在细胞毒T细胞的产生中嗜金属的巨噬细胞和CD8.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流在细胞毒T细胞的产生中嗜金属的巨噬细胞和CD8 脾脏是对血源性病原体诱导产生免疫反应的淋巴器官。在脾边际区中的专门的巨噬细胞有战略性地定位用于对病原体和细胞碎片的吞噬,但不认为在T细胞反应的活化中起作用。这里我们论证,脾边际嗜金属性巨噬细胞(MMM)在树突状细胞对血源性病原体的交叉-呈递中必不可少。我们的资料表明,以MMM为靶向的抗原以及血源性腺病毒可以有效被MMM捕获并专门转移到脾CD8 + DCs进行交叉呈递以及细胞毒T淋巴细胞的激活。边缘区中巨噬细胞的损耗阻止CD8 + DCs对细胞毒T淋巴细胞的激活。此外,我们发现以MMM为靶向肿瘤抗

2、原作为抗肿瘤免疫治疗是非常有效的。我们的研究指出脾MMM在CD8 + T细胞免疫初始阶段起到一个重要角色，捕获和集合血源性抗原并转移到进行交叉呈递的DCs,这可以被用于设计免疫接种策略来诱导抗肿瘤细胞毒T细胞免疫. 脾对血源性抗原诱导免疫反应是必需的并且有独特的体系结构。动脉血流终止于边缘窦，边缘窦位于边缘区(MZ)，该区在含有B细胞淋巴结核T细胞区的白髓周围。边缘窦通过网状细胞连接并包含边缘区B细胞和两种类型的巨噬细胞(M)(1,2)。边缘的嗜金属性巨噬细胞(MMM),其特点通过唾液酸结合的Ig样凝集素-1(小鼠唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-1,唾液酸粘附素,CD169)表达(3，4）,是

3、作为个紧密的网络位于白髓附近的MZ的中心部位,而边缘区巨噬细胞(MZM),特定地表达C型凝集素SIGN-R1 ,可以被发现在外部的MZ接近红髓(5)。MZM和MMM的一个亚群都表达I型清除剂受体MARCO(6)。 虽然目前在血液中MMM和MZM有效地着手处理微粒抗原(Ag),但它们目前为止被认为对T细胞反应的发生并不重要(8 - 10)。 相对于M,树突细胞(DCs)是专门的Ag呈递细胞，在引发主要Tcell反应中占据主导地位。鼠脾DCs根据表型标记的表达可分为两不同亚:定位和执行机能(11)。CD8 + DCs表达C型凝集素DEC205并被发现在T细胞区和外层边缘区(12)。他们是专门从事A

4、g的交叉呈递和活化以及细胞毒T细胞（CTLs)的免疫耐受作用(13)。 此外,他们对抗肿瘤特异性免疫反应的生产以及体内肿瘤的清除是非常重要的(17)。相反,CD8DCs专门从事CD4 + T细胞的激活。CD8DCs主要位于边缘区并选择性地表达C型凝集素DCIR2 。在激活时,所有DC亚群迁移到T细胞区(18)。 在本研究中,我们已经研究了脾M在CTL反应的激活中的作用。我们足以证明Ag到进行交叉呈递的CD8 + DCs的转移以及在Ag靶向作用于边缘嗜金属性巨噬细胞后诱导强烈的细胞毒T细胞反应。此外,MMM被证明含有腺病毒-编码的Ag并在静脉注射腺病毒的疫苗后对CTL反应的产生必不可少。我们的资

5、料显示,凭借进行交叉呈递的CD8 + DCs，利用MMM有效的Ag-集合能力，MMM和DCs间的生理合作。 这个过程可以用于目标策略来诱导抗肿瘤CTL反应。 结果Ag对MMM的靶向作用导致有效的CD8 + T细胞激活。为研究脾M在Ag呈递和T细胞活化中的作用,我们共价结合了OVA Ag成为各种单克隆抗体(mAb),专门对脾脏中不同的M亚群进行靶向作用。这是用一个单克隆抗体实现的，小鼠唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-1（Siglec-1）（只通过MMM表达）,清除剂受体MARCO（在边缘区巨噬细胞MZM上和MMM的一个亚群上强烈呈递）,F4/80（通过脾髓M表达）,和SIGN-R1（通过MZM特

6、定表达）。含有这些mAb的脾冻干切片染色法证实MMM和MZM上特定的表达模式(图,S1A),静脉注射抗体-OVA显示了它与确切M亚群的具体结合(图，S1B)。 为研究特定靶向是否会导致CD8 + T细胞活化的不同,mAb-OVA复合物连同激活的CD40 mAb静脉注射。免疫后7天，脾细胞在体外用H-2Kb OVA257264抗原决定簇再次被激活并了对细胞内IFN产量进行测量作为OVA-特定的 CD8 + T细胞诱导的一个量度。用指导Siglec-1和MARCO的OVA轭合物靶向MMM的Ag导致了大量CD8 + T细胞生产的IFN，但是在体内，用无关对照mAb免疫不能激活CD8 + T细胞(图1

7、A)。通过SIGN-R1靶向MZM或通过F4/80靶向红髓M导致较低的CD8 + T细胞反应，与无关对照mAb无显著不同(图1A)。 对Ag通过与不同的Ab结合靶向不同M亚群的效率的直接比较存在一些局限性。用能够显示亲和力和运输行为差异的Ab靶向不同表面受体，由于与Ag化学结合这可能进一步被改良,这些差别可以潜在地解释低CD8 + T细胞刺激靶向MZM或红髓M的Ab的能力。然而,将这些局限性考虑在内,我们的数据表明:对MMM的靶向作用导致有效的CD8 + T细胞引发。 已经是毫无疑问,为了CD8 +细胞毒T细胞的产生，CD8 +树突细胞表达DEC205是至关紧要的并且那个DEC205的特定靶向

8、导致强烈的CTL激活(16)。所以我们希望比较在Siglec-1-OVA复合体和DEC205-OVA复合体之间CTLs产生中的效率。 正如之前的报道(16),用DEC205-OVA对CD8 + DCs进行靶向作用导致强烈的CTL活化,通过在体内羧基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的脾组织（图，1B)死亡以及CD8 + T细胞产生IFN的频率(图1C)作为测量。在CD8+T细胞诱导中对MMM靶向作用与直接的DC靶向作用一样有效(图1B-D)。在一个共轭剂量（图1D）的广泛范围上，可比的效率很令人惊奇,因为连接到Siglec-1 mAb的OVA的数量大约是DEC205 mAb的6-折(图S

9、1C)。有趣的是,在用Siglec-1-OVA免疫后，我们不能检测CD4 + T细胞产生的IFN(图S2A)。 在体内MMM特定转移被捕获的Ags到CD8 +DCs。我们已经展示了对MMM靶向作用的卵细胞强烈激活OVA特异性CD8 + T细胞反应。在过去的几年中,试图去认为边缘区M直接作用于自适应免疫,失败了(8 - 10),在常规M中被认为只在由树突细胞初始启动后才支持T细胞作用。所以我们假设CTL(细胞毒性淋巴细胞)产生是由于Ag呈递给脾DCs。因为MMM在脾脏配制剂中呈现极低的数量,并且纯化非常困难、,我们没有成功分离它们来进行体外传递的研究。因此,我们研究了在体内DCs是否能从MMM获

10、得Ag。为此,在小鼠免疫接种mAb-OVA复合体后，从小鼠身上分离出CD11c +DCs,并通过培养它们，用OVA-特异性 CD8 + T细胞受体转基因OT-I T细胞和OVA-特异性CD4 + T细胞受体转基因OT-II细胞测试呈递OVA Ag的能力。从注射对MMM起靶向作用的Siglec-1-OVA或MARCO-OVA复合物的小鼠上分离出CD11c +DCs，用该CD11c +DCs刺激后观察到强烈的OT-I增殖,而分别从注射对MZM或红髓M起靶向作用的SIGN-R1-OVA或F4/80-OVA复合体的小鼠上分离出CD11c + DCs，刺激微弱的OT-I增生(图,2A)。 这表明对MMM

11、起靶向作用的Ag被转移到DCs用于对MHCI型的呈递。类似于我们的体内观察,通过对小鼠注射针对MMM或MZM的mAb-OVA复合体，从小鼠上纯化得到DCs，我们没有观察到MHCII型通过DCs限制OVA呈递给OT-II细胞(图，S2B)。 接下来,我们比较了从Siglec-1-OVA免疫的小鼠上分离的 CD11c + DCs和来自针对CD8 + DCs的DEC205-OVA免疫的小鼠的DCs以及来自针对CD8DCs的DCIR2-OVA免疫小鼠的DCs。 DEC205-OVA针对的CD8 + DCs以及Siglec-1针对的MMM导致了强烈的OT-I增殖(图2B)。 在从Siglec-1-OVA

12、免疫小鼠上分离出CD11c+ DCs进行共培养后我们没有发现OT-II 增殖,虽然DCIR2-OVA对CD8 DCs的靶向作用导致强烈的OT-II增殖，与先前的报道相符(图，S2B）(16)。总之,结果表明,对MMM的靶向作用后，DCs获得Ag并能激活Ag-特定性 CD8 + T细胞。 在体外Siglec-1-OVA存在下，从未处理的小鼠上纯化得到的CD11c + DCs不能刺激OT-I增殖，虽然DEC205-OVA存在下可观察到强烈增殖（图，2C)。 这表明在体外CD11c + DCs从Siglec-1-OVA着手处理、加工,并呈递OVA的抗原决定簇并暗示在体内存在通过Siglec-1-OV

13、A对CD8 + T细胞的激活，这种存在并不是由于DCs的非特异性靶向作用。 脾DCs可以分为CD8 +和CD8 亚群,CD8 +亚群专门从事交联呈递和CTL(细胞毒性T淋巴细胞)诱导。为确定在体内哪个DC亚群负责观测的CD8 + T细胞的引发,从Siglec-1-OVA免疫的小鼠分选出DC亚群，并用作天然OT-I细胞的刺激物。来自Siglec-1-OVA 免疫小鼠的只有CD8 + DCs而不是CD8DCs 在MHCI类分子环境下交联呈递OVA给OT-I T细胞(图，2D)。这些结果清晰地显示对MMM靶向作用的Ag通过CD8 +DCs导致独特的交联呈递到CTLs。 巨噬细胞的氯膦酸盐消耗通过Si

14、glec-1削弱T细胞的启动。为确定在DCs对Siglec-1-OVA复合物呈递中MMM是否是必需的,小鼠通过静脉注射Cl2MBP(氯膦酸盐)脂质体，在减少高度吞噬作用的细胞包括红髓,M,MMM,MZM,以及DCs中是非常有效的(19)。红髓M以及DCs7天内迁入脾脏，而MMM和MZM需要2个星期到一个月时间才能回复正常的数目。在给予氯膦酸盐脂质体后7天脾脏的分析表明MMM很有效的被大大的减少,而DC群呈现出正常数量(图，3A)。在这段时间点,注射Siglec-1-OVA复合体，免疫后16小时分离出CD11c+ DCs。从氯膦酸盐脂质体处理的小鼠中分离出的DCs在体外完全缺乏交联呈递OVA到O

15、T-I 细胞的能力(图.3B)。相反,通过DEC205-OVA复合物直接对CD8 + DCs靶向作用并不依赖于脾M的存在(图，3B)。因此,在体内用Siglec-1-OVA免疫接种后7天，在氯膦酸盐脂质体-处理的小鼠内OVA-特异性细胞毒性消失了,而通DEC205-OVA对CD8 + DCs靶向作用实现的CTL活力并不受影响(图，3C)。 总之,这些结果表明MMM-调解的Siglec-1-OVA摄取为后续CD8 +交联提成到CTL是必要的。 Ag从MMM转移到CD8+ DCs是百日咳毒素-敏感性的。MMM位于MZ中,而CD8 + DCs存在于白髓的T细胞区和外边缘区(12)。两个DC亚群不断地

16、被以每天近10万细胞的速度来自血液的前体细胞取代(20)。我们假设,来自血液或来自外边缘区的CD8+ DC前体细胞不断的涌入可以成为潜在的机制，通过这种机制DCs从定位巨噬细胞战略性地获得了Ag。另外,MMM能够迁移进入脾脏白髓的T细胞区。因为这两个过程将涉及趋化因子受体-调节的迁移，我们用百日咳毒素(PTx),阻碍Gi 蛋白质-偶联的受体包括趋化因子受体信号传导。用PTx治疗小鼠抑制Ag从MMM转移到DCs，而对CD8 + DCs的直接靶向作用并未受影响(图，3D)。此结果支持推测:Ag从MMM转移到CD8 + DC需要细胞迁移，虽然迁移细胞类型的特性,也就是说,MMM,CD8 + DC,或

17、其他,还有待于阐明。 MMM对通过静脉注射腺病毒疫苗激活CTLs是重要的。一种被广泛使用的为抗癌抗菌CTLs的载体是腺病毒(21,22),并且通过腺病毒载体来分析脾脏在诱导CTLs中的作用,我们用表达白蛋白(AdLOG)的重组腺病毒静脉注射或者皮下注射免疫小鼠。通过免疫小鼠注射后4小时内杀死OVA 肽-涂布的 CFSE-标记的脾细胞的能力以及OVA-特异性CD8 + T细胞的扩张(图S3 A和B)表明AdLOG免疫诱导了OVA-特异性CTLs(图4A)。相比皮下注射，静脉注射AdLOG明显的更有效地活化CTL反应(图4A)。有趣的是,在静脉注射AdLOG后完全切除脾脏终止OVA特异性CTLs诱

18、导(图4 A、B和图,S3 A和B),并禁止抗癌抗菌素反应的诱导(图S3 C和D)。在切除脾脏的小鼠中CTL诱导能够通过整个脾脏部件的自体移植得到部分修复,却不能因在单细胞悬液中注射脾细胞起作用(图4B)。经静脉注射使用GFP-表达的腺病毒,我们可以清晰地显示,在Siglec-1表达的MMM中被检测到病毒-编码的蛋白质(Fig.4C)。这些结果表明,静脉注射后脾脏是CTL活化的主要场所，体内T细胞激活需要完整的脾组织，MMM包含病毒-编码的蛋白质。 用Ag-mAb靶向作用类同于我们的实验,我们希望使用细胞衰竭来确定MMM和DCs在腺病毒性特定CTL反应中的作用。我们第一次使用CD11c白喉毒素

19、受体(CD11cDTR)转基因小鼠。对这些小鼠进行白喉毒素治疗导致CD11c+ DCs消除并且两个M亚群都存在于边际区内(23),而且在AdLOG免疫后彻底禁止了CTLs的产生(图，4D),而未处理的 CD11cDTR和白喉毒素-处理的野生型小鼠引发强烈的CTL反应(图S4)。在腺病毒的再次转移前使用氯膦酸盐脂质体7天，当M被消除时，但没有观察到CTL激活(图4D)。这个结果表明,DCs存在不足来诱导CTL反应,并且腺病毒感染后M对CTL产生至关重要。总之,这些结果表明脾M特别是MMM在摄取腺病毒-编码的Ag和针对这些Ag的CTL反应的产生中起着至关重要的作用。 对MMM的靶向作用引发出抗肿瘤

20、CTL反应。已经确认脾巨噬细胞对CTL诱导的重要性以及以病毒定位为基础推定的MMM特定角色,我们希望能研究对MMM的特定靶向作用是否能用于诱导肿瘤免疫接种。使用表达OVA的B16黑色素瘤的细胞,我们可以说明用Siglec-1 - OVA和DEC205-OVA 预防接种导致对表达OVA的B16肿瘤的产物有较强的抑制作用(图5)。这些结果表明，对MMM的靶向作用可以提供一个有效的疫苗方案用于抗肿瘤免疫反应的诱导。 讨论在本研究中,我们讲述了脾边缘区M亚群在诱导CTL反应中的功能。我们已经证明在脾MZ中的MMM专门地转移Ag到CD8 +脾DCs，导致有效的交联呈递并使CTLs活化。证明这个MMM和树

21、突细胞的合作作用于蛋白质Ag与腺病毒感染。最后,肿瘤Ag通过对MMM特定的靶向作用,我们可以诱导抗肿瘤CTL并抑制肿瘤的产物。总之,我们已经确认在脾脏固有免疫系统和适应性免疫系统特有的互动,造成有效的血源性Ags的捕获和呈递。 在周边组织迁移过来的Ag-运输的 DCs和在引流皮肤(24)或肺(25)的淋巴结中的淋巴结常驻的 CD8 + DCs之间Ag从宿主细胞转移到另一个的转移先前已被证实。淋巴引流至脾未被证实,尽管它不能排除来自周边组织的Ag-运输的 DCs可以通过血液进入脾,我们在此报告的这些观察明显地证明Ag通过巨噬细胞捕获并随后通过树突细胞呈递Ag。虽然准确的机制涉及实际细胞的转移还有

22、待阐明,但理想上脾脏的解剖结构适合来适应这个过程。一方面,MMM战略性地定位从边缘区的慢渗透的血流来捕获Ags,另一方面CD8 + DCs不断被来自血液的前体代替(20)。这个替代包括边缘区中的系连和迁移进入T细胞区,从而通过在白髓边缘的MMM环。 此外,有大量CD8 + DCs群存在于外边缘区(12)。它们的动力学了解很少,但可以设想它们也可以在局部活化时迁移到T细胞区并在过程中从MMM抓住Ags。或者,MMM本身可以迁移进入T细胞区并将Ags传递给定居性CD8 + dc。然而,尽管仔细检查,我们不能检测到抗原刺激后MMM任何的易位进入T细胞区,使得这个Ag转移路线可能性很小。 通过MMMA

23、g转移到进行交联的CD8 + DCs导致CD8 + T细胞免疫。这个过程存在类似于直接被CD8 + DCs自己摄取和吞噬,正如在CD8+DCs上直接靶向作用于DEC205的效果。为什么Ags到CD8 + T细胞的摄取与交联呈递会出现两种机制？很明显,MMM和 CD8 + DCs在摄取受体与定位的表达上不同。MMM表达病原体识别受体,如MARCO、Siglec-1(1),CD8+ DCs上不存在 。也许更重要的是,MMM策略性地定位从血液摄取Ag。他们正好位于在边缘窦沿线的内皮细胞下方并众所周知捕获存在于血液的Ag。相反,位于T细胞区或边缘区的CD8 + DCs在捕获微粒和可溶性基质上功能较差(

24、12)。这通过我们的实验说明了,在实验中我们感染了先前用氯膦酸盐脂质体处理的小鼠,其缺乏M,包括MMM,但是还含有DCs。即使这些老鼠包含功能DCs,但它们在对腺病毒感染应答中却不能激活CTLs。这一发现突显出M在边缘区对抗病原体的CTL反应的重要性。 M的主要职能之一是消除有害的病原体。在DCs中，为了支持交联呈递溶酶体的酸化和蛋白水解酶的降解被推迟,这削弱了DCs的微生物查杀能力(26)。相反,M如MMM都是装备齐全的、甚至需要血源性病原体的消除,如图所示的单核细胞增多性李斯特氏菌和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(8、9)。反而,已显示CD8 + DCs容许L.产单核细胞在脾中进入并扩散(27

25、)。消除后通过MMM对病原体的有效摄取以及Ag转移到CD8 + DCs将是非常有利的,甚至对当前的生存以及对适应免疫反应的诱导是必须的。 这里我们展示肿瘤Ag对脾MMM的特定靶向导致通过CD8+DCs的交联呈递以及抗肿瘤CTL反应的诱导。腺病毒调解的基因疗法来诱导CTL反应从而对抗肿瘤和慢性病毒性感染问题受到相当大的兴趣和已经进行了临床试验(28,29)。我们的资料表明,腺病毒载体来诱发稳定,非下滑性的 CTL反应的巨大潜力是根据它们通过MMM摄取的Ag。我们推测在MZ中MMM不断转移腺病毒Ag到CD8+DCs。通过抗体对将Ag靶向作用于MMM抗Siglec-1可以模拟腺病毒的贮主影响,但却没有腺病毒感染的危险。也因为在人类脾中在DEC205 + DCs附近被发现存在Siglec-1 + M(30)，进一步研究对MMM的靶向作用将会成为对最佳抗肿瘤疫苗策略发展的最大利益。.精品文档.在细胞毒T细胞的产生中嗜金属的巨噬细胞和 CD8 +树突细胞的有效合作