

20、并造成次级荧光光谱的红移。2发生条件能量供给体接受体（DA）对之间发生有效能量转移的条件是苛刻的，主要包括：(1)能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠；(2)能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列；(3)能量供体、能量受体之间必须足够接近，这样发生能量转移的几率才会高。此外，对于合适的供体、受体分子在量子产率、消光系数、水溶性、抗干扰能力等方面还有众多的要求。可见，要找到一个合适的DA对是很不容易的 。衍射极限衍射极限是指一个理想点物经光学系统成像，由于衍射的限制，不可能得到理想像点，而是得到一个夫朗和费衍射像。因为一般光学系统的口径都是圆形，夫朗和费衍射像就是所谓的艾里

21、斑。这样每个物点的像就是一个弥散斑，两个弥散斑靠近后就不好区分，这样就限制了系统的分辨率，这个斑越大，分辨率越低。这个限制是物理光学的限制，是光的衍射造成的。点列图是指在几何光学的成像过程中，由一点发出的许多条光线经光学系统成像后，由于像差的存在，使其与像面的交点不再集中于一点，而是形成一个分布在一定范围内的弥散图形。在点列图中利用这些点的密集程度来衡量光学系统的成像质量的方法称之为点列图法。利用点列图法来评价照相物镜等的成像质量时，通常是利用集中30%以上的点或光线所构成的图形区域作为其实际有效弥散斑，弥散斑直径的倒数为系统的分辨率。这个分辨率是由几何光学的像差限制的，没有考虑衍射效应。衍射

22、极限公式是sin=1.22/D。其中是角分辨率，是波长，D是光圈直径。当很小时，sin约等于tag，约等于d/f，其中d是最小分辨尺寸，f是焦距。推导出d/f=1.22/D。A=d/（1.22）。A是光圈f/值。当d等于成像元件像素点尺寸p时，A就是衍射极限光圈。DLA=p/（1.22），也就是：衍射极限光圈=像素尺寸/（1.22x光波波长）PALM和STORM如上所述，尽管单分子的定位精度可以达到纳米级，但它并不能提高光学显微镜在分辨两个或者多个点光源时的分辨率2002年，Patterson和Lippincott-Schwartz14首次利用一种绿色荧光蛋白(GFP)的变种(PA-GFP)来

23、观察特定蛋白质在细胞内的运动轨迹这种荧光蛋白PA-GFP在未激活之前不发光，用405nm的激光激活一段时间后才可以观察到488nm激光激发出来的绿色荧光德国科学家EricBetzig敏锐地认识到，应用单分子荧光成像的定位精度，结合这种荧光蛋白的发光特性，可以来突破光学分辨率的极限2006年9月，Betzig和Lippincott-Schwartz等2首次在Science上提出了光激活定位显微技术(photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM)的概念其基本原理是用PA-GFP来标记蛋白质，通过调节405nm激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下

24、稀疏分布的几个荧光分子，然后用488nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子在确定这些分子的位置后，再长时间使用488nm激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激活出来之后，分别用405nm和488nm激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环这个循环持续上百次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精确定位将这些分子的图像合成到一张图上，最后得到了一种比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微技术，如图1所示PALM显微镜的分辨率仅仅受限于单分子成像的定位精度，理论上来说可以达到1nm的数量级2007年，Betzig的研究小组更进一步将PALM技术应

25、用在记录两种蛋白质的相对位置15，并于次年开发出可应用于活细胞上的PALM成像技术来记录细胞黏附蛋白的动力学过程16PALM的成像方法只能用来观察外源表达的蛋白质，而对于分辨细胞内源蛋白质的定位无能为力2006年底，美国霍华德-休斯研究所的华裔科学家庄晓薇实验组开发出来一种类似于PALM的方法，可以用来研究细胞内源蛋白的超分辨率定位他们发现，不同的波长可以控制化学荧光分子Cy5在荧光激发态和暗态之间切换，例如红色561nm的激光可以激活Cy5发射荧光，同时长时间照射可以将Cy5分子转换成暗态不发光之后，用绿色的488nm激光照射Cy5分子时，可以将其从暗态转换成荧光态，而此过程的长短依赖于第二

26、个荧光分子Cy3与Cy5之间的距离因此，当Cy3和Cy5交联成分子对时，具备了特定的激发光转换荧光分子发射波长的特性将Cy3和Cy5分子对胶联到特异的蛋白质抗体上，就可以用抗体来标记细胞的内源蛋白应用特定波长的激光来激活探针，然后应用另一个波长激光来观察、精确定位以及漂白荧光分子，此过程循环上百次后就可以得到最后的内源蛋白的高分辨率影像，被他们命名为随机光学重构显微技术(stochasticopticalreconstructionmicroscopy,STORM)32007年，他们进一步改进STORM技术，发展了不同颜色的变色荧光分子对，可以同时记录两种甚至多种蛋白质的空间相对定位，从而阐明

27、笼形蛋白clathrin形成的内吞小泡与细胞骨架蛋白之间的精确空间位置关系，两种颜色的分辨率都可以达到2030nm17但是，STORM方法也存在缺陷，由于用抗体来标记内源蛋白并非一对一的关系，所以STORM不能量化胞内蛋白质分子的数量，同时也不能用于活细胞测量STORM 成像基础1 1单分子定位对物体成像虽然受限于显微镜分辨能力，但对于荧光分子定位分析只要有足够的光子数(N)被接收，分析荧光激发光子光强分布的中心可以实现高精度的粒子定位11。粒子中心在适当条件下，相当于单个染料分子的位置，能够以超过光学分辩能力的精度定位。主要的方法就是曲线拟合成高斯函数，也就是点扩散函数(PSF)，基本目的就

28、是寻找这个曲线分布的中心或平均值 = (x0，y0) 以及它的精度，即平均标准偏差 。每个染料粒子的中心可式中 C(x，y) 是 CCD 探测器像元间互相关函数;， 是接收光子的帧频数;I 为(x，y) 位置的光强度;K(i，j) 为光强分布的内核部分;s是内核像素的平均强度;T 为分析重心位置的阈值。粒子中心的定位精度，即平均标准偏差 与接收光子数量 N 图像探测器像元尺寸 a 背景的标准差 b (包括背景荧光噪声和探测器噪声)和 PSF的分布宽度(the full-width at half maximum，FWHF)si(标准差，k 为方向 x 或 y) 之间的关系，由 Thompson

29、 等人13给出了二维定位精度的结果，公式(3)为定位精度表达式。存在的问题和解决的途径目前，STORM 技术在成像上的横向分辨率可达20 nm 左右，虽然其分辨率已经远超过目前商用的各种显微成像系统，但还没有达到完美状态，即使对固定样本成像其分辨率也没有达到与电子显微镜相媲美的几个纳米的分辨能力。为了进一步提高STORM 成像的分辨率，一方面要开发出量子效率更高、荧光更稳定、颜色不同的荧光蛋白或荧光染料。此外，由于 STORM 显微镜每次定位一个荧光分子，即在采集一幅图像时只有一个荧光位置被采集，而且为了保证足够高的定位精度，要收集足够的光子数量，所以要对衍射极限内所有荧光都按照这样的程序成像

30、后重建出一幅完整的衍射极限内的图像，所需时间较长，大约要几分钟，只能研究固定的或时间分辨率要求不高的生物样品。由于生命现象是非静止的活动的本质，STORM 成像的时间分辨率是对细胞生物学的研究最大的障碍。因此，当前的研究热点集中在通过改变荧光探针和成像模式来进一步提高超分辨成像的时空分辨率，以便用于活细胞的研究。要解决这个问题还有较长的路要走。在目前的技术手段下，为了提高时间分辨率，一方面可以采用时分复用技术即在相同时刻，同时定位不同位置的荧光分子。另一方面，为了解决收集足够多的光子数量的问题，要开发新型的、高通亮的光可控开关荧光分子，使单位时间内激发地荧光光子数量大幅度提高，缩短光子采集时间

31、，还可以采用光中继来实现提高光子接收数量的问题24，具体方法如下:因为荧光信号具有一定的光谱宽度，而且波段大多集中在可见光和近红外波段，采用具有全谱带放大能力的拉曼放大对荧光光子进行放大比较理想，光纤拉曼放大器基于受激拉曼散射机制，以传输光纤作为增益介质，具有增益波长由抽运波长决定，噪声系数低，良好的宽带放大特性，可以对弱荧光进行放大提高光子输出的数量，消除了高帧频下接收光子数量少的问题，可以实现高时空分辨的成像。STORM成像技术单分子定位为获得亚衍射极限的空间分辨率提供可能，只要收集足够多的光子数量，一个单发射体（荧光分子）可以高精度地决定其中心位置。基于这个理论，在室温下获得1nm精度的

32、荧光成像技术已经被证明。但1nm定位精度不是直接转换为成像分辨率，因为多个靠近的发射体仍很难区分，这个问题可以用光可控开关技术来区分他们各自的信号18，但这些手段也只能在衍射极限范围内分辨25个荧光分子。若要分辨更多的荧光分子依然存在一定的挑战。Zhuang等人开发了一种新型的高分辨成像技术，随机光重建显微镜（STORM），使用不同颜色的光开关高精度的独立荧光分子重建得到荧光图像。STORM成像过程包括一系列的成像循环，在每个循环中视场中只有一部分荧光分子被激发，产生荧光发光，这个激活的荧光分子可以从其他未被激活的荧光分子中分辨出来，这些图像不重叠，这就可以使得这些荧光分子被高精度地定位。重复

33、多次这样的循环，每个荧光分子都随机地被激发，记录，所有的荧光分子位置信息再通过光学重建出来。STED不管是PALM还是STORM的超分辨率成像方法，其点扩散函数成像仍然与传统显微成像一致由于需要反复激活-猝灭荧光分子，所以使得实验大多数在固定的细胞上完成即使是在活细胞上进行的实验，其时间分辨率也较低162000年，德国科学家StefanHell开发了另一种超高分辨率显微技术，其基本原理是通过物理过程来减少激发光的光斑大小，从而直接减少点扩散函数的半高宽来提高分辨率当特定的荧光分子被比激发波长长的激光照射时，可以被强行猝灭回到基准态利用这个特性，Hell等开发出了受激发射损耗显微技术(stimu

34、latedemissiondepletion,STED)4其基本的实现过程如图2所示，就是用一束激发光使荧光物质(既可以是化学合成的染料也可以是荧光蛋白)发光的同时，用另外的高能量脉冲激光器发射一束紧挨着的、环型的、波长较长的激光将第一束光斑中大部分的荧光物质通过受激发射损耗过程猝灭，从而减少荧光光点的衍射面积，显著地提高了显微镜的分辨率STED成像技术的最大优点是可以快速地观察活细胞内实时变化的过程，因此在生命科学中应用更加广泛例如，应用成熟的STED显微成像技术发现，海马神经元上囊泡蛋白synatotagmin玉在各种刺激后都以一种“簇”的形式存在于神经突触前端膜上，这首次揭示了这种膜蛋白

35、以集合的形式存在于细胞质膜上然后被统一回收的方式之后Hell等又进一步发展了这种方法，使之可以用于EGFP标记的信号19和多种颜色的超分辨率检测20目前，STED作为一种成熟的方法，已经可以高速地监测活细胞内高分辨率图像例如在2008年Science上发表的文章表明，应用STED技术已经可以以视频的速度(每秒28帧)来采集记录神经细胞内突触小泡的高分辨率图像(50nm)目前，STED成像的主要缺陷在于光路复杂，设备昂贵，对系统的稳定性要求很高SSIM改变光学的点扩散函数来突破光学极限的另一个方法是利用饱和结构照明显微技术(saturatedstructureilluminationmicros

36、copy,SSIM)早在1963年，Lukosz和Marchand22就提出了特定模式侧向入射的光线可以用来增强显微镜分辨率的理论2005年，加州大学旧金山分校的Gustafsson博士首先将非线性结构性光学照明部件引入到传统的显微镜上，得到了分辨率达到50nm的图像5SSIM技术的原理是将多重相互衍射的光束照射到样本上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨率的信息。当一个未知结构的物体(a)被一个结构规则的照射模式(b)的光所照射时，会产生云纹条纹(moir佴fringes)(c)云纹条纹发生在采样物体的空间频率与照射光线的空间频率有差异的地方显而易见，在显微镜下直接观察，就可以看到它放大了

37、原先不能够分辨出来的样本结构通过计算机进一步分析所有条纹中包含的信息，可以重组出样本的高分辨率图像。原子力显微镜原子力显微镜（Atomic Force Microscope ，AFM），一种可用来研究包括绝缘体在内的固体材料表面结构的分析仪器。它通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质。将一对微弱力极端敏感的微悬臂一端固定，另一端的微小针尖接近样品，这时它将与其相互作用，作用力将使得微悬臂发生形变或运动状态发生变化。扫描样品时，利用传感器检测这些变化，就可获得作用力分布信息，从而以纳米级分辨率获得表面结构信息。1简介它主要由带针尖的微悬臂

38、、微悬臂运动检测装置、监控其运动的反馈回路、使样品进行扫描的压电陶瓷扫描器件、计算机控制的图像采集、显示及处理系统组成。微悬臂运动可用如隧道电流检测等电学方法或光束偏转法、干涉法等光学方法检测，当针尖与样品充分接近相互之间存在短程相互斥力时，检测该斥力可获得表面原子级分辨图像，一般情况下分辨率也在纳米级水平。AFM测量对样品无特殊要求，可测量固体表面、吸附体系等。2原理概括原子力显微镜（atomic force microscope，简称AFM）利用微悬臂感受和放大悬臂上尖细探针与受测样品原子之间的作用力，从而达到检测的目的，具有原子级的分辨率。由于原子力显微镜既可以观察导体，也可以观察非导体

39、，从而弥补了扫描隧道显微镜的不足。原子力显微镜是由IBM公司苏黎世研究中心的格尔德宾宁与斯坦福大学的Calvin Quate于一九八五年所发明的，其目的是为了使非导体也可以采用类似扫描探针显微镜（SPM）的观测方法。原子力显微镜（AFM）与扫描隧道显微镜（STM）最大的差别在于并非利用电子隧穿效应，而是检测原子之间的接触，原子键合，范德瓦耳斯力或卡西米尔效应等来呈现样品的表面特性。详细原子力显微镜的基本原理是：将一个对微弱力极敏感的微悬臂一端固定，另一端有一微小的针尖，针尖与样品表面轻轻接触，由于针尖尖端原子与样品表面原子间存在极微弱的排斥力，通过在扫描时控制这种力的恒定，带有针尖的微悬臂将对

40、应于针尖与样品表面原子间作用力的等位面而在垂直于样品的表面方向起伏运动。利用光学检测法或隧道电流检测法，可测得微悬臂对应于扫描各点的位置变化，从而可以获得样品表面形貌的信息。下面，我们以激光检测原子力显微镜（Atomic Force Microscope Employing Laser Beam Deflection for Force Detection,Laser-AFM）扫描探针显微镜家族中最常用的一种为例，来详细说明其工作原理。如图1所示，二极管激光器（Laser Diode）发出的激光束经过光学系统聚焦在微悬臂（Cantilever）背面，并从微悬臂背面反射到由光电二极管构成的光斑位

41、置检测器（Detector）。在样品扫描时，由于样品表面的原子与微悬臂探针尖端的原子间的相互作用力，微悬臂将随样品表面形貌而弯曲起伏，反射光束也将随之偏移，因而，通过光电二极管检测光斑位置的变化，就能获得被测样品表面形貌的信息。在系统检测成像全过程中，探针和被测样品间的距离始终保持在纳米（10e-9米）量级，距离太大不能获得样品表面的信息，距离太小会损伤探针和被测样品，反馈回路(Feedback）的作用就是在工作过程中，由探针得到探针-样品相互作用的强度，来改变加在样品扫描器垂直方向的电压，从而使样品伸缩，调节探针和被测样品间的距离，反过来控制探针-样品相互作用的强度，实现反馈控制。因此，反馈

42、控制是本系统的核心工作机制。本系统采用数字反馈控制回路，用户在控制软件的参数工具栏通过以参考电流、积分增益和比例增益几个参数的设置来对该反馈回路的特性进行控制。3优缺点优点相对于扫描电子显微镜，原子力显微镜具有许多优点。不同于电子显微镜只能提供二维图像，AFM提供真正的三维表面图。同时，AFM不需要对样品的任何特殊处理，如镀铜或碳，这种处理对样品会造成不可逆转的伤害。第三，电子显微镜需要运行在高真空条件下，原子力显微镜在常压下甚至在液体环境下都可以良好工作。这样可以用来研究生物宏观分子，甚至活的生物组织。缺点和扫描电子显微镜(SEM）相比，AFM的缺点在于成像范围太小，速度慢，受探头的影响太大

43、。原子力显微镜（Atomic Force Microscope）是继扫描隧道显微镜（Scanning Tunneling Microscope）之后发明的一种具有原子级高分辨的新型仪器，可以在大气和液体环境下对各种材料和样品进行纳米区域的物理性质包括形貌进行探测，或者直接进行纳米操纵；现已广泛应用于半导体、纳米功能材料、生物、化工、食品、医药研究和科研院所各种纳米相关学科的研究实验等领域中，成为纳米科学研究的基本工具。原子力显微镜与扫描隧道显微镜相比，由于能观测非导电样品，因此具有更为广泛的适用性。当前在科学研究和工业界广泛使用的扫描力显微镜（Scanning Force Microscope

44、），其基础就是原子力显微镜。4仪器结构在原子力显微镜（Atomic Force Microscopy，AFM）的系统中，可分成三个部分：力检测部分、位置检测部分、反馈系统。力检测部分在原子力显微镜（AFM）的系统中，所要检测的力是原子与原子之间的范德华力。所以在本系统中是使用微小悬臂（cantilever）来检测原子之间力的变化量。微悬臂通常由一个一般100500m长和大约500nm5m厚的硅片或氮化硅片制成。微悬臂顶端有一个尖锐针尖，用来检测样品针尖间的相互作用力。这微小悬臂有一定的规格，例如：长度、宽度、弹性系数以及针尖的形状，而这些规格的选择是依照样品的特性，以及操作模式的不同，而选择不

45、同类型的探针。位置检测部分在原子力显微镜（AFM）的系统中，当针尖与样品之间有了交互作用之后，会使得悬臂cantilever摆动，所以当激光照射在微悬臂的末端时，其反射光的位置也会因为悬臂摆动而有所改变，这就造成偏移量的产生。在整个系统中是依靠激光光斑位置检测器将偏移量记录下并转换成电的信号，以供SPM控制器作信号处理。反馈系统在原子力显微镜（AFM）的系统中，将信号经由激光检测器取入之后，在反馈系统中会将此信号当作反馈信号，作为内部的调整信号，并驱使通常由压电陶瓷管制作的扫描器做适当的移动，以保持样品与针尖保持一定的作用力。总结AFM系统使用压电陶瓷管制作的扫描器精确控制微小的扫描移动。压电

46、陶瓷是一种性能奇特的材料，当在压电陶瓷对称的两个端面加上电压时，压电陶瓷会按特定的方向伸长或缩短。而伸长或缩短的尺寸与所加的电压的大小成线性关系。也就是说，可以通过改变电压来控制压电陶瓷的微小伸缩。通常把三个分别代表X，Y，Z方向的压电陶瓷块组成三角架的形状，通过控制X，Y方向伸缩达到驱动探针在样品表面扫描的目的；通过控制Z方向压电陶瓷的伸缩达到控制探针与样品之间距离的目的。原子力显微镜（AFM）便是结合以上三个部分来将样品的表面特性呈现出来的：在原子力显微镜（AFM）的系统中，使用微小悬臂（cantilever）来感测针尖与样品之间的相互作用，这作用力会使微悬臂摆动，再利用激光将光照射在悬臂

47、的末端，当摆动形成时，会使反射光的位置改变而造成偏移量，此时激光检测器会记录此偏移量，也会把此时的信号给反馈系统，以利于系统做适当的调整，最后再将样品的表面特性以影像的方式给呈现出来。5工作模式原子力显微镜的工作模式是以针尖与样品之间的作用力的形式来分类的。主要有以下3种操作模式：接触模式（contact mode) ，非接触模式（ non - contact mode) 和敲击模式( tapping mode）。接触模式从概念上来理解，接触模式是AFM最直接的成像模式。正如名字所描述的那样，AFM 在整个扫描成像过程之中，探针针尖始终与样品表面保持紧密的接触，而相互作用力是排斥力。扫描时，悬

48、臂施加在针尖上的力有可能破坏试样的表面结构，因此力的大小范围在10 - 1010 - 6 N。若样品表面柔嫩而不能承受这样的力，便不宜选用接触模式对样品表面进行成像。非接触模式非接触模式探测试样表面时悬臂在距离试样表面上方510 nm 的距离处振荡。这时，样品与针尖之间的相互作用由范德华力控制，通常为10 - 12 N ，样品不会被破坏，而且针尖也不会被污染，特别适合于研究柔嫩物体的表面。这种操作模式的不利之处在于要在室温大气环境下实现这种模式十分困难。因为样品表面不可避免地会积聚薄薄的一层水，它会在样品与针尖之间搭起一小小的毛细桥，将针尖与表面吸在一起，从而增加尖端对表面的压力。敲击模式敲击模式介于接触模式和非接触模式之间，是一个杂化的概念。悬臂在试样表面上方以其共振频率振荡，针尖仅仅是周期性地短暂地接触/ 敲击样品表面。这就意味着针尖接触样品时所产生的侧向力被明显地减小了。因此当检测柔嫩的样品时，AFM的敲击模式是最好的选择之一。一旦AFM开始对样品进行成像扫描，装置随即将有关数据输入系统，如表面粗糙度、平均高度、峰谷峰顶之间的最