基因工程.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流1.2.3.4. 基因工程.精品文档.5. 基因工程：是按照人们的意愿，依据严密的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，有目的的改造生物物种特性，创造出更符合人们需求的新的物种。6. 基因工程的步骤：切 连 转 增 检经过酶的剪切，消化，PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段将目的基因与带有标记基因的载体相连接，形成重组DNA分子。将重组DNA分子转移到受体细胞中。筛选重组DNA的受体细胞克隆。用筛选出的受体细胞扩增目的基因，供进一步的分析使用。目的基因在新的遗传背景下实现功能的表达，产生出人类需要的物质。7. 基因工程今后发展的

2、重点：基因组学的研究 基因工程药物的研究 动植物反应器 生态环境的改善，健康水平的提高，人类生存环境从根本上改善。8. 基因工程的三个阶段：1）第一阶段；基因的染色体遗传学阶段，20世纪50以前，主要从细胞染色体水平进行研究 2）第二阶段；基因的分子生物学阶段，50年代以后。从DNA大分子水平进行研究。 3）第三阶段；反向生物学阶段，近40年代。研究基因的功能与表达的关系5.基因工程的理论基础：1）不同的基因就有相同的物质基础 2）基因视可切割的 3）基因是可转移的 4）多肽与基因之间是有对应关系的 5）遗传密码是可以通用的 6）基因可以通过复制把遗传信息转递给下一代。6.基因工程的基础研究（

3、内容）：1）基因工程克隆载体的研究 2）基因工程受体系统的研究 3）工具酶的研究 4）目的基因的研究 5）基因工程新技术的研究7.基因工程应用研究：基因工程药物无研究，转基因植物研究，转基因动物的研究，其他方面研究。8.DNA体外重组：实在分子的水平上，根据人们的需要以人工的方法，将感兴趣的目的基因在体外与载体DNA分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并筛选出表达重组的活细胞，加以纯化、扩增，称为克隆，这一工程也称为DNA体外重组技术。9.DNA体外重组种类10.连接方式：具有互补的粘性末端片段之间的连接； 具有平末端两DNA片段连接 DNA末端修饰后进行连接。11.连接（重组）类型：插入重组

4、：外源DNA片段直接插入到另一DNA分子中，正插和和反插各占1/2，重组子需筛选。 置换式重组：产生的重组DNA分子上缺失一部分序列被外源DNA片段所置换12.复制子：一个复制单位，从起始位点复制出一个DNA分子或一个DNA片段的核苷酸序列。13.启动子：是一段提供RNA聚合识别和结合的DNA序列，他一般位于表达基因的上游，长度不超过200bp. 特点：序列特异性；方向性；位置特性；种属特异性。14.复制起始位点：DNA从一点复制，这一点有一定的核苷酸序列就称为起始位点。 15.DNA来源与制备： 来源：天然DNA是指存在于生物体内的DNA，包括染色体DNA、质粒DNA。病毒（噬菌体）DNA。

5、线粒体DNA和叶绿体DNA。 制备过程：生物材料的自备（采集和保存）、细胞的裂解、DNA或RNA的提取和纯化，乙以及对制备的核酸样品机型的质量监测分析。16.PCR的原理：PCR反应是模仿细胞内发生的DNA复制过程进行的，在体外由酶催化合成特异性DNA片段，以DNA互补链聚合反应为基础，通过DNA变性、引物与模板DNA一侧的互补序列复兴杂交、耐热性DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，获得带扩增的特异性DNA片段。17PCR的过程：热变性：反应系统加热至90-95，使双链DNA变性成两条单链DNA，作为模板。 复性：温度降至37-60，使引物与模板DNA链相结合。 延伸：温度升至70-75

6、，耐热性DNA聚合酶催化引物由5-3位端延伸，合成双链DNA. 重复以上过程，就可获得特异性DNA片段18.PCR的技术特点：特异性强、敏感性高、快速、简便、队起始材料要求低、一定程度的单核苷酸错配。19.PCR的反应体系：缓冲溶液、引物、DNA聚合酶、4种dNTP、DNA模板和Mg2+20.限制酶与DNA片段化：21.限制酶：能识别双链DNA上的特殊核苷酸序列并使每条连的一个磷酸二酯键断裂的内脱氧核糖核酸酶。22.限制酶的作用：是生物细胞内限制性修饰系统的一部分，防止外来DNA入侵。23.限制酶的来源与种类：来源大部分细菌和少量霉菌； 种类：型酶，型酶，型酶。24.限制酶的命名原则：提取这类

7、酶的生物的属名的第一个字母， 种名第一，二个字母， 变种或品系的第一个字母；若酶存在于质粒上，则用大写字母表示非染色体遗传因子。 罗马数字，同种生物中提取顺序。 属名（1）+种名（1，2）+菌株（1）+罗马数字25.限制酶的作用机制：限制酶以环形和线性的双链DNA分子为地物，再合适的反应条件下，识别特定核苷酸序列，使两条核糖脸上特定位置的磷酸二酯键断裂，两裂口之间的碱基对的氢键也随之断裂，产生具有3-羟基（OH）和5-磷酸基（P）的DNA片段。26.限制酶的识别序列与切割位点： 规律：呈旋转或二重互补对称； 切割为点：一般在识别序列内部，少数在识别序列两侧。27.限制酶的反应体系：底物DNA

8、内切酶用量 反应缓冲液 内切酶的反应温度和时间28.star活性：某些限制性内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA ，这种现象叫star活性。 原因：甘油的浓度，PH值，离子浓度29.片段化方法：单酶切，双酶切，部分酶切。30.同裂酶：是一些来源不同，但是就有相同的识别序列的限制性内切酶。31.同尾酶：是一些识别序列不同，但是切割DNA分子所得的DNA片段具有相同的粘性末端的限制性核酸内切酶。32载体具备的条件：可复制，具标记，特定的多克隆位点，安全性，可转移性，并稳定存在。33.载体的划分：原核生物载体，噬菌体克隆载体，植物基因克隆载体，动物基因克隆载体。34.质粒性质：质

9、粒组成与构型，质粒DNA分子大小，质粒DNA的复制 质粒的不亲和性，质粒迁移，显性质粒与隐蔽质粒35.质粒构建原则：选用合适的出发质粒， 正确获得构建质粒载体的件， 组装合适的选择标记基因，选择合适的启动子。36.pBR322质粒载体：特点：有多个抗性标记基因，相对分子质量小，高拷贝，外源DNA插入不影响。组成：来源于psF2124质粒的转位子Tn3的AP抗性基因， 来源于PSC101的抗性基因Tc 来源于C01E1的派生质粒pMB1的复制起点。37.PUC载体性质：分子量小，但能携带较大的外源DNA片段， 拷贝数多， 酶切位点多，方便克隆， 具有-互补显色表型，便于检测。38. 噬菌体质粒性

10、质：噬菌体由DNA和外壳蛋白组成，DNA集中在头部， 噬菌体基因组有基因50个以上，功能相近的聚集成簇， DNA有多种限制酶识别位点， 噬菌体有溶菌和溶源两条生长途径。39.Cosmid载体性质：环形双链DNA分子，大小不超过36.4kb 具有质粒的特性， 含有一个cos位点， 能承载较大的外源DNA片段，具有与同源序列质粒进行重组的能力。40.单链DNA噬菌体（M13噬菌体）：是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子（“+”），长6407个核苷酸。 M13噬菌体的复制：M13噬菌体感染雄性噬菌体后，M13的“+”链DNA进入细胞内，以此为模板复制互补的“”链DNA，由此产生的双链M13D

11、NA称为复制型DNA（RF-DNA）。 M13噬菌体的增殖：RF-DNA按一般环状双链DNA进行复制，同时以”+”链DNA为信息链转移出一系列与包装相关的蛋白质。当细胞内的RF-DNA达到近200个拷贝时，RF-DNA中的“+”链DNA与单恋特异的DNA结合蛋白结合，阻断“-”链DNA的复制合成。其结果是，细胞内只能以“-”链DNA为模板不断复制合成新的“+”DNA。而新合成的“+”链DNA立即被积累在细胞内的壳蛋白包装成新的噬菌体颗粒，并且不断挤出宿主细胞。因此M13噬菌体的增殖过程不会导致宿主细胞的溶菌生长。 构建M13噬菌体载体的策略：在RF-DNA的IS区插入选择标记基因，并且在选择标

12、记基因区内组装上合适的多克隆位点连杆。41.Ti质粒：Ti质粒是一种双链环状DNA分子，一般在200-250kb之间，分四个区：T-DNA区：可转移到植物细胞的区段，约25kb，其左右边界有一长25bp的正向重复序列，对转移和整合是必须，中间部分可悲外援的DNA片段替换。Vir区：与T-DNA转移有关Con区：具有农杆菌之间结合转移的基因，Ori区：控制质粒的复制，复制其起始区42.动物克隆载体：Sv40,RSU,Ad43.定位整合载体整合平台：受体细胞基因组上给定的一个DNA区域，是外源定位整合的位置，可处于基因区，也可处于基因间隔区。44.定位整合克隆载体：除包含一般质粒克隆载体所必须的原

13、件外，必须含有一个或两个与整合平台DNA区域核苷酸序列同源的DNA片段。45.人体染色体克隆载体YAC构建：构建两臂，两臂之间插入DNA片段。46人体染色体克隆载体的种类：PYAC3，PYAC4，PYAC5。47.人体染色体克隆载体的应用: 构建基因文库：容纳大片段，减少克隆子数目， 基因治疗：不插入基因组中，自主复制，不产生细胞毒素， 基因功能的鉴定：片段大，包含编码区，内含子，调控区。48.结构基因的构成：转录启动区，核糖体识别区，编码区（包括起始密码子ATG,开放阅读框，终止密码子），转录终止区。49.基因文库概念：某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存在一个手提金的群体之中，这个

14、受体菌群体就是该种生物的基因组文库。50.几种文库质粒设计： 1）噬菌体质粒；噬菌体的处理，基因组DNA的片段化，载体与外源DNA片段的重组，基因组文库的获得和保存。 2）YAC质粒51.序列克隆：利用已知的基因或同源基因序列制备核酸探针进行杂交筛选。52.DNA插入诱变法（原理）：当一段特定的DNA序列插入到植物基因的内部或其相邻的位置是，一般会诱导该基因发生并形成突变植株，或者在插入的位置产生一个新的基因。53.应用基因定位克隆技术分离基因：基因定位克隆确定目的基因，（三个必要条件：构建含有大片段DNA的基因文库，又可用的与目的基因紧密连锁的DNA分子标记，构建生物体基因组高密度RFLP或

15、RAPD分子标记） 染色体步查法分离目的基因54.标签测序法分离目的基因： 表达序列标签（EST）：指基因序列中一段能特意的标记或表征基因的序列，通常它含有足够的结构信息以显示出该基因与其他基因的差异，长度为100-500bp。利用EST寻找新基因的一种策略就是表达序列标签法。 表达序列标签法的应用：分离基因，构建遗传学图谱，分离和鉴定新基因，基因差异表达的研究，用于制作DNA型、比较基因组学的研究。55.差示分析法（特点，原理，过程） 特点：这种技术是低丰度mRNA的鉴定成为可能，灵敏度较高，能比较两种以上特定生理状态或不同发育阶段的细胞mRNA基因表达的差异。 原理：56.PCR扩增（套式

16、，反向，不对称，反转录，长程） 套式PCR：指用两对引物扩增同一样品的方法， 反向PCR:当未知序列位于已知序列两侧时，利用两个靶序列引物对未知片段进行常规PCR扩增 不对称PCR：在PCR扩增循环中，当所用两个引物浓度不同时，称为不对称PCR。 长程PCR：一种超长DNA片段的PCR扩增方法；特点是选用强力LA TaqDNA聚合酶或EX TaqDNA聚合酶来扩增长片段DNA 。逆转录PCR:将mRNA逆转录与PCR技术相偶联的一中基因分离技术，通过mRNA逆转录得到cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR获得所需基因拷贝。常见的有连续RT-PCR和长距离RT-PCR两种类型。 AluPCR：

17、利用人类基因中高度重复序列扩增。Alu是人类基因组高度重复序列。57.构建cDNA文库：分离细胞总RNA，并从总RNA中分离纯化出mRNA 以mRNA为模板，合成cDNA第一链， 双链cDNA的合成， 将合成的双链cDNA与载体重组，导入宿主细胞增殖。58.mRNA 丰度：细胞中mRNA含量的多少、丰富的程度。59.如何抽提总RNA,并从中分离出mRNA？60.受体细胞具备的条件：便于重组DNA分子的导入，能使重组DNA分子稳定存在于细胞中，便于重组体的筛选，遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长，安全性高，无致病性，选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在包内

18、的积累，或促进外源基因的高效分泌表达，受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性，具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。61.重组DNA分子转化原核生物细胞（转化过程，转化方法，转化率的表示） 转化过程：细菌感受态的形成， 转化因子的吸收， 整合复合物前提的形成， 单链DNA转化因子的合成，转化子的形成。 转化方法： 转化率的表示：62.重组DNA分子转化植物细胞步骤：63.重组子筛选3个对照：64.重组子筛选方法：1）直接筛选法 2）待证筛选法 3）核酸分子杂交65.目的基因沉默：外源基因整合进受体植物或动物基因组后，即使没有发生突变或丢失，其表达水平也很低，甚至不表达，这种现象称为基因沉默。 三种作用机制：位置效应的基因沉默，转录水平的基因沉默，转录后水平基因的沉默。66.调控元件：67.Ecoli表达策略：优化表达载体的设计， 提高稀有密码子tRNA的表达作用 提高外源基因mRNA的稳定性 优化发酵过程。68.基因工程安全性问题：我国1993年发布了基因工程安全管理办法1996年发布了农业生物基因工程安全管理实施办法2001年发布农业转基因生物安全管理条例