创新实验11.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流创新实验11.精品文档.重庆医科大学大学生科学研究与创新实验项目 申 请 书项目名称：探究 Viperin与HBV的影响申 请 者： 张浪生指导教师： 单 位：重庆医科大学电 话：13368383014申请日期 ：2016 年 3月4 日重庆医科大学实验教学管理中心研究项目项目名称探究viperin（抗病毒免疫因子）对通过使用AAV8为载体通过rAAV-1.3建立乙肝小鼠模型的抗病毒作用，以及Viperin与HBV的相互关系所属学科免疫学申请金额 元起止时间20 年 月至 年 月项目性质学生自选研究课题（选其一）科研小组成员姓名性别年级电话及

2、电子邮箱张浪生男2014级13368383014Jhnsoncqmu指导教师研究内容和意义简介(40050字)肝炎病毒感染极大多数都会发展成为慢性乙型肝炎，慢性乙型肝炎是全球常见的传染性疾病，病程长，治愈率低，个体差异大，成为巨大的健康负担。因此国内外对乙肝病毒的感染机制都进行的较多的研究，进过长时间的发展经过几十年的发展，免疫学取得了极大的突破，并且现阶段的研究也已经进入了分子研究的水平和阶段，而乙型肝炎防治也取得了极大的进步，研究表明，HBV的感染和损伤机制与免疫学有极大的关系，而其中对Viperin（Virus inhibitory protein, endoplasmic reticu

3、lum associated, interferon inducible）的抗病毒机制有了较为深入的了解，基于大量的实验研究，本研究尝试探究Viperin 与HBV之间的基本关系，据文献，在与宿主相互作用的长期进化过程中,某些病毒能够抑制细胞内Viperin的表达,逃逸其抗病毒功能，本实验试图通过动物实验的方式检测其感染HBV小鼠的viperin 表达，另一方面，通过rAAV8-1.3HBV建立乙肝感染小鼠模型，通过检测相关的HBV DNA参数和(PCR手段)检测建模是否成功，根据目前国内外的研究，尽管Viperin与其他相关病毒的作用机理有了较为深入的认识，但在Viperin 和HBV之间相

4、互作用依旧是较为空白的一块，因此本研究可以一定程度上弥补相应的空白并且可以为乙肝病毒感染免疫机制有更加深入的了解。一、立论依据(项目的研究意义和国内外研究现状分析，附参考文献)1研究对象乙型肝炎病毒HBV感染极大多数都会发展成为慢性乙型肝炎，慢性乙型肝炎是全球常见的传染性疾病，病程长，治愈率低，个体差异大，成为巨大的健康负担。Viperin（抗病毒免疫因子）毒感染宿主后，病毒核酸和蛋白质会激发机体免疫保护系统。机体先天性免疫保护系统作为抗病毒感染的第一道防线，会激活细胞内信号通路释放多种细胞因子，以抑制病毒的增殖，干扰素（，）作为其中重要的细胞因子之一，在机体细胞与病毒的相互作用中发挥着重要作

5、用。干扰素分为三种类型：型干扰素（，），型干扰素（）和型干扰素（）。干扰素通过结合细胞表面特异受体，诱导上千种干扰素刺激基因（，）的表达，其中不少具有抗病毒活性，被称为先天免疫因子。多年来，尽管人们不断探索干扰素在宿主与病毒相互作用中的机制，努力揭示先天免疫因子的作用机理，但迄今仅对少数分子的抗病毒机制有较深入了解，即为其中之一。在细胞内的本底表达水平较低，但被多种物质诱导后表达显著增高，如型干 扰 素、多 种 病 毒、 和 （：）等。被诱导表达可概括为干扰素依赖和干扰素非依赖两种通路。抗 抗体能够完全抑制 表达等实验证明， 干扰素在 诱导表达中起重要作用 。肝脏内 NK 细胞的数目在免疫耐受

6、阶段相比于免疫清除和不活跃携带期有明显的增高12。它们表达活化型和抑制型受体。IL-10 和 TGF- 是维持免疫耐受的关键因素，IL-10 调节 NK 细胞活性和功能，诱导 T-细胞的抑制，从而抑制肝脏的免疫应答和免疫监视13。HBV 持续复制的患者血清中存在较高浓度的 TGF-1，TGF-1通过下调 NK 细胞上活化型受体 NKG2D-DAP10 和 2B4-SAP 的表达，从而增加 HBV 的持续性复制，HBT 患者的 NK 细胞由于缺乏这种双激活信号使其功能受损，细胞毒和分泌IFN- 的 能 力 下 降 ，阻 断 NK 细 胞 抑 制 性 受 体NKG2A，增加人 NK 细胞活性并清除

7、小鼠的 HBV感染14-15 乙肝免疫耐受分子机制的研究进展*1，。由此我们得出由于IFN-的分泌能力下降，导致viperin分泌减少，由此我们得知乙肝病毒的复制与viperin的分泌存在一定的相关性。近年来，建立合适的乙型肝炎也取得了很大的突破，HBV作为一种嗜肝病毒都有较强的种属特异性和组织特异性， 例如人乙肝病毒的自然宿主只有人类和非人灵长类 （如黑猩猩）， 通常只侵犯肝脏组织。参考文献1. 百度百科2. 维基百科 3Richard E Randall S1 ，：， ，（）：， （）， ， （）：这给建立合适的乙型肝炎感染动物模型带来了极大的困难，黑猩猩等非人灵长类动物许多属于濒危物种，

8、数量稀少、来源困难、价格昂贵，并且乙型肝炎实验动物模型的研究进展 受到伦理方面的限制。 因此，将这类动物作为乙肝试验动物模型具有很大的局限性。而随着研究的发展，使用小鼠建立感染模型也日渐成熟，据相关研究AAV1、2、5、8、9 载体为使用 rAAV-1.3HBV 建立乙肝小鼠模型提供了更多的载体选择种类，为进一步探索 HBV 致病机制、病毒与宿主相互作用研究以及药物与疫苗评价奠定了基础。 据国内外的相关研究和报道，目前对于Viperin与相关病毒研究见表1，而对于viperin和HBV相互关系的研究几乎还是空白，因而本研究尝试通过研究实验动物体内viperin 水平的表达和HBV相关病毒指标的

9、对比变化，探究viperin和和HBV之间的大致关系，为相关后续研究奠定基础。二、研究方案1.研究目标、研究内容、研究方法：研究目得，到viperin和HBV之间的具体数关系初步推断HBV感染与viperin 的相关性。研究内容，主要是成功建立AAV8载为使用Raav-1.3HBV建立乙肝小鼠模型，并且通过相关数据指标检测是否建模成功，此外通过检测建模成功的小鼠的体内viperin水平，来研究二者的相关性。研究方法，对照实验的方法，设置实验组和空白组，控制变量法。1. 大鼠分组及大鼠HBV感染模型的建立和Viperin基因敲除小鼠模型的建立(1) 大鼠60只，4-6周龄，体重（20-25g），

10、只要雄性(2) 将其随机分为四组。预实验组2只，实验组18只，对照实验组18只，空白对照组18只。(3) 对于，实验组，实验对照组大鼠进行尾静脉注射Raav8-1.3HBV滴度液（注射剂量为1*vg/只，对照组小鼠注射同样剂量的PBS。(4) 采集大鼠的血液组织样本毒第 2、4、8 周后，对每只小鼠分别进行尾静脉采血，分离血清。8 周后采用眼球取血法取全血，用颈椎脱臼法处死动物取肝脏，肝脏分为两部分一部分液氮速冻保存在80 ，一部分保存在 10%福尔马林中。 所有实验操作程序均经过实验动物使用管理委员会批准。 （5）免疫学相关数据检测 清中 HBeAg、HBsAg 检测小鼠取血后室温放置 2

11、h，4 过夜，第二天 3 000 r/min 离心 10 min 取血清。将注射病毒后第 2、4、8 周各组小鼠血清稀释一定倍数，按照 HBeAg、 HBsAg 诊断试剂盒 (酶联免疫法)说明书操作，测定 OD 450 。根据血清标准品作标准曲线，定量测定血清中 HBeAg 和 HBsAg 的表达。1.4 定量 PCR 法检测 HBV DNA 拷贝数 提取肝脏和血清全基因组 DNA，使用乙肝病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒确定肝脏组织和血清中的 HBV DNA 拷贝数。1.5 免疫组化检测 HBcAg采用组织芯片 (TMAs) 列阵进行免疫组化检测，通过设计组织芯片，HE 切片镜下划片，制备组织

12、芯片空白蜡块模、比照切片组织蜡块1.6Viperin 组分的相关检测1.7IFN-水平检测（6）肝脏标本制备实验数据记录如下实验组HBeAgHBsAgHBV DNA拷贝数ViperinIFN-水平老鼠1老鼠1老鼠1老鼠1老鼠1老鼠1平均值对照组HBeAgHBsAgHBV DNA拷贝数ViperinIFN-水平PBS老鼠1老鼠1老鼠1老鼠1老鼠1老鼠1平均值血液中的HBV DNA拷贝数量和肝脏中HBV的拷贝数。HBcAg的2.4.6.8周样本要记录实验数据2拟解决的关键问题：从数量上分析Viperin与HBV之间的相互作用和关系3.研究技术线路 标本中Viperin水平的检测定量PCR法测定rA

13、AV8-1.3HBV重组病毒的基因滴度注射剂量为1*vg/只对照小鼠注射相同剂量PBS在注射病毒的第2、4、8周后进行尾静脉采血血清中的HBeAg、HBsAg检测免疫组化检测HBcAg定量PCR法检测HBV DNA拷贝数结果分析验证是否建模成功酶联免疫法分析IFN-数据分析 44.行性分析：（1）实验室可行性： 本研究基于重庆医科大学生物工程研究所，免疫学研究室，是高水平的实验研究平台，实验室设备条件优良，实验能够开展。(2)技术可行性： 本实验的关键在于HBV感染小鼠模型是否能建立成功。本实验所用到的关键技术都来自于已有文献，技术成熟可靠；且已经从论文中获得详细的技术步骤，当前实验室可以实现

14、。（3）理论可行性：目前，对乙肝病毒大鼠感染模型的建立有了较为坚实的研究基础并且，且对于Viperin的研究也在免疫学上有了一定的发展，这为本实验的开展奠定了理论基础。（4）人员可行性： 本项目成员为大一到大三的各专业的学生，具有综合的知识水平和较高的解决问题的能力，大家都刻苦负责，具有良好的能力。5.技术关键：1小鼠模型的建立。 2.后期数据的处理和分析。6.研究工作进度安排：2015年12月到2016年3月课题选择标书撰写 2016年3月到2016年六月参加答辩完善标书 2016年7月到-8完成实验研究 2016年9月-12月完成论文 2017年开始投稿发表7.本实验特色和创新：1.首次将

15、Viperin和HBV联系起来探究二者的关系8.预期研究结果：（1）探究出Viperin和HBV二者之间的基本关系，为后续的乙肝免疫等的研究奠定基础。 （2）在专业杂志上发表1到2篇论文。三、研究基础1. 1.与本项目有关的工作基础2. 2.已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径四、经费预算申请资助金额元自筹经费来源及金额学校支 出 科 目金 额计 算 根 据 及 理 由合 计实验材料费500各种材料的借用实验动物1050大鼠30只药品试剂12345其他 五、申请者承诺我保证上述填报内容的真实性。如果获得资助，我与本项目组成员将严格遵守重庆医科大学学生创新实验的有关规定，切实保证研究工作时间，按计划认真开展研究工作，按时报送有关材料，按时接受中期检查和结题验收。全体申请者签字： 年 月 日指导教师意见： 指导教师签字： 年 月 日院（系、中心）意见 主任签章： 年 月 日实验教学管理中心意见 主任签章： 年 月 日教务处审批意见 负责人签章： 年 月 日参考文献1 佚名. 抗病毒免疫因子Viperin的研究进展_朱春辉J. 刊名缺失, 出版年缺失, 卷缺失(期缺失): 页码范围缺失.