分子生物学实验指导.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流分子生物学实验指导.精品文档.分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月目 录 实验 总RNA的提取、定量与RT-PCR 1 实验 质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定7 实验 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳13 附录 相关试剂盒说明书19 附录 相关仪器使用说明书 19 实验九 总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量

2、，文库构建等。 原理： 在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5g RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，

3、氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；

4、用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50100mg组织、5106细胞）也适用于大量样品（1g组织、107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNase处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于western blotting。 核酸的最

5、大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50g/ml，单链DNA和RNA浓度为40g/ml，单链寡核苷酸的含量为33g/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。 紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。 仪器和主要试剂： 1. 紫外分光光度计、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管

6、 2. Trizol试剂 3. 氯仿 4. 异丙醇 5. 75乙醇6. 无RNase的水或0.5SDS (溶液均需用DEPC处理过的水配制) 实验方法：本次实验采用TaKaRa 公司的RNAiso Plus试剂 （一）RNA提取 1. 匀浆处理: a.组织 将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml Trizol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过Trizol体积10。 b.单层培养细胞 直接在培养板中加入Trizol裂解细胞，每10cm2面积加1ml，用移液器吸打几次。Trizol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。Trizol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

7、 c.细胞悬液 离心收集细胞，每5-10106动物、植物、酵母细胞或1107细菌细胞加入1ml Trizol，反复吸打。加Trizol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。 (注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量RNA的前提；细胞数量与Trizol的比例，细胞的数量不能过多。) 2. 将匀浆样品在室温（15-30）放置5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8 10000g离心10 min，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪

8、组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。 4. 每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3 min。 (注意：此步振荡非常重要，建议在旋涡振荡器上进行。) 5. 2-810000g离心15 min。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Trizol试剂的60。 6. 把水相转移到新管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相），用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml Trizol加入0.5ml异丙醇，室温放置10 min。 7. 2-810000g离心10 min，离心前看不出R

9、NA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。 8. 用75乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml 75乙醇。2-8不超过7500g离心5 min，弃上清。 9. 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，不要晾得过干，否则不易溶解，大约晾5-10min。加入25-200l无RNase的水，-70保存。 （二）紫外吸收检测RNA的浓度和纯度 2 1. 紫外分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。 2. 取RNA样品2l，用水稀释50倍，转入分光光度计的石英比色杯中。 3. 在260nm和280nm分别读出样品OD值。根据260nm时1 OD单位的单链RNA =

10、 40g/ml和稀释倍数，可以计算出样品RNA的浓度和产量。 4. 若OD260/OD280小于2，说明可能有DNA片段污染，可以考虑用无RNase的DNase处理样品，若小于1.8，说明样品中还可能含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化RNA。 注意事项： 1. 从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA是可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加1ml Trizol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10g RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。 2. 匀浆后加氯仿之前样品可在-60-7

11、0保存至少一个月。RNA沉淀可保存在75%酒精中2-8一个星期以上或-5-20一年以上。 3. 预期产量：1mg组织或1106细胞提取RNA分别为： 肝和脾6-10 g，肾3-4 g，骨骼肌和脑组织1-1.5 g，胎盘1-4 g，上皮细胞8-15 g，成纤维细胞5-7 g。 4. 蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中，每使用1ml Trizol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8mol/L柠檬酸钠和1.2mol/L NaCl)混合离心，按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取

12、RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。 5. 预防RNase污染措施： 经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。 使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。 RNA在Trizol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150烘烤4小时，塑料制品可在0.5mol/L NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01v/v，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。

13、 RNA的提取常见问题分析 问 题 解 析 得率低 A样品裂解或匀浆处理不彻底 BRNA沉淀未完全溶解 A260/A2801.65 A检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中 二、逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR) 原理： 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能

14、。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 (一) 反转录酶的选择 1 Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37。 2 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42。 3Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScri

15、pt。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 (二) 合成cDNA引物的选择 1随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2 Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可

16、被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 仪器和主要试剂： 1. 基因扩增仪(如PE GeneAmp PCR System 2400 或 9700)、微量加样枪、凝胶成像系统、灭菌超薄PCR反应管 2RNA提取试剂 3第一链cDNA合成试剂盒4dNTP mix：含dATP

17、、dCTP、dGTP、dTTP各2 mmol/L5Taq DNA聚合酶 实验方法：本次实验采用TaKaRa 公司的PrimeScript RT reagent Kit 1. 总RNA的提取：见前述内容。 2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以TAKARA公司提供的PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒为例。 （1）在0.2ml微量离心管中，加入以下： 总RNA 1-5 g 、dNTP 1 l 、Random primer 1 l 、补充适量的DEPC H2O使总体积达10

18、 l。轻轻混匀、离心。 （2）PCR仪上65加热5min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。 （3）然后加入下列试剂的混合物： 5PrimeScript buffer 4 l 、RNase inhibator 0.5 l 、RTase 1 l 、RNase free H2O 4.5 l ，轻轻混匀，离心. （4） 30孵育10 min。 （5） 42孵育60 min。 （6）于70加热15 min以终止反应，将管插入冰中。 3PCR：本次实验采用Premix Taq Version2.0(Loading dye mix)试剂 （1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA

19、 2 l 、上游引物（10pmol/L）2 l 、下游引物（10pmol/L）2 l 、dNTP(2mmol/L) 4 l 、10PCR buffer 5 l 、Taq酶（2U/l） 1 l 。（2）加入适量的ddH2O，使总体积达50 l。轻轻混匀，离心。 （3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G-3-PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。 （4）电泳鉴定：进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。 （5）结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带扫描分析。 注意事项： 1 在实验过程中要

20、防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。 2 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。 3 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G-3-PD（3-磷酸甘油醛脱氢酶）、-Actin（-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。 4 PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。 5 防止DNA的污染： （1）采用DNA酶处理RNA样品。 （

21、2）在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，消除基因和mRNA的共线性。 附注： （1）-actin 引物序列： sense 5-ACCATGGATGATGATATCGCC-3 、antisense 5-GTGCCAGATTTTCTCCATGTC-3 ，片段长度 264（71-334）； （2）目的基因GAPDH引物序列 ：sense 5 ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG 3 、antisense 5 CAGGGGTGCTAAGCAGTTGG 3 ，片段长度：480（103-582） 。（3）实验材料：HEK293（人胚肾细胞） 实验 质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 目的：

22、 采用碱变性法，学习小规模制备质粒DNA的技术；了解紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理，掌握测定方法；学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNA的构型、分子量的大小；学习体外构建或鉴定重组DNA分子时，根据目的基因及载体选择合适的限制性内切酶；学习PCR的基本原理与实验技术，了解引物设计的一般要求。 原理： 碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中

23、性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50g/ml，单链DNA和RNA浓度为40g/ml，单链寡核苷酸的含量为33g/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。若比值高于1.8说明DNA样品中的RNA尚未除尽，若样品

24、中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液，在测定的浓度为590g/ml范围内，该方法较为可靠，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，可作为电泳支持物，适用于分离大小范围在0.2-50kb的DNA片段。DNA分子的迁移率与分子量的对数值成反比关系。观察其迁移距离，与标准DNA片段进行对照，就可获知该样品分子量大小。在质粒抽提过程中，由于各种因素的影响，使质粒DNA呈现超螺旋的共价闭合环状、开环状分子、线状分子三种不同的构型，这三种分子有不同的迁移率。在一般情况下，

25、超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的为开环状分子。用荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide, EB ）进行检测，溴化乙锭嵌入碱基对之间形成荧光络合物，在紫外线激发下发出红色荧光。 限制性内切酶及其它DNA修饰酶是分子生物学在DNA操作时常用的工具，限制性核酸内切酶是应用最多的一类酶，它分为，型，型最常用，通常所用的限制性内切酶多指此型。型限制性内切酶是一类位点特异性酶，识别双链DNA分子上特异的核苷酸序列，一般识别46个核苷酸：EcoR :5-GAATTC-3；BamH ： GGAATC；Hind ：AAGCTT；Msp :CCGG。不同的限制性内切酶切割双链DNA的方式不

26、同。 根据这些特性可以很容易地在体外进行DNA的重组操作。一般典型的限制性内切酶反应是底物DNA在含有Mg2+，Na+的缓冲液（如pH=7.5）中，加入限制性内切酶，在37保温。在适当条件下（包括温度，pH，离子强度），1小时内完全酶解，1g DNA所需限制性内切酶的量，定义为一个活性单位。影响酶切反应的因素有：底物DNA的纯度，反应系统，反应体积，时间和温度。 主要仪器： 离心机，紫外分光光度计，恒温水浴锅，水平电泳槽，电泳仪，紫外检测仪，凝胶成像系统，基因扩增仪（PCR仪） （一）质粒DNA的提取 主要试剂： 溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖 、10 mmol/L EDTA 、25 m

27、mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 、2毫克/毫升 溶菌酶 溶液II： 200 mmol/L NaOH 、1% SDS 、溶液III： 3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液 、TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5 、1 mmol/L EDTA 实验方法：本次实验采用百泰克公司的质粒小量制备试剂盒(离心柱型) 1、将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2毫升加入抗菌素的LB液体培养基的10毫升试管里，37振培过夜，1618小时 2、转移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm离心30秒 3、小心去除上清，并用吸水纸吸干残余液体，再将沉淀物在振荡器上振

28、匀 4、加入溶液I 100l，盖紧EP管盖，翻转数次，冰上放置10分钟 5、加入溶液II 200l，温和翻转EP管5次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明)，冰上放置5分钟 6、加入溶液III 150l，将EP管盖紧后来回翻转23次，混匀后冰上放置20分钟 7、12000rpm离心15分钟 8、将上清转移到另一个EP管中(吸取时不可吸入底部的沉淀)。加入等体积的酚和氯仿：异戊醇各抽提一次 9、加入1毫升预冷的无水乙醇和1/10体积NaAc(3 mol/L,pH5.2)，盖紧，并翻转EP管数次混匀 10 置于-20冰箱12小时 11 15000rpm离心15分钟，去除上清，收集管底白色沉淀 12 7

29、0%乙醇洗涤一次，空气干燥或真空抽干 13 将沉淀溶于50l TE缓冲液或去离子水，完全溶解后，-20保存 14 取样5l，在1%的琼脂糖凝胶上电泳，观察DNA条带。（二）紫外吸收检测DNA的浓度和纯度 主要试剂：提取的质粒DNA 实验方法： 1、 分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。 2、 取质粒DNA样品2l，用水稀释50倍，转入分光光度计的石英比色杯中。 3、 在260nm和280nm分别读出样品OD值。根据260nm时1 OD单位的双链DNA = 50g/ml和稀释倍数，可以计算出样品DNA的浓度。 4、 若OD260/OD280大于1.8，说明仍有RNA，可以考虑

30、用RNA酶处理样品，若小于1.8，说明样品中含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化DNA。 （三）质粒DNA的双酶切鉴定 主要试剂： 纯化的质粒DNA(100ng/L) 、限制性内切酶(TaKaRa)： Hind III (15U/L), EcoR I (12U/L) 、酶的贮存缓冲液： Hind III： EcoR I 、10mM Tris-HCl 10mM Tris-HCl 、400mM KCl 、100mM KCl 、0.1mM EDTA 0.1mM EDTA 、1mM DTT 1mM DTT 、0.01% BSA 0.15% Triton X-100、50% 甘油(pH 7

31、.5) 0.01% BSA 、50% 甘油(pH 7.5) 、10 Buffer： 100mM Tris-HCl(pH 7.5)、100mM MgCl2 、10mM DTT 、500mM NaCl 、无菌去离子水 实验方法： 1、在1.5ml Eppendorf管中按顺序依次加入下述试剂，混匀后即成酶切反应体系： 无菌去离子水: 11L 、10 buffer 2L 、质粒DNA 5L(共500ng)、 Hind III (15U/L) 1L 、EcoR I (12U/L) 1L ，共 20L 2、将反应管置37水浴13h 3、反应结束后取10L反应产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测并观察结果，酶

32、切产物应为不同大小的两个片段。 （四）琼脂糖凝胶电泳 主要试剂： 提取的质粒DNA，酶切产物 5TBE：54gTris; 27.5g硼酸; EDTA (0.5mol/L, pH 8.0) 20ml, 加水至1L，用前稀释10倍 溴化乙锭（EB）：10mg/ml溶液 或其他核酸染料物质 溴酚蓝或加样缓冲液（loading buffer）实验方法： 1、称取1g琼脂糖于100ml 0.5TBE中，加热溶解，冷却至65左右再加入终浓度为0.5%-1.0%的EB（或其他核酸染料物质）。 2、将电泳胶模置于制胶架中，梳子置于适当位置，将冷却至65左右的琼脂糖溶液慢慢倒在胶模上，厚度约3。静置，待胶凝固后

33、将胶模从制胶架中取出，放入电泳槽内，倒入适量电泳缓冲液（一般液面高出凝胶1），小心拔出梳子。 3、将5g提取的质粒DNA样品和酶切产物，分别与溴酚蓝指示剂（或loading buffer）混匀，加入凝胶点样孔内，防止产生气泡和样品溢出。 4、将电泳槽通电，80V恒压电泳30分钟。 5、电泳完毕，关掉电泳仪，小心取出凝胶置于紫外灯下观察结果。 6结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带拍照分析，保存。 注意事项： 1、防止紫外线对人皮肤及眼睛的损伤，避免直接照射皮肤与眼睛。 2、EB是强诱变剂，有致癌性，操作时要带手套，防止污染。所有含有EB的溶液在弃置前应当进行净化处理。 附注一： 实验所用

34、的相关材料信息 备选一 1质粒DNA提取所用菌液样品 （1）宿主菌：DH5； （2）载体：pET-28a(+)； （3）插入片段基因：泛素化基因FBOX（1.6Kb）。 2质粒DNA酶切鉴定 （1）所用的限制性内切酶：EcoR I 和Hind III； （2）酶切产物：插入片段（1500bp）及载体（3800bp）。 备选二 1质粒DNA提取所用菌液样品 （1）宿主菌：DH5； （2）载体：pMD18-T； （3）插入片段基因：抑癌基因CHD5启动子区的一段区域（400bp）。 2质粒DNA酶切鉴定 （1）所用的限制性内切酶：EcoR I 和Hind III； （2）酶切产物：插入片段（400

35、bp）及载体（2.7kb）。 附注二： 质粒图谱 1. pET-28a(+) 载体 2. pMD18-T载体 附注三：质粒提取试剂盒说明书见附录 实验 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 目的： 掌握SDS-PAGE的基本原理，学会使用该方法来分析所表达的蛋白质，蛋白质大小、形状和所带电荷不同，在SDS-PAGE中的迁移率就不同，因此可采用该方法来推算所表达的蛋白质的分子量。 原理： 聚丙烯酰胺，即丙烯酰胺和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺，在催化剂过硫酸铵作用下聚合形成凝胶。反应液中还加有四甲基乙二胺用来引发和控制聚合反应。反应液顶覆盖一层水层，保证凝胶表面平坦，同时起到隔离大气中氧气的作用，因为氧气可抑制聚

36、合反应。 在蛋白质溶液中加入SDS，这种阴离子去污剂能够与蛋白质相结合，破坏蛋白质内部、分子之间以及其他物质的非共价键，使蛋白质变性而破坏原有的空间构象。按照1.4gSDS/1g蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。由于SDS带负电，使各种蛋白质的SDS-多肽复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类的蛋白质原有的电荷差别；同时，不同蛋白质的SDS复合物形状也相似，都呈长椭圆形。因此，在自由电泳时，它们的泳动率基本相同，而在某一适宜浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳介质中电泳时，由于凝胶的分子筛作用，电泳迁移率就取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以说是取

37、决于蛋白质分子量的大小。 SDSPAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。 1样品的浓缩效应 在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(TrisGly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(TrisHCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(TrisHCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl-，两槽中的Gly (pI6.0，pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正

38、极移动。C1-速度最快(先导离子)，其次为蛋白质，Gly 负离子最慢(尾随离子)。由于C1-很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高，这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和Gly 离子加快移动，结果使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。 2分子筛效应 蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化。由于其pH 升高(电泳进行时常超过9.0)，使Gly 解离成负离子的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响，迁移率急剧下降。此两项变化，使Gly 的移动超过蛋白质，上述的高电压梯度不复存在，蛋白

39、质便在一个较均一的pH 和电压梯度环境中，按其分子的大小移动。分离胶的孔径有一定的大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说，通过时受到的阻滞程度不同，即使净电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。 根据经验得知，当蛋白质分子量在11.7-165KD之间时，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数成线性关系，符合直线方程式；lgMW=-bX+K（MW为蛋白质的分子量，X为蛋白质-SDS复合物电泳的相对迁移率，K和b均为常数），将已知分子量的标准蛋白质在SDS-PAGE中电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下

40、的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。 仪器与主要试剂： 1. 主要器材： 电泳仪、垂直电泳仪、进样器、镊子、注射器、烧杯、旋涡器、离心机 2. 主要试剂： （1） 低分子量标准蛋白质液10l； （2） 菌体培养液一支1.5ml ；宿主菌：BL21；经IPTG诱导表达的蛋白：F-box蛋白（泛素相关蛋白），分子量略小于50KD。 （3） 2蛋白质样品缓冲液，组成如下： Tris 0.15g 、-巯基乙醇 1.0ml 、溴酚蓝 0.02g 、甘油 2.0ml 、SDS 0.4g 、蒸馏水 7.0ml 。3. 试剂配制： 30%丙烯酰胺 称29g丙烯酰胺，1g甲叉丙烯酰胺，溶于蒸馏水并定容至

41、100ml，滤纸过滤后置棕色玻璃瓶内室温保存 10%过硫酸铵 1g过硫酸铵溶于蒸馏水定容至10ml TEMED N，N，N，N-四甲基乙二胺，棕色瓶保存 上胶缓冲液 Tris12.1g， SDS0.4g溶于60ml蒸馏水，用盐酸调pH6.8，定容至100ml 下胶缓冲液 Tris12.1g， SDS0.4g溶于60ml蒸馏水，用盐酸调pH8.8，定容至100ml 1甘氨酸电泳缓冲液 25mmol/L Tris（3.02g），250mmol/L 甘氨酸（18.8g），0.1%SDS（1g），加蒸馏水至1000ml 染色液 0.5g考马斯亮蓝R250，90ml甲醇，20ml冰乙酸，加水至200ml

42、 脱色液 与染色液成分相似，无考马斯亮蓝R250 实验方法： 1. 安装电泳槽凝胶装置 先将二块玻璃板洗干净，干燥，嵌入胶带的凹槽中，装在电极槽上，拧紧外螺丝，使其夹紧（不能过紧以防玻璃破裂），放入制胶架固定，留待灌胶。2. 凝胶的制备 由冰箱中取出储液平衡到室温后开始配胶，在50ml烧杯内按下列配方(一块胶)配制SDS-PAGE分离胶（下胶）：(此配方建议更改为现行的，与仪器装置配套的数据) SDS-PAGE配方 30%丙烯酰胺 ml 缓冲液 ml H2O ml 10%过硫酸铵l TEMED l 总体积 ml 下胶10% 3.3 2.6 4 100 4 10 上胶5% 0.83 0.68 3

43、.4 50 5 5 3. 灌胶 迅速将配好的丙烯酰胺溶液（分离胶）灌入两片玻璃板的间隙中，留出灌注浓缩胶所需的空间（梳子齿长再加1厘米），用细管小心地在丙烯酰胺溶液上覆盖上一层蒸馏水，防止因氧气扩散进入凝胶而抑制聚合反应。待分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层。 再按上表配置5%浓缩胶（上胶）立即混合，在已聚合的分离胶上直接灌注后，立即在上胶溶液中插入干净的梳子，两边平直，小心避免气泡混入，将凝胶垂直放置于室温下10-15min，待浓缩胶凝固后，将梳子小心拔出，然后用水冲洗加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺，用针头把加样槽之间的胶齿弄直，将凝胶装置从制胶架中取出，放入电泳槽盒中，并在电泳槽

44、内加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。 4. 样品处理 （1） 待测蛋白质样品处理 经37培养过夜的大肠杆菌菌液1.5ml， 6000rpm离心10min，弃上清加入TE缓冲液（0.1molTris，10mmol/L EDTA）50l，将菌体再旋涡器悬浮，再加入2样品缓冲液50l混匀，在100水浴中煮沸5min。 （2） 标准蛋白质样品（蛋白质Marker）的处理 将已分装好的10l标准蛋白质样品中加入10l样品缓冲液，混匀，在100水浴中煮沸5min。 5. 加样 待样品冷却后，用微量进样器（或加样枪接上小吸管），吸取1030l样品，按号依次加入样品槽，因样品液内有甘油，可使样品沉降在凝胶面上。

45、 6. 电泳 加样完毕，将上槽（黑色电极）接负极，下槽（红色电极）接正极，打开直流电源，先把电压调至8v/cm（80v），待染料前沿进入分离胶成狭窄带时，将电压提高到12v/cm（120v），电泳1.5-3h后，直到溴酚蓝指示剂迁移到接近凝胶底部时立即停止电泳。 7. 剥胶 从电泳槽上卸下凝胶板，放置在纸巾上，用刮勺（或取胶器）撬开玻璃板。 8. 染色以及脱色将电泳后的凝胶板轻轻取下，放入染色液中染色，20min1h后，把染色液倒回瓶中，加入脱色液，脱色4-8h，其间更换脱色液3-4次。可将凝胶浸于水中或固定在20%甘油中或抽干，干燥后成胶片保存或拍照。 蛋白质分子量计算 电泳迁移率的计算：

46、按下列公式计算蛋白质样品的相对迁移率（MR） 相对迁移率（MR）=（蛋白质样品移动距离/脱色后胶长）（染色前胶长/指示剂移动距离） 根据蛋白质迁移率按上述直线方程式即可计算出蛋白质分子量。 注意事项： 1. 丙烯酰胺时有毒试剂，操作时务必小心，切勿接触皮肤或溅入眼内，操作后注意洗手。 2. 制胶过程 封槽制备分离胶（下胶）快速倒入玻璃夹层，至短玻璃上端约3cm停止用滴管小心快速加入蒸馏水约2ml封胶分离胶凝聚后（约30min），甩干水配制浓缩胶（上胶）快速倒入插梳子浓缩胶凝聚后拔梳子（约20min）电泳槽内灌入1甘氨酸缓冲液800ml把胶柱弄直。 3. 样品处理及电泳过程 0.5ml菌液6000rpm离心10min收集菌体弃上清加50l TE缓冲液菌体悬浮加50l 2蛋白样品缓冲液，混匀100水浴煮沸15min冷却后取10-30l上样电泳4-6h（浓缩胶90V约30min1h，分离胶120V约1-2h）倒出电泳缓冲液，用水冲洗电泳槽小心撬开玻璃，剥胶用考马斯亮蓝R250染色20min1h加约200ml脱色液脱色过夜弃去脱色液，用水冲洗凝胶观察结果。 附一： 低分子量标准蛋白质液的组成 蛋白质 分子量（Da） 兔磷酸化酶B 97,200 牛血清白蛋白