代谢组学概述.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流代谢组学概述.精品文档.代谢组学概述1 代谢组学概况代谢组学是国际上近年来继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后迅速发展起来的新兴研究领域1。1999年英国帝国理工学院的Nicholson等在核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）分析的基础上提出代谢组学（metabonomics）的概念，即对生物系统因病理生理或基因改变等刺激所致动态多参数代谢应答的定量测定2。随着学科进一步的发展以及对代谢多层次多方面的深入研究，目前国内学者将代谢组学准确定义为：代谢组学是关于生物体内源性代谢物质的整体及其变化规律的科学3。相

2、对于基因组学、转录组学和蛋白质组学来说，基因、转录子、蛋白的存在是为某生物学事件或过程的发生奠定了物质基础，但这个事件或过程有可能不发生；而代谢物的存在则反映生命过程中已经发生的生物化学反应，其变化正是对该生物事件或过程的反映4。代谢组学是对其它三种组学的重要补充。正常状态下,机体中代谢物的组成处于一种动态平衡。当机体受到外界环境刺激或者自身生理因素的影响时，在细胞、组织，甚至整体水平会发生代谢的显著变化，导致最终代谢物种类和浓度的变化。代谢组学恰恰就是通过考察生物体系在受到外界刺激后对其体液（血液、尿液、淋巴液等）及组织代谢产物的组成变化或其随时间的变化，来研究生物体系代谢途径的一种技术5。

3、它跳过生命体内复杂调控过程，利用高通量、高灵敏度与高精确度的现代仪器分析技术，对机体代谢物的整体组成进行动态跟踪分析，发现与疾病相关的一组特征性生物标志物，从而帮助人们更好理解病变过程并实施疾病的诊断，因而近年来在疾病诊断6,7、药物开发8、药物毒性及安全性评价9-11等领域展示了广阔的应用前景，推动系统生物学研究的发展。2 代谢组学的研究方法代谢组学的分析目标是对生物体系中尽可能多的内源性代谢组分进行无偏差的定性定量测定，整个分析过程应尽量保留生物样品中代谢物的整体信息12。完整的代谢组学流程包括样品采集、预处理、数据采集和数据分析及解释。2.1 样品采集及预处理代谢组学力求分析生物体系（如

4、体液和细胞）中的所有代谢产物，整个分析过程应能尽可能保留和反映总的代谢产物的信息。由于实际研究对象不同，采用的样品采集、预处理技术也千差万别13。如采用NMR技术平台，对样品的预处理相对非常简单；而采用MS进行“全”成分分析技术时，样品的预处理虽简单，但却没有一种通用的标准化方法。代谢产物通常用水或有机溶剂 （如甲醇、己烷等）分别提取，获得水提取物和有机溶剂提取物，以便进行数据采集分析14。2.2 数据采集对于代谢组这样复杂的研究体系，理想的检测分析方法应该具备无偏向性、良好的分辨率和重现性、高灵敏度和系统性、样品制备的简易性和高通量分析可操作性等15。现阶段的分析技术主要包括核磁共振波谱16

5、、质谱17、色谱18等。目前以核磁共振波谱法（NMR）和质谱法以及液质联用的方法在各个领域中的应用最为广泛。2.2.1 NMR技术 迄今为止，在代谢组学研究中最常见的分析工具是NMR。特别是1H-NMR，能够实现对样品的非破坏性、非选择性分析，满足代谢组学中对尽可能多的化合物进行检测的目标。NMR样品只需要简单预处理，且样品还可回收用于其他分析；无损伤性，不会破坏样品的结构和性质；可在一定温度和缓冲范围内进行生理条件或接近生理条件的实验；可与外界特定干预相结合，研究动态系统中机体化学交换、运动等代谢产物的变化规律；可以进行实时和动态检测，没有偏向性。对所有化合物的灵敏度是一样的，因为它是一种非

6、选择性的测定技术19。核磁共振技术在代谢组学中的应用越来越广泛 ，现在已应用于药物毒性20-22；疾病研究，如冠心病23、高血压病24、哮喘25、甲状腺功能亢进症26、肿瘤27、精神系统疾病28等、营养学29-30及微生物学31等。2.2.2 质谱 质谱具有较高灵敏度和专属性，可以实现对多个化合物的同时快速分析与鉴定。随着质谱及其联用技术的发展，越来越多的研究者将气-质联用（Gas chromatography - mass spectrometry，GC-MS）、液-质联用（Liquid chromatography - mass spectrometry，LC-MS）等联用技术，是对代谢物

7、逐一定性定量时不可缺少的手段，而且在进行相对分子质量测定及分子式推算时，质谱是无可取代的。采用GC-MS可以同时测定几百个化学性质不同的化合物，包括有机酸、大多数脂肪酸、糖、糖醇、芳胺和氨基酸，该分析技术是代谢组研究者常用的分析手段。另外，GC-MS最大优势是有大量可检索的质谱库。GC-MS在植物和微生物代谢指纹分析上应用较广32。而LC-MS的一个很大的优势是，在大多数情况下不需要对非挥发性代谢物进行化学衍生。相对于GC-MS，LC-MS能分析更高极性和更高相对分子质量的化合物，而受到研究者的青睐。2.3 数据分析及解释对样品成分分析鉴定后，要对获得的原始数据进行处理和分析。代谢组学分析产生

8、的是信息含量丰富的多维数据，因此充分运用化学计量学理论和多元统计分析新方法，对采集的多维海量原始信息进行压缩降维和归类分析，从中有效挖掘出有用信息，对代谢组学分析结果的最终解释至关重要。目前在代谢组学中运用较多的，包括主成分分析（ Principal component analysis, PCA）、层次聚类分析（ Hierarchical clustering analysis ，HCA）、非线性影射（ Nonlinear innuendo analysis, NLM）等非监督分类方法，以及偏最小二乘法-判别分析（Partial least squares projection to lat

9、ent structure discriminant analysis, PLS-DA）、神经网络（ Neural network clustering, NN）等监督分类方法，其中以主成分分析方法33和偏最小二乘法-判别分析最为常用和有效。2.3.1 主成分分析法（PCA）主成分分析是一种常用的基于变量协方差矩阵对信息进行处理、压缩和抽提的有效方法。它是根据方差最大化原理，用一组新的、线性无关且相互正交的向量来表征原来数据矩阵的行（或列）。这组新向量（主成分）是原始数据向量的线性组合。通过对原始数据的平移、尺度伸缩（减均值除方差）和坐标旋转（特征分解），得到新的坐标系（特征向量）后，用原始数

10、据在新坐标系下的投影（点积）来替代原始变量。如果原来有p个变量，则最多可以选取p个主成分，这p个主成分的变化可以完全反映原来全部p个变量的变化；如果选取的主成分少于p个，则这些主成分的变化应尽可能多反映原来全部p个变量的变化。它通过压缩变量个数，用较少的变量去解释原始数据中的大部分变量，从而剔除冗余信息，使模型更好地反映真实情况。即将许多相关性很高的变量转化成个数较少、能解释大部分原始数据方差且彼此互相独立的几个新变量，也就是所谓的主成分。这样就可以消除原始变量间存在的共线性，克服由此造成的运算不稳定、矩阵病态等问题。PCA分析在很多领域有广泛应用（模式识别、化学组分的定量分析、多元物系的组分

11、数目确定、动力学反应机理的确定等）。它将分散在一组变量上的信息集中到某几个综合指标即主成分上，利用这些主成分来描述机体代谢的变化情况，发挥降维分析的作用。主成分是由原始变量按一定权重经线性组合而形成的新变量。第一个PC包含了数据集的绝大部分方差，第二个次之，依此类推。据此，由前两个或三个PC作图，直观地描述药物作用到器官之后或者基因改变之后生物体内的代谢模式变化。如Yang等34对2型糖尿病的研究中用PCA得分图将患病组与对照组区明确分开，并用PCA投影图提示可能的疾病标志物。2.3.2 偏最小二乘法一判别分析（PLS-DA）偏最小二乘法是一种新型的多元统计数据分析方法，它主要研究的是多因变量

12、对多自变量的回归建模，特别当各变量内部高度线性相关时，用偏最小二乘回归进行回归建模分析，对比逐个因变量进行多元回归，更加有效，其结论更加可靠，整体性更强。另外偏最小二乘回归可以较好解决许多以往用普通多元回归无法解决的问题，最典型的问题是自变量之间的多重相关性。如果采用普通的最小二乘回归方法，这种变量多重相关性就会严重危害参数估计，扩大模型误差，并破坏模型的稳健性。而采用偏最小二乘回归方法，是利用对系统中的数据信息进行分解和筛选的方法，提取对因变量解释性最强的综合变量，辨识系统中的信息与噪声，从而更好克服多重相关性在系统建模中的不良作用。另一方面，在使用普通最小二乘回归时经常受到样本点数的限制（

13、样本点不宜太少）。一般统计书上介绍该数目应是变量个数的两倍以上，但由于费用、时间等条件的限制，所能得到的样本点个数却少于变量的个数，此时采用普通的多元回归方法无能为力，而采用偏最小二乘回归方法可得到较好解决。偏最小二乘回归方法可以实现多种数据分析方法的综合，所以被称为第二代回归方法。它是集主成分分析、典型相关分析和多元线性回归分析3种分析方法的优点于一身。它与主成分分析法都试图提取出反映数据变异的最大信息，但主成分分析法只考虑一个自变量矩阵，而偏最小二乘法还有一个“响应”矩阵，因此具有预测功能。Wang等35对糖尿病病人和正常对照者血清分析得到PCA图，区分以上两组的正确率只有69.1%，将同

14、样一组数据首先进行信号校正，然后在用PLS-DA的方法进行区分，准确率提高到88.2%。3 代谢组学的应用3.1 疾病诊断利用代谢组学技术筛选和监测正常人群和患病人群中相关代谢组织和体液中的代谢产物，从小分子水平研究疾病代谢产物变化，不但可以在病理上寻找病因，为早期诊断和预后判断提供依据。同时也可以针对疾病特有的代谢小分子变异情况进行修复，从而探索和寻求新的治疗途径。陈英杰等36应用高效液相色谱方法分别检测80名正常人与60例胃癌患者尿中Pseu、C、X等6种核苷的水平。结果显示60例胃癌患者尿中6种核苷的平均水平明显高于健康人（P0.01），C核苷与肿瘤体积呈正相关（P0.05），Pseu、

15、X等与肿瘤TNM分期呈正相关（P0.05）。本研究表明尿中修饰核苷检测对胃癌的诊断有一定意义。张洁等37采用超高效液相色谱-飞行时间质谱法对8例糖尿病肾病（DN）患者、33例糖尿病（DM）患者和25例正常人的血清进行检测。结果显示DN、DM患者血清代谢物与正常人能够完全分离，且DN与DM患者血清代谢物也能得到很好的区分，同时DN与DM患者中4-羟双氢鞘氨醇和二氢鞘氨醇含量明显降低。熊建辉等38对46个健康人和26个乳腺癌病人采用毛细管电泳法，测定其尿样中的13种正常核苷和修饰核苷，以小波神经网络作为模式识别工具对健康人和乳腺癌病人的分类作了研究，随机选取的训练集的识别率达到100%，相应的预测

16、集判别率正确性在96%以上。研究表明，毛细管电泳法与小波神经网络的结合有望成为乳腺癌的辅助诊断手段。3.2 药物开发代谢组学被应用于药物药效及毒性的筛选和评价、作用机制研究和合理治疗用药等方面的研究。廖艳等39将36只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、50和100 mg/kg利福平3组，采用1H-NMR法测定灌胃后不同时段大鼠尿液的代谢表型。结果显示各组大鼠尿液的代谢谱各不相同，随着给药时间的推移，大鼠尿液1H-NMR谱发生一定改变。与对照组比较，给药组尿样1H-谱葡萄糖和牛磺酸显著增加，2-酮戊二酸和柠檬酸显著降低。研究表明利福平引起的肝毒性与三羧酸循环中能量代谢异常及葡萄糖代谢紊乱有关。

17、袁凯龙等40对18例2型糖尿病患者及14例正常对照组尿样进行检测。同时测定患者服药前后不同时间的血压、尿蛋白、尿中8-羟-2-脱氧鸟苷含量和血肌酐浓度。结果显示患者服药8-12周后洛沙坦对糖尿病的治疗效果不明显，常规生化指标未发生显著性变化，代谢组学研究显示葡萄糖醇服药后增加。研究表明代谢组学能利用机体不同时间点代谢组的变化轨迹描绘药物疗效的发展过程。中药及其复方药效的特点是药效物质多成分、多途径、多靶点的整体调节，将代谢组学技术应用到中药的整体药效评价、作用机制及药物在体内的“代谢指纹图谱”研究，不仅可监测药物本身在体内的代谢变化过程，更重要的是可以通过观察药物所引起的内源性代谢物的变化，推

18、测体内生化过程和状态的变化，进而推断中药的作用机制，利用代谢物的终端性信息寻找或阐明药物作用的靶点或受体41。崔立然等42为了探讨代谢组学在中药黄药子肝毒性研究中的可行性，运用UPLC-Q-TOF/MS技术手段对空白组、黄药子组的大鼠7 d的尿液进行分析，建立各组大鼠的尿液代谢轮廓图，并进一步借助模式识别方法主成分分析。结果初步确定空白和黄药子组大鼠尿液代谢轮廓图的差异，两组大鼠尿液代谢物被明显分开，且黄药子组的代谢产物谱变化与血液生化改变相一致，表明代谢组学可用于中药黄药子肝毒性研究。王喜军等43以超高压液相色谱串联飞行时间质谱仪分析系统（UPLC/QTOF）为核心手段，研究CCL4诱导肝损

19、伤模型及茵陈蒿汤干预后大鼠尿液代谢表型变化，来探讨代谢组学在动物模型复制和中药药效研究中应用。结果表明：给予CCL4后大鼠尿液代谢物组发生了明显变化，与空白组明显分开，并找到5个具有显著分类意义的CCL4致肝损伤模型的生物标记物；同时大鼠口服给予茵陈蒿汤后，与空白组相比较，上述5个生物标记物除了个别大鼠外，均无明显变化，说明茵陈蒿汤对CCL4导致大鼠肝损伤明显有预防作用，从代谢组学角度对经典方剂防治肝损伤给出全新解释。3.3 植物代谢组学代谢组学为较为全面地研究植物复杂代谢过程及其产物，从而为分析植物次生代谢网络结构、限速步骤，解析细胞活动过程，以及寻找植物间的亲缘关系等等提供了可能44。戴惠

20、等45采用1H-NMR对丹参以及替代品戟叶鼠尾草、云南鼠尾草、黄花鼠尾草的（甲醇/水）提取物组成进行了研究，使用多变量统计分析比较了这四种植物提取物分子组成上的差异。结果显示1H-NMR谱表明这四种植物提取物含有多种氨基酸、有机酸和迷迭香酸等酚酸。O-PLS-DA图显示三个替代品提取物与丹参提取物的组成存在着明显的差异。本研究说明这四种植物的物质组成以及含量上有较大差异。3.4 营养科学运用代谢组学来研究营养学问题，可以高通量、全景式从代谢水平研究营养素与机体的相互作用。另一方面，由于慢性疾病受营养和遗传双重影响，用代谢组学评价营养在疾病发生发展中的作用亦受到广泛关注。李民等46将32只大鼠分

21、成营养不良组和对照组。用液质分析（LC-MS）方法检测并比较两组大鼠血浆小分子物质。结果显示营养不良组大鼠与对照组相比，血浆中肉毒碱和色氨酸碎片含量增加，而甜菜碱、棕榈酰肉碱、亚麻酸、二十二碳六烯酸和花生四烯酸等含量均降低。结论表明用LC-MS方法能检测出与大鼠营养不良相关小分子物质。代谢组学可作为营养不良指标的筛选方法。参考文献1 Goodacre R. Marking sence of the metabolome using evolutionary computation:seeing the wood with the treesJ. J Exp Bot, 2005, 56(410)

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