原核生物的同源重组.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流原核生物的同源重组.精品文档.原核生物的同源重组在生物细胞中，DNA或RNA分子间或分子内的同源序列能在自然条件下以一定的频率发生重新组合，这个过程称为同源重组（Homologous Recombination）。同源重组的频率与DNA或RNA序列的同源程度（即序列的相似程度）、同源区域大小以及生物个体的遗传特性密切相关，一般而言，同源程度越高、同源区域越大，重组的频率就越高。同源重组是生物进化的一种重要方式，对于原核细菌、噬菌体和病毒而言，同源重组现象的发生尤为普遍。3.1.1 原核细菌的基因转移程序 原核细菌的基因转移程序是基于物理学和生

2、物学的原理建立起来的，将质粒或噬菌体DNA导入细菌受体细胞的方法主要有以下几种：1Ca2+诱导转化法1970年，有人发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收l噬菌体DNA，此后不久，对这种程序进一步的优化实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，其整个操作程序如图3-1所示。将处于对数生长期的细菌置入0的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+协助细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的

3、42热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。此外在上述转化过程中，Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2和CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。1983年，有人除了用CaCl2和MgCl2处理细胞外，还设计了一套用二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率。目前，Ca2+诱导法已成功地用于大肠杆菌、葡萄球菌以及其它一些革兰氏阴性菌的转化。 2原生质体转化法在高渗培养基中生长至对数生长期的细菌，用含有适量溶菌酶的

4、等渗缓冲液处理，剥除其细胞壁，形成原生质体，它丧失了一部分定位在膜上的DNase，有利于双链环状DNA分子的吸收。此时，再加入含有待转化的DNA样品和聚乙二醇的等渗溶液，均匀混合。通过离心除去聚乙二醇，将菌体涂布在特殊的固体培养基上，再生细胞壁，最终得到转化细胞。这种方法不仅适用于芽孢杆菌和链霉菌等革兰氏阳性细菌，也对酵母菌、霉菌甚至植物等真核细胞有效。只是不同种属的生物细胞，其原生质体的制备与再生的方法不同。3电穿孔转化法电穿孔（Electroporation）是一种电场介导的细胞膜可渗透化处理技术。受体细胞在电场脉冲的作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得DNA分子直接与裸露的细胞膜脂双层

5、结构接触，并引发吸收过程。这项技术最早用于将重组DNA导入真核细胞，但最近已被发展用来转化大肠杆菌等其它原核生物。理论上来说，较高的电压和较长的脉冲时间有利于转化效率的提高，但在这种情况下细胞的生存率也大幅度降低，使得表观转化效率受到很大影响。因此，针对受体细胞的性质合理优化电场强度、脉冲时间和DNA浓度是获得最佳转化效率的必要条件。对于大肠杆菌来说，大约50ml的细菌与DNA样品混合后，置于装有电极的槽内，然后选用大约25微法拉第、2.5千伏和200欧姆的电场强度处理4.6毫秒，每微克DNA可获得1091010个转化子的理想转化率。虽然电穿孔法转化较大的重组质粒（100 kb）的转化效率比小

6、质粒（约3 kb）低1000倍，但比Ca2+诱导和原生质体转化方法效果要好，因为这两种方法几乎不能转化大于100 kb的质粒DNA。几乎所有的细菌均可找到一套与之匹配的电穿孔操作条件，因此电穿孔转化方法有可能成为细菌转化的标准程序。4碱金属离子法用高浓度的碱金属离子溶液（尤其是钾离子）处理细菌，可以提高质粒的转化率。这种方法的优点是能同时转化单体和线型质粒DNA。将细胞悬浮在氯化钾溶液中，然后在35%PEG的存在下，用质粒DNA进行转化，每微克DNA可获得103个转化子。研究表明，单价阳离子能诱导细菌细胞内自溶酶系统的活化，这是转化得以实现的机制。5接合转化法接合（Conjugation）是指

7、通过细菌细胞之间的直接接触导致DNA从一个细胞转移至另一个细胞的过程。这个过程是由接合型质粒完成的，它通常具有促进供体细胞与受体细胞有效接触的接合功能以及诱导DNA分子传递的转移功能，两者均由接合型质粒上的有关基因编码。在DNA重组中常用的绝大多数载体质粒缺少接合功能区，因此不能直接通过细胞接合方法转化受体细胞，然而如果在同一个细胞中存在着一个含有接合功能区域的辅助质粒，则有些克隆载体质粒便能有效地接合转化受体细胞。因此，首先将具有接合功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的细胞中，然后将这种供体细胞与难以用上述转化方法转化的受体细胞进行混合，促使两者发生接合作用，最终导致重组质粒进入受体细胞。接合

8、转化的标准程序如图3-2所示。整个过程涉及到包括受体菌在内的三种菌株的混合，即受体菌、含有接合质粒的辅助菌以及含有待转化重组质粒的供体菌。三者混合后，接合质粒即可从辅助菌株转移至供体菌，也可直接进入受体菌。含有两种相容型质粒的供体菌再与受体菌或辅助菌发生接合反应。此时细菌混合液中已出现多种形式的细胞，因为任何菌株接合发生频率都不可能达到100%。为了迅速而准确地筛选出仅接纳了重组质粒的受体细胞（即接合转化细胞），必须依赖于所使用的菌种和质粒上相应的遗传标记，例如携带接合质粒的菌株A不能在最小培养基上生长，且对抗生素X敏感；含有待转化的重组质粒的菌株B，也不能在最小培养基生长，它如果失去含有X抗

9、性基因的重组质粒，则同样对X敏感；受体细胞C能在最小培养基中生长，且在抗生素X和Y存在时不能生长。三种菌株首先在无抗生素的完全培养基中进行混合，短暂培养启动接合转化，然后迅速涂布在含有抗生素的最小培养基上进行筛选。此时，只有接纳了重组质粒的受体细胞才能长成菌落（克隆），其中为数极少的菌落含有双质粒。随机选择几个菌落，将之涂布在含有抗生素的最小培养基上，凡是在这种培养基中不能生长的菌落即为只含有重组质粒的受体转化克隆，因为只有接合质粒所携带的Y抗生素抗性基因能赋予受体细胞对Y的抗性。应当特别指出的是，在接合转化过程中使用的重组质粒与接合质粒必须具有互为相容性，否则两者难以稳定地存在于供体菌中。6

10、噬菌体转导法以l-DNA为载体的重组DNA分子，由于其分子量较大，通常采取转染的方法将之导入受体细胞内。在转染之前必须对重组DNA分子进行人工体外包装，使之成为具有感染活力的噬菌体颗粒。用于体外包装的蛋白质可以直接从大肠杆菌的溶原株中制备，现已商品化。这些包装蛋白通常被分成分离放置且功能互补的两部分，一部分缺少E组份，另一部分缺少D组份。包装时，只有当这两部分的包装蛋白与重组l-DNA分子三者混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装溶液被重组分子污染后均不能包装成有感染活力的噬菌体颗粒，这种设计是基于安全考虑。整个包装操作过程与转化一样简单：将l-DNA和外源DNA片段的连接反应液与两种包装

11、蛋白组份混合，在室温下放置一小时，加入一滴氯仿，离心除去细菌碎片，即得重组噬菌体颗粒的悬浮液。将之稀释合适的倍数，并和处于对数生长期的大肠杆菌受体细胞混合涂布，过夜培养即可用于筛选与鉴定。3.1.2 与同源重组有关的原核生物基因 原核生物细胞中的同源重组是个较为复杂的过程，涉及到下列多个基因的联合作用： 1recA基因在一项以高频转导细菌为供体、F-细胞为受体的大肠杆菌接合实验中，人们筛选出无法产生选择性突变子的F-克隆，从而分离得到recA突变子。它与野生型亲本株的不同点在于其转导缺陷特征，对紫外线和X射线呈现高度耐受性，既不为紫外线所突变，也不能使紫外线失活的l-噬菌体回复突变，更无法通过

12、紫外线诱导溶源噬菌体进入裂解循环。进一步的研究结果表明，大肠杆菌recA基因编码的RecA蛋白是一个39 kDa的单一多链肽，它作为一种重要的重组酶参与同源重组，其主要作用包括促进DNA同源片段的联会以及DNA分子间的单链交换。由于RecA蛋白具有依赖于单链DNA的ATP酶活性，因此涉及到所有耗能的DNA反应，如互补单链DNA区域的退火、线状单链DNA和环状双链DNA间D-噜噗结构的形成、线状双链DNA和环状单链DNA转变成线状单链DNA和环状双链DNA、两条线状双链DNA分子间的单链交联（即同源重组Holliday机制的中间体，图3-3）等。RecA介导的同源重组反应对单链DNA的结构要求与

13、同源DNA分子间的联会机制有关。在中性pH的条件下，RecA能大量结合于单链DNA，每个单体与单链DNA上的3-5个碱基结合，而且这种结合作用呈现高度的协同效应。此外，RecA还具有依赖pH和ATP等三磷酸核苷酸的双链DNA结合活性。这种持续的结合作用使得双链DNA有效地解离为单链，直到与含有大于50碱基的同源区域发生联会，并形成Holliday中间体hDNA。在RecA蛋白催化的D-噜噗分叉迁移反应中，单链DNA同化是单方向的，速度极慢，每秒仅几个碱基，并且存在着1%以上的错配碱基。RecA介导的链同化反应对于DNA底物具有较强的选择性，两种不同类型的反应证明了这一点。只有当双链DNA的3端

14、同源并互补于单链环状DNA分子时，它们的重组才能形成稳定的hDNA；类似地，在SSB蛋白存在的情况下，只有当线状单链DNA的3端与环状双链DNA同源时，hDNA结构才能产生。这说明单链同化反应只能沿着的固定方向进行，这个方向对双链DNA上的互补链来说是35；而对于入侵的单链DNA来说则是53。RecA蛋白要求单链或双链DNA分子上具有3同源末端以启动稳定的链同化反应。RecA促进DNA同源重组反应并形成稳定的重组产物，要求底物具备三个条件：即DNA分子间或分子内存在较高的同源序列、至少一种DNA底物呈单链结构、至少一条DNA链具有自由末端。但值得注意的是，当拓扑异构酶参与反应时，最后一个条件并

15、不是必需的。对纯化的RecA蛋白和完整细胞的研究表明，有效重组事件的发生至少需要4050个碱基对的同源性，30个同源碱基对通常不能发生联会作用。类似RecA的蛋白质广泛存在于各种细菌中，鼠伤寒沙门氏杆菌（Salmonella typhimurium）和奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）等细菌均含有能互补大肠杆菌recA突变株的DNA片段，并诱导SOS反应。它们所编码的蛋白质结构呈高度保守性，并且具有相近的分子量（约40 kDa），这表明由RecA蛋白介导的同源重组机制具有广泛的代表性。 2recBCD基因RecA蛋白质无疑是同源重组中最重要的蛋白组份之一，但是它只能催化同源联会

16、和链交换反应，不能控制重组过程中的其他步骤，如单链DNA区域的形成、连锁分子的拆分等。根据对大肠杆菌各种重组突变体的研究发现，除了RecA蛋白之外，还需要recB、recC、recD、recE、recF、recG、recJ、recK、recL和recN等基因的编码产物。在筛选大肠杆菌重组缺陷型突变株的过程中，相继鉴定了recB和recC突变子。其它细菌中也发现了与大肠杆菌RecBCD酶性质相同的ATP-依赖型脱氧核糖核酸酶，第一个关于这方面的报道来自于藤黄微球菌（Microccus luteus）。大肠杆菌的recB、recC和recD基因分别编码130 kDa、120 kDa和60 kDa的

17、多肽链，三者构成一个在同源重组中的功能单位RecBCD蛋白复合物。它是一个多功能的酶系，具有依赖于ATP的单链和双链DNA外切酶的性质，因此又称为外切核酸酶V。它能利用水解ATP释放的能量使线型DNA解旋，此外还呈现序列特异性的DNA单链内切酶活性。体外实验结果表明，如果系统中缺少SSB，RecBCD能进攻线型双链DNA的末端，一次解旋1000 bp左右的区域，其中一条链被切成45碱基的寡核苷酸，另一条链则成为1000个碱基左右的单链尾巴。RecBCD对线型双链DNA的外切活性最高，而对于平头末端的双链DNA来说，螺旋酶活性占主导地位。RecBCD只对具有平头末端或者几乎平头结构的线型DNA分

18、子呈现解旋功能，而对超螺旋、缺刻、含10到774个碱基缺口的环状双链DNA或含大于30碱基的单链结构的线型DNA分子均无活性。由RecBCD产生的单链DNA可能是RecA促进联会反应的主要底物。从理论上讲，RecA蛋白介导的同源重组反应可以发生在DNA链上的任何同源序列之间，但是实际上某些序列（即重组热点）发生重组的频率要远远高于其它序列。迄今已知的重组热点主要是Chi位点，最初是在突变的l-噬菌体中发现的。纯化的RecBCD酶切割含Chi位点的DNA比不含Chi的DNA有效得多，在Chi处重组频率显著增加，而位于Chi上游约2.02.5 kb处的重组呈指数减弱。RecBCD解旋DNA后，从C

19、hi位点伸出的单链结构是RecA和SSB蛋白形成D-噜噗的有效底物。大量的实验结果证实，所有RecBCD酶介导的重组过程都要求Chi或类似Chi的位点，而Chi位点只激活RecBCD重组途径，对RecE、RecF或l Red途径不起作用。通常，recBC无效突变株比recA突变株的重组水平高，这表明在大肠杆菌细胞内至少还存在着另一种依赖RecA但却独立于RecBCD的低水平重组途径。一种能强化这些低水平重组途径并同时使recBC突变株恢复重组能力的突变体被分离出来，经鉴定证实其中的关键基因为sbc，其编码产物实质上是recBC基因表达的抑制因子。 3sbcABC基因某些sbcA缺陷的大肠杆菌K

20、-12株，可以通过sbcA基因的回复突变，或者与不含rac原噬菌体的F-菌株接合，重新产生具有重组活性的rac原噬菌体。相关实验发现，l-噬菌体的red-gam突变体在含rac原噬菌体的大肠杆菌宿主中，会产生极少量的拟回复突变体，但这种现象在其它大肠杆菌中并不出现。进一步研究表明，这些l-噬菌体的拟回复突变体中含有部分rac原噬菌体，并在其裂解循环中产生不依赖ATP的核酸酶。对含有recBC-sbcA双重突变的大肠杆菌重组缺陷株的遗传分析发现，rac原噬菌体基因组上的recE位于控制它表达的sbcA附近，编码核酸外切酶ExoVIII，由3或4个约140 kDa的多肽组成。DNA序列分析表明，s

21、bcA突变子呈现一系列的结构改变，如点突变、缺失和倒位等。此外，sbcA基因的突变能使recE基因与另一个基因融合，或者通过改变转录和翻译调控位点激活recE的表达。从rac原噬菌体缺陷的大肠杆菌菌株中，还可以分离出recBC的第二种抑制基因sbcB。与具有核酸酶活性的sbcA突变株不同的是，sbcB突变株缺乏ExoI的核酸酶活性。ExoI从3端消化单链DNA，同时释放出5单核苷酸。一种可能的假设是，ExoI破坏了趋向形成重组子的DNA结构。xon和sbcB是等位基因，因为它们的突变都会使ExoI失活。此外研究结果还表明，单独的sbcB突变不足以恢复recBC突变株的重组功能，必须在另一位点s

22、bcC的突变才能使recBC突变株有效进行DNA重组反应。recBC-sbcB突变株中常伴随着sbcC的突变，这一现象暗示recBC突变株DNA重组过程的抑制同时需要sbcB和 sbcC两个基因的协同作用。 4recE基因recE突变株是通过筛选无法与高频转导菌株同源重组产生原养型噬菌体的recBC-sbcA突变株时获得的。recE靠近sbcA，通常表达少量的ExoVIII。ExoVIII从3端将双链DNA中的一条链降解成5-单核苷酸，它对双链末端结构具有明显的偏爱性，缺刻或缺口DNA不是良好的底物。外切反应形成的单链DNA分子或含3突出末端的双链DNA分子，能与其他的双链DNA片段相连，这是

23、同源重组过程中的一个重要步骤。ExoVIII、l-核酸外切酶与RecBCD一样，都能作用于线型双链DNA分子并产生3末端结构，但后者是通过解旋DNA起作用的。 5recF基因与recE突变株相同，recF突变株也是在筛选recBC-sbcB-sbcC突变菌是获得的，它位于dnaN和gyrB之间。突变区域的DNA序列分析结果表明，此处含有一个编码357个氨基酸的开放型阅读框架，与dnaN基因重叠一个碱基，并于gyrB编码区的前28个碱基处结束。体外实验结果表明，在l-噬菌体强启动子PL和PR的控制下，recF基因低水平表达一个40 kDa的多肽，其功能可能是调节RecA蛋白的DNA链传递活性或者

24、调控相关调节基因的表达。3.1.3 同源重组途径在综合分析recBC和sbc突变株遗传特性的基础上，可以建立大肠杆菌同源重组途径的大致轮廓，这些途径与氨基酸等小分子的生物合成反应序列非常相似。在野生型大肠杆菌细胞中，recBCD途径对同源重组过程起主导作用；而recBC-sbcA和recBC-sbcB突变株则分别启用recE途径和recF途径。事实上，上述三条同源重组途径并不是完全孤立的，因为它们都要求recA基因的表达产物，共享RecA蛋白的催化反应。RecBCD和ExoVIII产生单链DNA的3-OH末端作为RecA蛋白的作用底物，这与recBCD和recE途径中这两种酶在RecA蛋白催化

25、反应发生之前已经相互作用的事实相符。而且，假设ExoI在RecA蛋白之前发挥作用，那么它对单链DNA 3-OH末端的破坏可以解释其在recF途径中受到抑制的实验结果。这里必须指出的是，目前还没有直接证据表明这些反应发生的严格次序。某些对同源重组过程发挥重要功能的蛋白因子（如RecBCD复合物等），在或早或迟的步骤中都有活性，这对于重组途径的理解增加了复杂性。recBC-sbcA突变菌株中的接合重组需要recF基因的产物，它是recE和recF途径的共同效应物都要求RecF的作用；另一方面，recE和recF两个途径也都需要recJ、recN和ruv基因的参与，因此这两个途径有很大一部分重叠，它

26、们可能仅仅在初始阶段不同。此外，由于只有recE和recF途径需要recF、recJ、recN、recO、recQ和ruv基因的编码产物，而recBCD途径并不需要这么多的蛋白因子，迄今尚未有证据表明recBCD途径中的SSB蛋白、DNA 聚合酶I、DNA连接酶和DNA解旋酶同时在recE和recF途径中起作用，因此recBCD途径与recE和recF途径很可能仅在RecA蛋白催化的反应处是相同的。大量的研究结果表明，细胞内的DNA同源重组采用何种途径取决于重组双方的分子结构。例如，recBC-sbcA突变株中的l-l型同源重组（red-）并不需要RecA蛋白，但recBC-sbcB或recB

27、C-sbcC的突变株却依赖于RecA的功能。类似地，在recBC-sbcA突变株中，质粒DNA之间的重组也不需要RecA，这可能是由于当联会中的DNA分子能自行复制时，recE途径不要求RecA蛋白。总之，不同的DNA底物分子选择激活并使用不同的重组途径。3.1.4同源重组模型在不同的同源重组机制中，单链DNA的3OH末端侵入双链DNA是非常关键的一步。本节阐述产生3OH单链末端以及形成重组交联分子的不同机制，这些机制依赖于在不同重组途径中发挥作用的蛋白因子和酶系，而归根结底取决于重组双方不同DNA底物分子的结构特性。 1RecBCD复合物和Chi位点介导的同源重组模型这个模型建立在对酶活力、

28、Chi位点遗传特性以及RecBCD突变株的分析研究基础上，其中Chi位点是肠道细菌中相关酶的激活信号，因此非肠道细菌不通过Chi序列进行重组。RecBCD复合物首先与双链DNA末端结合，同时解旋DNA产生噜噗环，进而形成兔耳结构（即双噜噗环）。当它遇到一个正确定位的Chi位点时，就会切割含5-GCTGGTGG-3序列的DNA链，将一个噜噗结构转变成两条单链DNA。RecBCD复合物持续地解旋延伸3-OH尾巴（末端含Chi位点），并同时重旋缩短5末端，直到导致第二个噜噗结构的消失。此时，RecBCD复合物从含缺口的双链DNA分子上产生一条约数千碱基长的3-OH单链DNA尾巴，RecA和SSB蛋白

29、则促进这一单链侵入到另一个双链DNA分子（由DNA促旋酶协助形成超螺旋）中，并产生D-噜噗结构，而被置换的另一条DNA链在RecA和SSB蛋白因子的帮助下与第一条链的单链缺口互补配对，这个过程可能需要DNA拓扑酶I的参与或者由RecBCD复合物切开D-噜噗结构。链交联形成的hDNA可以通过RecBCD复合物的解旋作用以及RecA和SSB蛋白的链传递作用不断延伸，在此期间Holliday中间体被切开（可能由RecBCD催化完成），并交换DNA末端形成两对重组分子，之后由DNA聚合酶补平缺口，DNA连接酶修复相应的磷酸二酯键（图3-4）。由于RecBCD复合物只有当从右向左解旋DNA时才能切开Ch

30、i序列，因而可以其解释对Chi位点的定向依赖性。D-噜噗结构是在RecA和SSB蛋白因子的催化下形成的，只有当单链DNA 3-OH末端与双链DNA具有同源性、且双链DNA呈负超螺旋构象时，这种结构才能产生。这些性质与Chi序列和RecBCD酶的反应极性以及DNA促旋酶对RecBCD催化的重组反应的要求是一致的。研究结果表明，l-噬菌体基因组的lac遗传位点与F性因子DNA上的lac基因通过RecBCD复合物发生高频重组，但它与大肠杆菌染色体上的lac位点交联却属于RecBCD非依赖型的低频重组。质粒DNA与染色体DNA之间的同源重组独立于RecBCD复合物的性质与这些分子的环状结构相吻合，它们

31、主要通过recE和recF途径进行同源重组。 2recE和recF同源重组途径的模型在recE和recF的同源重组途径中，RecA蛋白促进同源的单链DNA与双链DNA之间的配对过程，ExoI（sbcB）和ExoVIII（recE）则破坏或者促进作为RecA蛋白底物的3-OH单链结构的形成。实验结构证实，recBC突变株能产生的重组的DNA分子，但它很快就被ExoI破坏了；sbcB突变株中的ExoI失活导致DNA同源重组沿recF途径进行；而激活recE基因表达的sbcA突变株则通过recE途径进行同源重组重组。由此可见，RecA、ExoI和ExoVIII的特性符合3-OH单链DNA末端作为re

32、cE和recF途径主要中间物的假说。ExoVIII只作用于线型双链DNA底物，而超螺旋、缺刻或含缺口的环状DNA分子均不能为ExoVIII作用，这与RecBCD复合物的底物要求相同。事实上，recE途径和recBCD途径一样可以进行高频重组，ExoVIII也能作用于RecBCD复合物的同一系列底物。ExoVIII在双链DNA的末端附近产生3-OH单链结构并启动重组过程，就象RecBCD复合物在Chi位点附近所发生的反应完全一样。与recBCD途径不同的是，recE和recF途径可以促进环状DNA分子（如质粒）之间的同源重组，但线型DNA与环状DNA（如l-噬菌体基因组的lac位点与大肠杆菌染色

33、体上的lac）之间的重组则较难发生，这可能是由于上述双链DNA分子中的缺口结构出现频率较低所致。DNA的3-OH单链末端在细胞中通常低频存在，而且极易被ExoI降解，但在RecBCD复合物的存在下，这种结构能高频产生，不被相对弱的ExoI酶破坏。形成这种3-OH单链DNA结构的酶系由在recF途径中起作用的recF、recJ、recN、recO、recQ或ruv基因编码，但不属于recBCD途径中的基因。由于recE和recF途径也需要RecA蛋白，可以预计这两个途径同样包含了RecA蛋白在recBCD途径中所负责的反应，此外，recBCD途径中其他的蛋白因子（如SSB蛋白、DNA促旋酶、DN

34、A 聚合酶和DNA连接酶）在recE和recF途径中仍然催化类似的同源重组反应。3.1.5同源重组的影响因素在一项研究中，通过测定微质粒pVX上胰岛素编码区与l-噬菌体DNA同源序列之间的重组频率，分析出大肠杆菌细胞内重组频率与DNA序列同源性的正相关性。DNA分子间同源重组的最小长度比形成DNA双螺旋稳定结构物的长度略长，也比存在于大肠杆菌染色体上的具有独立遗传性的寡核苷酸的长度略长。pVb质粒和l-噬菌体之间的重组频率随长度的增加而不断提高，并以大约74个碱基对为转折点。在74313个碱基对的同源序列之间的重组率随长度呈线性提高，即313个碱基对的重组率是74个碱基对的3倍，也就是说在这一

35、同源长度范围内，重组频率与可进行重组的位点数目成比例。当同源碱基对数少于74时，重组率随同源长度减少呈指数下降，例如同源碱基对数从74依次减少到53、30、20时，每一步的重组率几乎都分别比前一步降低10倍。在T4噬菌体系统中，重组率与50200的同源碱基对数呈线性关系，T4噬菌体与含T4-DNA的质粒之间的重组在同源DNA长度达到76碱基对时明显上升。pVb和l-hI1DNA之间16个同源碱基对的重组频率只有20个碱基对的1/100，也就是说，从16碱基对到20碱基对重组率的大幅度提高不仅仅是DNA双螺旋结构稳定性的要求，而且还可能是重组过程本身需要增加同源性，以形成包括蛋白质和DNA在内的

36、稳定的同源复合体。最小同源重组碱基对数为20的系统发生异源重组的概率只有最小碱基对数为15的1/1000。3.1.6 同源重组在途径操作中的实际应用利用质粒DNA（或重组DNA）与宿主细胞染色体DNA之间的同源性引入遗传重组是一种非常简单有效的方法，已有许多成功的例子：（1）将携带温度敏感型复制子的质粒pSC101转化大肠杆菌宿主菌，在质粒不能复制的极限温度44时，转化子的染色体DNA与质粒上的同源序列发生同源重组，此时可以筛选出质粒整合子。当生长温度逐步下降到允许质粒复制的30时，转化子发生第二次重组，整合型的质粒从染色体DNA上脱落下来，此时染色体上或发生基因置换或保留基因原拷贝（图3-5

37、）。由于可以借助于选择压力维持剥落的重组质粒，因而这种方法也可用来缺失宿主细胞染色体上的生理必需基因，即所谓的基因敲除战略。（2）利用大肠杆菌的单链DNA整合型载体转化绿色产色链霉菌（Streptomyces viridochromogenes），被硫链丝菌素抗性基因（tsr）灭活的pat基因置换了宿主染色体上的同源基因（图3-6），并分离出不能合成PTT的重组突变株，这是第一个利用非复制型大肠杆菌载体以DNA单链形式产生抗生素合成缺陷型突变株的报道。当供体DNA呈单链结构时，绿色产色链霉菌的整合频率大幅度提高。（3）ColE1型重组衍生质粒（如pBR322）在宿主细胞中独立于染色体而进行的自

38、主复制需要polA 基因编码的DNA聚合酶I的参与。将此类载体质粒或重组质粒转化polA缺陷型的突变株中，能有效启动同源重组的发生，而且该系统的宿主范围较广，包括大肠杆菌和沙门氏杆菌等，因而具有很强的实用价值。（4）利用大肠杆菌中多拷贝质粒分配的不均匀性分离染色体基因发生置换的突变株，也是一种独特的思路（图3-7）。在大多数情况下，多拷贝质粒在两个子细胞中的分配是随机的，含有较少质粒拷贝的细胞在分裂过程中往往会形成无质粒的后代，而多拷贝质粒的集聚以及外源DNA大片段的插入都会造成质粒的分配不稳定性，因而只要是染色体基因可分配并具备发生同源重组条件的菌株，就可以用此法构建相应的突变株。如上所述，

39、利用同源重组技术可以在宿主染色体DNA上造成序列特异性的插入、缺失或置换突变，包括扩增途径关键基因、定向灭活靶基因、以及引入新基因等，这是途径工程操作的重要有效手段。其中，根据同源重组原理合理设计和构建不同结构的重组质粒就能分别甚至达到上述目的。 1利用同源重组技术定向灭活靶基因首先克隆待灭活的靶基因，然后体外构建该基因结构部分缺失的重组质粒，后者导入宿主细胞，质粒上的缺陷基因通过与染色体上的靶基因发生两次同源重组将之交换下来，同时自身进入染色体中。当重组质粒被消除后，转化子原靶基因控制的性状便会消失。例如，林可链霉菌（Streptomyces lincolnensis）B48株的染色体上含有

40、林可霉素生物合成基因簇，将含有被tsr灭活的部分林可霉素生物合成基因的大肠杆菌重组质粒转化林可链霉菌B48株的原生质体，并用每毫升5微克的低浓度硫链丝菌素筛选转化子，获得两个长出浓密孢子的菌落YY1和YY2。以tsr基因为探针进行第一轮杂交，两个菌株皆呈现1.5 kb的阳性片段，说明它们是同源重组子；再以大肠杆菌载体质粒上的lacZ基因为探针进行第二轮杂交，只有YY2出现4.4 kb的阳性条带，说明它是同源整合子，而YY1则是同源交换子或二次重组子。如果待灭活的靶基因是宿主细胞生长代谢所必需的，那么就要充分考虑必需基因的灭活会抑制细菌的生长。为此，需要采用先整合后脱落的程序筛选突变株（图3-8

41、）：先将含有被卡那霉素抗性基因（Km）灭活的asp同源基因的无复制子质粒整合到宿主的染色体上，然后再向细胞内补充必需基因，使得染色体上的两个同源拷贝之间发生二次重组。在此情况下，染色体上丢失了Km标记基因的克隆即为所需的同源重组子。最后，再以同源基因取代必需基因拷贝，就可以达到改造代谢途径的目的。 2利用同源重组技术扩增途径关键基因为了疏通细胞内代谢途径中的限速步骤，常采用扩增关键酶基因拷贝数的战略。为此，可将克隆到的关键酶基因加装强启动子，与标记基因串联到无复制能力的载体质粒上，并转化宿主细胞进行同源整合反应，最后利用标记基因筛选所需要的同源整合子（图3-9）。本法操作简便，但缺点是整合后染色体的双拷贝之间易发生第二次重组，所以在大规模生产应用过程中需定时更新菌种，以保证其不退化。 3利用同源重组技术引入新基因在宿主染色体DNA的特定位点上引入新基因，首先需要克隆包括该位点的一段序列，然后体外将待引入的新基因和一个合适的筛选标记基因插在其内部，并与无复制能力的载体质粒进行拼接。上述构建的重组分子转化宿主细胞，新基因和标记基因两侧的DNA序列与染色体上的同源序列便发生同源交换，最终以标记基因筛选突变株（图3-10）。