吉大农学部09生计植物转基因及其安全性题库2009.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流吉大农学部09生计植物转基因及其安全性题库2009.精品文档.植物转基因及其安全性试题库一、名词解释1、PCR：多聚酶链式反应，用于体外扩增DNA片段。2、分子克隆工具酶：基因工程技术中能用于DNA和RNA 的合成、切割、连接和修饰的各种酶。3、基因沉默：基因沉默是指转基因植物和转基因动物中，外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低的现象。4、限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列, 并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3-OH基团和5-磷酸基团的DNA片段的内切脱氧核糖

2、核酸酶。5、受体细胞：受体细胞也叫宿主细胞。受体细胞有原核受体细胞(最主要是大肠杆菌)、真核受体细胞(最主要是酵母菌)、动物细胞和昆虫细胞(其实也是真核受体细胞)。6、穿梭质粒载体：是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。7、脉冲电场电泳法：这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。8、报告基因：指其编码产物能够被快速的测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。9、探针：在分子杂交中用来检测互补序列的带有

3、标记的单链DNA或RNA片段。10、转基因生物：用基因工程技术导入外源基因的动植物，且外源基因能通过繁殖而传代。11、选择标记基因：是指可使被转化的细胞获得其亲本细胞所不具备的遗传特性，从而使得人们能够使用特定的选择培养基，将转化的新细胞从亲本细胞群体中选择出来的一类特殊的基因。12、核酸分子杂交：把同源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程13、同裂酶：来源不同，但是具有相同的识别序列，如; BamH和Bst14、同尾酶：不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割的核苷酸靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端15、星号反应：酶的

4、识别效率降低的现象。16、质粒：独立于细菌染色体外、具有自主复制能力的共价双链闭合环状DNA分子。17、克隆载体：使目的片段能在细菌细胞中复制的载体18、表达载体：使目的基因能在细菌细胞表达为RNA或蛋白质的载体19、cosmid克隆载体：人工构建的含有DNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体20、荧光定量 PCR：是一种通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量的PCR技术。22、转基因技术：转基因技术是指用人工分离和修饰过的外源基因通过载体、媒体或其他物理、化学方法导入植物细

5、胞中并得到整合和表达，并通过对转化植株的鉴定选择，从而使其遗传性状发生改变的技术。创造出人类所需要的新品种或新物种。23、转基因食品：以转基因生物为食品或为原料加工生产的食品24、DNA变性：在物理或化学因素的作用下，导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键则不受影响。25、DNA复性：当促使变性的因素解除后，两条DNA链又可以通过碱基互补配对结合形成DNA双螺旋结构。26、退火：指将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA摸板互补区域结合形成杂交链。27、质粒不亲和性：在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能够在同一宿主细胞系中稳定地共存的现象。28、转化：指质粒DNA或

6、以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。二、简答题1、何谓基因沉默，它的作用机制有哪些？定义：基因沉默（gene silencing）是指生物体中特定基因由于种种原因不表达或者是表达减少的现象作用机制：基因沉默可以分为不同水平上的作用：转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默。a.转录水平的基因沉默是DNA水平上基因调控的结果，主要是由启动子甲基化或导入基因异染色质化和位置效应所造成的. siRNA可使与其序列同源的基因组位点甲基化。这种甲基化是由siRNA介导的转甲基酶作用的结果，如果甲基化发生在编码区，基因转录不受明显影响，但发生PTGS;若甲基化发生在启动子序列，则抑制了基因转录，出现

7、转录水平基因沉默(TGS)。此外，siRNA还能诱导DNA序列同源区的组蛋白发生甲基化等修饰或者改变染色体结构而抑制基因表达。 b.转录后水平的基因沉默是RNA水平基因调控的结果，这一过程分为启始和效应两个阶段。在启始阶段，较长的dsRNA(外源的或体内产生的)被Dieer切割成21一23nt的短双链siRNA;在效应阶段，siRNA与相关蛋白质结合形成RNA诱导沉默复合体前体;在解旋酶作用下，由ATP供能将siRNA双链解开，RISC前体被激活;正义RNA单链被释放而反义RNA单链则介导该活化复合物识别并结合至靶mRNA，在不需ATP参与下切割靶mRNA，核酸外切醉将切割片断彻底降解，使之失

8、去转录信息，从而特异性地抑制基因表达。2、设计PCR的引物应遵守哪些原则？ 引物长度： 15-30bp，常用为20左右。引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74），不能保证PCR扩增产物的特异性引物扩增跨度：以500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段引物碱基：G+C含量以40-60%为宜。G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带；ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 避免引物内部出现二级结构。避免两条引物间互补， 特别是 3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带引物 3端的碱基

9、要求严格配对。特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败引物中有或能加上合适的酶切位点。被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性引物量适宜：每条引物的浓度0.1 1umol或10 100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会3、用哪些方法可以检测转基因植物中的外源基因？l 报告基因的表达检测l 转基因植物的PCR检测l 外源基因整合的Southern杂交鉴定l 外源基因转录的Northern杂交检测l 外源基因

10、表达蛋白的检测l 生物学鉴定4、试述作为克隆载体的DNA分子必须具备的条件。 答：（1）具有复制起点（2）具有抗菌素抗性基因（3）具有若干限制酶单一识别位点（4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。5、细菌质粒的一般生物学特性? 1）很多细菌中已发现；2）是独立于细菌染色体之外的辅助性遗传单位，基因组绝大部分为双链环状DNA，不同质粒大小各异；3）大多数质粒的宿主范围较窄； 4）已发展进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝数；在不同的宿主细胞中拷贝数可能不同。5）复制转录的进行依赖于宿主编码的酶和蛋白质；6）常含有一些编码对细菌宿主有利的酶的基因。6、什么是限制性内切核酸酶的星号活性

11、? 受哪些因素影响? 星号活性：在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的现象。影响因素：1、甘油浓度过高;2、离子强度不合适;3、阳离子变化 ;4、pH变化;5、有机溶剂残留7、切口移位(nick translation)标记探针的主要步骤有哪些? 1）、将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA聚合酶I 的53的聚合酶活性和5 3的外切酶活性相结合。2）、首先用DNAase I 在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于E.coli的DNA pol I的53外切酶活性，切去带有5-磷酸的核苷酸；同时利用该酶53聚合酶活性，以互补的DNA单链为模板，使生物素或同位素标记的互补

12、核苷酸补入缺口的3末端-OH上。 3）、这两种活性同时作用，缺口不断向3方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针8、植物基因转化系统的选择原则?（1）对农杆菌敏感的植物应首先试用农杆菌载体转化系统，因为农杆菌转化是在理论和技术操作上都比较成熟的转化系统，而且转化效率高，转化植株的遗传稳定性最好。（2）原生质体培养容易的植物应该选择直接转化系统，因为其优点是既能获得高的转化率，又能克服转基因植株嵌合体的难题。（3）多胚珠植物可试用花粉管通道法，因为涂抹在柱头上的外源DNA可以随着许多花粉管进入子房，分别导入各卵细胞中，提

13、高转化率。（4）子房中有较大单胚珠的植物如核果类植物，宜试用显微注射法，因为将外源DNA直接注入卵细胞的可能性较大。（5）转化难度大的植物，即对农杆菌转化不敏感，原生质体培养困难的植物，应采用基因枪法。（6）根据供试外植体的特点选择相应的转化方法，如以整体植株为试材，则应采用注射法和花粉管通道法；以叶片为外植体，则应用农杆菌载体叶盘法或基因枪法。9、限制性内切酶的识别特点1）、大多数识别序列是很严格的，只有少数有变动的余地2）、识别序列的碱基数一般为46个碱基对3）、大多数识别位点具有180度旋转对称性，即回文结构(Palindromic)。10、影响限制性核酸内切酶反应效率的因素 1. 温度

14、：一般37C，有例外,如：BamH 30C， Sma I 25C，Taq 65C；2. 缓冲液：高、中、低盐之分 (NaCl)，pH值； 3. 时间：1-1.5小时 4. 反应体积和甘油浓度：酶1/10体积 5. DNA纯度与构型 （1）纯度：RNA，蛋白，氯仿，SDS，EDTA， EB，酚，乙醇，硫酸根，DNA （2）构型：切超螺旋需更多的酶 例: lmg l DNA, 用EcoRI 切, 1U 超螺旋 pUCl9, EcoRI 2.5U11、Klenow酶的基本性质及用途。 （1）基本性质： 大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端三分之二的大肽段,即Klenow酶。 Klen

15、ow酶仍拥有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了5 3的核酸外切酶活性。 （2）Klenow酶的基本用途： 补平由核酸内切酶产生的3粘性凹出末端； 抹平DNA的3粘性凸出末端； DNA片段的同位素末端标记； cDNA第二链的合成； 双脱氧末端终止法测定DNA序列。12、T4 DNA连接酶作用机制。 T4噬茵体DNA连接酶催化DNA连接反应分为三步： 辅助因子ATP中磷酸基团与T4 DNA连接酶上的Leu残基的NH2结合，形成酶-AMP复合物； 酶-AMP复合物活化DNA链5端的磷酸基团，形成磷酸-磷酸酯键；DNA链3羰的羟基活化与5端磷酸根形成磷酸二酯键，释放AMP，完成DN

16、A链间的连接。13、柯斯质粒载体的特点以及柯斯克隆的理论依据。特点: 1）具有噬菌体的特性（但因不含全部必需基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒）；2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因）；3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb, 克隆极限可达45kb左右）；4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。广泛应用于基因组DNA文库的构建。 理论依据： 1）在线性噬菌体DNA分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列（cos位点)。2）在噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个DNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个DNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的。3）

17、噬菌体具有的一种位点特异的切割体系,又叫Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点(38-45kb)，将多连体分子切割成单位长度的片段，并将它们包装到噬菌体头部中去。 14、核酸凝胶电泳的基本原理 1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移；2）由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数； 因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下、在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。15、DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率决定因素

18、DNA的分子大小，分子越大，则摩擦阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢； 琼脂糖浓度，一个给定大小的线状DNA片断，其迁移速率在不同浓度的琼脂糖中各不相同；DNA分子的构象：超螺旋的迁移率大于线性的大于单链开环的DNA。 电源电压，在低电压下，线状DNA片断的迁移速率与所加电压成正比。但是，随着分子量的增加，高分子量DNA片断的迁移率将以不同的幅度增长。因此，随着电压 的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小； 电场方向；碱基组成和温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。16、凝胶载样缓冲液的组成及其作用。 缓冲液的组成：EDTA、甘油、二甲苯青FF、溴酚蓝载样缓冲液有三个作用：1）

19、增加样品密度保证DNA沉入加样孔内；2）使样品带有颜色便于简化上样过程；3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。17、表达载体的必备条件。(1)能自主复制(2)具有方便、灵活的克隆位点和筛择标记(3)具有能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别的强大启动子(4)启动子应可受诱导调控(5)具有强终止子(6)具有翻译起始信号18、什么是转基因食品的实质等同性原则，转基因食品安全检验的五项原则是什么？ 答：实质等同性原则即如果某个新食品或食品成分与现有的食品或食品成分大体等同，那么它们是同等安全的。五项原则：1)如两者本质是相同的，用传统的安全性评价程序对转基因食品评价。2)如在一定范围内有差别

20、，用集中于对产生差别的因子进行评价。3)如果氨基酸序列与已知蛋白毒素的氨基酸序列是同系物，则要进行毒理学实验。4)如有蛋白质产生了抗营养作用，或营养成分发生改变，则要进行营养学评价。5)如两者完全不同或没可比的传统食品 ，则要特别设计动物模型试验证明其无毒后，须进行人体营养学试验。19、标记基因是什么，它有什么用处？标记基因涉及的安全性问题有哪些？ 定义：简称选择基因，是指可使被转化的细胞获得其亲本细胞所不具备的遗传特性，从而使得人们能够使用特定的选择培养基，将转化的新细胞从亲本细胞群体中选择出来的一类特殊的基因。用处：作为筛选标记，筛选出转基因是否成功。安全性问题：1.标记基因滞留在植物体内

21、并持久表达不仅给植物生长发育增加负担，而且给其它有利性状基因的表达带来不确定的影响。2. 对于环境释放或商品化生产的转基因植物而言，人们担心标记基因的抗性迁移会给目前使用的除草剂和抗生素带来挑战。3. 目前可供利用的标记基因数量是有限的，这给在植物中再次导入外源基因带来限制。20、标记基因安全性评价的内容？ 1标记基因有无直接毒性：任何DNA 都由4 种碱基组合而成, 目前所用的标记基因在DNA 组成上并无异常。转基因食品中外源基因的含量很少，与消化道中持续存在的其他DNA 相比是微不足道。 根据所有生物食品都含有大量DNA , DNA 在肠胃道中很快被降解, 标记基因的DNA 组成并无异常,

22、 WHO及 FDA)得出结论认为食物中的转基因DNA 本身并无安全性问题。2基因水平转移的可能性：人们食用转基因植物食品后，其中的绝大部分DNA 已降解, 并在肠胃道中失活。极小部分( 0 . 1% )是否会有安全性问题? 例如标记基因特别是抗生素标记基因会否水平转移至肠道微生物或上皮细胞,从而降低抗生素在临床治疗中的有效性? 目前的结论是: 这种可能性非常小, 除非在特例中需加考虑。理由是: 1） DNA 从植物细胞中释放出来后, 很快被降解成小片段, 甚至核苷酸, 因此植物DNA在进入有肠道微生物存在的小肠下段、 盲肠及结肠前已被降解。2） 即使DNA 完整地存在,DNA 转移并整合进受体

23、细胞也是一个非常复杂的过程, 包括许多步骤: (1)DNA 必须与细胞结合, 穿过细胞膜进入细胞, 且不被宿主细胞内的核酸酶及修饰系统降解。(2)受体细胞必须呈感受态。(3)为与受体细胞的基因组发生重组, 供体和受体至少要有一段20 bp 的DNA 完全同源。(4)要有合适的调控系统才能表达。(5)标记基因的表达只有在筛选压下才有优势, 对抗生素标记而言, 只有在口服抗生素后才有这种选择压。(6) 目前尚不知在消化系统中有植物DNA 转至微生物的机制, 上皮细胞又因新陈代谢、半衰期很短而被不断取代, 不可能保存下来。因此标记基因水平转移并表达的可能性极小，工程植物原材料及未煮过种子中的标记基因

24、DNA 不可能产生安全性问题, 经食品加工后的植物材料则更不可能。3未预料的基因多效性基因的多效性有的可预测, 有的则不可预测, 其效应可有利或不利。多效性包括次生效应, 如插入位点及插入基因产物所引发的 “下游” 效应, 影响代谢过程。如新霉素磷酸转移酶标记基因可改变细胞的磷酸化状态。21、基因工程诞生的理论基础是什么？现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明。理论上的三大发现：证实了DNA是遗传物质揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定技术上的三大发明：限制核酸内切酶的发现与DNA切割DNA连接酶的发现与DNA片段的连接基因工程载

25、体的研究与应用22、蓝-白筛选的原理？答：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。这些位点上如果没有克隆外源性DNA片段，在质粒被导入lac-的大肠杆菌后，质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色。由于这种颜色标志，重组克隆和非重组克隆的区分一目了然。23、PCR的基本原理？答：PCR是在试管中进行的DNA复制反

26、应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。DNA模板变性：模板双链DNA?单链DNA，94。退火：引物单链DNA?杂交链，引物的T

27、m值。引物的延伸：温度至70 左右， Taq DNA聚合酶以种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物末端为起点的53DNA链延伸反应，形成新生DNA链。新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。三、论述题1、目前常用的转基因方法有哪些，各有何特点？外源基因的间接转化法（载体介导法）（1）农杆菌介导法：它是目前双子叶植物基因转移的常用方法。它是利用根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌的Ri质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并插入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的

28、遗传转化特性,可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整合到受体染色体而获得稳定的表达。 （2）病毒介导法：病毒载体比较小,便于在实验中操作,而且这类载体只要与植物细胞共培养就可以较高地感染植物细胞,外源基因能在植物细胞中快速复制和高水平表达。但是病毒载体的容量有限,不能包装大片段的外源DNA基因组,寄主范围窄,复制稳定性差,转录和复制机理复杂。用的较多的是花椰菜花斑病病毒(CaMV)和番茄金花叶病毒(TGMV)。此法需要注意的是其他病毒侵染植株后可能会跟所用的载体病毒之间发生信息交换,进而导致载体病毒重新获得其致病能力”因此,其潜在的危害性必须予以足够的重视。外源基因的直接转化

29、法（1）化学诱导DNA直接转化：化学诱导DNA直接转化是以原生质体为受体，借助于特定的化学物诱导DNA直接导入植物细胞的方法。目前主要有2种方法：PEG介导法和脂质体介导法。（2）物理法诱导DNA直接转化：物理转化方法是基于许多物理因素对细胞膜的影响，或通过机械损伤直接将外源DNA导入细胞。它不仅能够以原生质体为受体，还可以直接以植物细胞乃至组织、器官作为靶受体，因此比化学法更具有广泛性和使用性。常用的物理方法有电激法、超声波法、显微注射法和基因枪法。 （3）花粉管通道法介导基因转化（种质系统介导法）：花粉管通道法是将外源的DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，使外源DNA沿花粉管通

30、道进入胚囊，转化受精卵或其前后细胞。这一技术可以应用于任何开花植物。2、植物转基因受体材料有哪些？试述选择受体细胞的原则。 答：受体材料有：原生质体、悬浮细胞、愈伤组织、胚状体、叶片切块其它受体：如花、子房、离体条件下的子叶、胚轴、茎段、根和体细胞胚、花粉等 原则：1）、高效稳定的再生能力；2）、受体材料要有较高的遗传稳定性；3）、外植体来源方便，如胚和其它器官等；4）、对筛选剂敏感；5）、转化率高3、说明Sanger DNA测序法与Maxam-Gilbert的化学降解测序法原理与方法的异同点。 （一）Maxam-Gilbert的化学降解测序法基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA

31、片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。测序步骤： 1、先用限制性内切酶把DNA切成100200bp 的测序材料； 2、取待测DNA的一股链，使其一端（一般为5端）用32P标记。 3、样品分成4分，分别在选定条件下与专一性试剂作用（4组特异的反应）。每一份样品各生成一套长短不等的放射性片段。 4、应用凝胶电泳分离每一反应的产物，放射自显影后，根据按长短排列、具特定末端碱基的DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。（二）Sanger的酶聚合测序法 (链终止法)基本原理如下：DNA聚合酶能够用单链DN

32、A作为模板，合成准确的DNA互补链；该酶能够用2，3-双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无53外切酶活性。测序步骤：用M13噬菌体做载体获得单链DNA模板，克隆并扩增待测DNA片段，使其变性。选择一条与DNA单链互补的短链引物，将引物用放射性同位素标记。引物先同单链模板复性。在四个反应管中分别加入待测DNA单链模板、互补引物分子、四种的dNTP、DNA聚合酶(Klenow 酶)以及不同的ddNTP。进行聚合反应 ，D

33、NA新生链延长，当掺入ddNTP时，聚合反应终止。 在聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶中电泳。根据X底片对凝胶曝光所显的条带位置，读出 DNA序列。二者本质区别在于：化学法利用专一性化学试剂使待测DNA在特定的碱基处裂解为长短不等的DNA片段； 酶法是在特定的2,3- 双脱氧核苷酸（ddNTP）的存在下，用合成的方法生成长短不一、具有特定核苷酸末端的DNA片段。4、试从基因工程本身的性质来分析基因工程存在的安全性问题。 狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因；广义的基因工程则指在分子水平上，提取不同生物的遗传物质，在体外切割，再和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA分子引入细胞或

34、生物体内，使这种外源基因在受体细胞中进行复制和表达，按人们的需要繁殖扩增基因或生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并能稳定遗传给下一代的技术。 随着植物转基因技术的逐渐成熟，在带给人们诸多方便的同时也带来了不少问题，包括：环境问题、转基因产品作为食品对人体健康问题、产品加贴标签问题、 运输问题、 国际贸易问题、 知识产权问题等已引起世界性的所谓 “生物安全” 的论战。目前对于转基因工程的安全问题主要涉及一下几个方面：1）人类、 动物或植物受到寄生、 受体或带菌生物的感染；2）因转基因生物、其组份或代谢产物而产生的毒性或过敏反应；3）由转基因生物所代表的产品产生的毒性或过敏反应；4）因意外释

35、放转基因生物而产生的环境影响；5）产生更多具有传染性或抗药性的微生物；6）将有害的基因物质 （例如与癌有关的物质） 通过转基因生物传给人类；7）会侵占周围环境， 替换掉已在该地长期生长的其他植物；8）转基因植物中基因物质的转移， 可能会转移至被认为是杂草的相关植物中， 例如通过使其增加抵抗力而变得更具竞争性；9）营养物质在环境中的自然循环受到转基因微生物的干扰等。现代生物技术既有极大的推动生产力发展的一面， 又有可能由于没有慎重使用这种技术， 而对人体健康和环境造成危险的一面。我们可以相信，随着科学的发展和完善，人类是可以解决转基因生物带来的安全性问题的5、试述聚丙烯酰胺凝胶电泳与琼脂糖电泳在

36、应用中有何不同和特点。 答：不同之处： 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳一般用于蛋白质与寡糖核苷酸的分离；琼脂糖凝胶电泳一般使用于DNA电泳； 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳的驱动力靠与蛋白质结合的SDS上所携带的负电荷；琼脂糖凝胶电泳的驱动力靠DNA骨架本身的负电荷； 3、结果的观察方法不同。DNA电泳普遍使用EB做染料，在紫外灯下观察；而蛋白电泳使用的考马斯亮蓝染色. 4、胶体系的差别，DNA电泳通常是一胶跑到底，而蛋白质电泳则会有分离胶和浓缩胶之区别。特点：聚丙烯酰胺凝胶电：1）凝胶透明，有弹性，机械性能好；2）化学性能稳定，与被分离物不起化学反应；3）对pH和温度变化较稳定,几乎无吸附和电渗作用；4）样

37、品用量少，灵敏度可达10-6g;5）凝胶孔径可调节；6）分辨率高。 琼脂糖电泳： 1）电泳操作简单，速度快，样品不需要先处理； 2）凝胶结构简单，均匀，含水量高，近似于自由电泳，电泳图谱清晰，重复性高，但分辨率不如聚丙烯酰胺凝胶电泳。 3）琼脂糖不吸收紫外，电泳结束可以直接用紫外观察。 4）电泳区易染色，便于半定量观察，也可制成干膜长期保存。6、提高PCR反应特异性的常用方法。1、巢式PCR（Nest-PCR） 巢式PCR使用两对引物进行扩增，它的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏 度，并且提高了困难PC

38、R（如5 RACE）的特异性。 2、 递减PCR（TouchDown PCR） 递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2,直到退火温度低于Tm 5。因此特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。3、 热启动PCR（HotStart PCR） 热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度；热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法

39、之一。4、 使用PCR增强剂甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。它们是通过是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。7、PCR扩增长片段DNA困难的原因及解决方法。原因 DNA聚合酶 。普通Taq酶缺乏3-5核酸外切酶活性 DNA模板 。较长的模板DNA难以充分变性,并容易形成高级结构， 抑制DNA聚合酶与模板的充分结合 反应缓冲液 。长时间的高温反应使缓冲液的缓冲能力下降，造成模板和产物DNA的破坏，二价阳离子在高温条件下促进DNA的降解解决方法： DNA聚合酶 ：使用具有35核酸外切酶活性和扩增效率高的两种聚合酶，调整两者的比例，以利于长片

40、段的扩增。 DNA模板 ：制备较高纯度的DNA模板 引物设计 ：30-35个碱基,避免形成二级结构和引物二聚体引物3端应与模板严格配对, 解链温度趋向相等。 反应缓冲液 ：选择有效的缓冲体系, 避免二价阳离子浓度过高 PCR反应条件 ：摸索合适的变性温度、反应时间和循环次数8、野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体存在的障碍及改造原则 障碍： 1）Ti质粒分子量过大，一般在160240kb，比pBR322质粒大50倍左右；2）大型的野生Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点，不能通过体外DNA重组技术直接向野生型Ti质粒导入外源基因；3）T-DNA区内含有许多编码基因，其中Onc基因的产物干扰宿

41、主植物中内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生；4）Ti质粒不能在大肠杆菌中复制, 即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增；5）Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。 改造原则： 除去T-DNA上的激素合成基因如：生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因; 除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长； 除去 Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度； 安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；5安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物基

42、因的启动子和polyA化信号序列；9、试述核酸分子杂交的原理及影响因素 核酸分子杂交的基本原理影响杂交的因素1、核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快，分子越大，复性速度越慢，单链探针，浓度增加，杂交效率增加，双链探针，浓度控制在0.10.5g,浓度过高影响杂交效率2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低2025 （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低53、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必

43、须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度 。4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在3542 杂交 （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68杂交 5、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉 10、简述各种酶促法标记探针的原理。（一）切口平移法 1、将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA聚合酶I

44、的53的聚合酶活性和5 3的外切酶活性相结合。2、首先用DNAase I 在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于E.coli的DNA pol I的53外切酶活性，切去带有5-磷酸的核苷酸；同时利用该酶53聚合酶活性，以互补的DNA单链为模板，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口的3末端-OH上。 3、这两种活性同时作用，缺口不断向3方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针（二）随机引物法 用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3- OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。 （三）PCR标记法：将标记的核苷酸作为PCR反应的底物，以待标记的DNA为模板，经PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中。（四）末端标记法 （1）一种是在5末端加成标记法：先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP转移加到DNA片段5-OH上。（2）在探针3-末端用末端转移酶掺入一个单标记的ddUTP。