家畜繁殖新技术.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流家畜繁殖新技术.精品文档.家畜繁殖新技术繁殖新技术产生的源由：动物繁殖学为动物科学的专业基础课程动物繁殖学三大组成部分繁殖生理：生殖激素 生殖生理 配种 受精 妊娠 分娩繁殖技术：人工授精 同期发情 胚胎移植 体外受精等繁殖疾病：不育 不孕 生殖障碍影响繁殖技术发展的因素繁殖学是整个畜牧学科应用技术与理论研究发展最快的一门学科，繁殖技术又是现代生物工程技术(Biotechnology)的基础。前者体现在生殖内分泌的研究进展下丘脑对生殖的调控作用，后者突出表现在核移植技术的成功六次革命人类作出了三大创举：曼哈顿计划 阿波罗登月计划 人类基因组计

2、划生物工程技术的概念：利用生物体系应用先进的生物学和工程技术加工或不加工底物原料以提供所需的各种产品或达到某种目的的一门新型的生物科学技术。生物工程技术的作用：可大大提高动物的繁殖效率 提高生长速度降低生产成本 可改变畜产品的结构 可培育人们需要的新的动物品种 可用动物代替生物反应器繁殖新技术的内容生物工程技术在家畜繁殖上的应用 基因重组利用技术 转基因 细胞融合利用技术 嵌合体 胚胎与核移植技术 核移植 组织培养利用技术 体外受精 细胞大量培养技术 胚胎干细胞 生物反应堆与酶技术 酶工程胚胎分割的生理基础：胚胎发育早期的卵裂球具全能性即发育成一完整个体的能力胚胎分割的意义在于：可使可用胚胎数

3、成倍生长、可获得遗传上几乎完全相同的后代、 可作为生物学研究模型胚胎分割的方法归纳为四种：1、Willadsen的分割法程序： 分割移入空透明带双层琼脂包埋中间受体同种受体2、Williams的分割法程序： 分割移入空透明带同种受体3、玲木分割法程序： 透明带内分割注入大分子物质溶液同种移植4、简易分割法胚胎分割的应用前景1 与胚胎移植结合可提高受胎率2 可得到同卵双生后代在牛避免孪生母犊不育3 可作为理想的试验研究材料4 为胚胎性别鉴定提供了条件胚胎分割存在的一些问题1 体重并非完全相同2 毛色和斑纹往往有差异3 生出的动物出现异常与畸形嵌合体：两个或两个以上受精卵发育的复合个体嵌合体的制作

4、：一、聚合法1、胚胎聚合法(程序)：1)采集胚胎 2)除去透明带 3)洗涤 4)配对 5)融合化学融合法(聚乙二醇法.仙台病毒法.外源凝集素法)-电融合法 6)培养 7)移植2、卵裂球聚合法(程序) (同胚胎聚合法）)将两枚或两枚以上胚胎在除去透明带后将离散的分裂球按需要取出共同放入一空透明带内PHA集合琼脂包埋移植二、囊胚注入法又称向囊胚内注入细胞法 优点：1)对着床需透明带的动物十分有利2)既可制造ICM嵌合体又可使TR成为嵌合体三、囊胚重组法嵌合体的标记标记物必需满足的条件1)固定在细胞内的物质不能跑到细胞外2)稳定存在于最初标记的细胞及因分裂而增殖的细胞3)发育期间普遍存在于机体外组织

5、4)应当容易识别5)在胚胎中应处于中性标记方法1)人工标记-活体染色素或油等珠状物放射性物质等2)遗传标记-反应生物个体或群体特征的某些性状物质体外受精：将动物的精子与卵子置于体外在人工条件下完成受精的过程称为体外受精体外受精的优点：基础研究方面 1能直接观察到受精的动态过程 2可以得到难以得到的一些动物的受精卵应用研究方面 3可以作为治疗不孕症的一种方法 4可为其它新技术的应用提供更多的胚胎来源体外受精的程序1 配子获得 输卵管卵+体内获能的精子输卵管卵+体外获能的精子卵泡卵+体内获能的精子 卵泡卵体+外获以能的精子1卵子的采取 非激素处理法 激素处理法2精子的采取 屠宰法 射出的精子2 配

6、子培养2.1 培养基 单纯培养基 复合培养基2.2 配子处理与培养系统精子处理 1)Percoll密度梯度离心法2)精子上游分离法精子孵育 诱发获能+体液（卵泡液、血清等）+ 限定培养液或合成培养液方法 1)高PH孵育法 2）钙离子载体法 3）肝素钙孵育法培养系统：开放式培养系统、封闭式培养系统和滴培养 滴培养：培人皿-培养液-卵子-冲洗-石腊油-CO2 培养箱培养（动物有特定温度表） 卵子成熟的标志 卵丘细胞的成熟判别： 1）卵丘细胞的分散程度 2）卵丘细胞内空泡变大 3）卵丘细胞异染色质增多、核孔明显、核空泡化 卵母细胞核的成熟判别： 4）核迁移至动物极质膜下成为生发泡（Germinal

7、Vesicle,GV) 卵母细胞质的成熟判别： 5）胞内皮质颗粒由匀散状态向质膜下迁移 6）高尔基复合体由核周围移向皮质迁移-消失 7）线粒体由核周围皮质区核周围 8）早期粗面内质网（RER）丰富成熟时RER减少授精(分配卵子到精子悬浮液中)过程看到的现象：1、在透明带表面可以看到很多精子2、多精子受精频率增加3、精子超活化现象受精的标准1)少数动物卵母细胞内可见到精子2)卵母细胞质中有膨胀的精子头部3)卵周隙内存在第二极体或明确的第一极体4)卵子激活排出第二极体5)雌雄原核形成并融合6)卵周隙变大有时见到精子4 影响受精的因素：温度 精子数 培养的条件牛体外受精操作程序：1配制配子洗涤液、培

8、养液、受精液 2采集处理配子 3授精体外受精液中有关成分的作用 1犊牛血清和血白蛋白乳酸丙酮酸 2咖啡因和肝素 3FSH和PMSG精子注射：把精子直接注射到透明带下卵周隙中或注意到卵细胞质中有人将前者称为精子转移或精子植入，后者称为精子注射精子注射处理与要求：注入细胞质的精子可以是不活动的精子或精核注入卵周隙的精子应为活动的已获能的和已发生顶体反应的精子才能获得较高的受精率 为避免精子在注射针内移动必需限制精子活动： 一是将精子加入含有甲基纤维素的粘稠培养液中 二是将精子冷却到10oC 三是为便于精子注射可设法加大卵周隙： 生精细胞显微受精 生精细胞显微受精是利用变态前的球形精子细胞（次级精母

9、细胞或初级精母细胞）与不同发育时期的卵母细胞进行受精它包括透明带下授精和卵母细胞质内受精3.1意义与作用： 揭示雌雄配子间的相互作用和受精本质 保护和挽救濒危珍稀动物品种 利用初情期以前幼年动物繁殖后代 治疗老龄与先天性异常引起的雄性动物不育症 若用精细胞进行转基因所得的后代一定是全部携带目的基因的个体将分离到体外的精细胞移植到睾丸中没有精细胞的小鼠曲精细管内可获得移植精细胞发育的后代 3.2方法 电融合法 卵胞质内注射法 3.3 技术研究与应用 细胞周期与卵激活差异 正常受精 卵子停滞于第二次减数分裂中精子已完成减数分裂显微受精显微受精成功的动物与存在问题成功的动物：小鼠 刘灵等 仑鼠 兔

10、存在的问题：2/3的雄原核较小但不影响胚胎进一步发育ICSI与IFV比较 25%受精卵不能同步形成雌雄原核7%受精卵可能形成3个原核体外受精胚胎在体外的发育往往不能与子宫完全同期化，在囊胚移植时需要做辅助脱出透明带处理，而且体外受精的结果不同。核移植1、概念：借助显微操作和细胞融合技术把遗传型不同的胚胎细胞核和卵细胞质相结合重组成新的合子的过程 得到的胚胎称为重组胚(reconstituted embryos)或核移植胚2目的：1）查明胚胎细胞核和体细胞核是否保持合子细胞核的全部遗传信息 2）体细胞核是否能代替合子核所起的作用 3）转移供体核基因生产多个同基因动物 4）作为动物和人类疾病模型

11、5）作为生产药物的天然工厂 现代生物学中克隆技术又称为“生物放大技术”它经历三个发展阶段： 1）微生物克隆 2）生物技术克隆 3）动物克隆 克隆技术发展的过程 哺乳动物核移植的起始人Mcgranth和Solter 第一个报道成功的是Illmensee和Hope二 核移植必须具备的条件1 显微操作设备2 制作吸管装置 3 体外培养系统三 核移植的方法1 核供/受体细胞来源与当前需要解决的问题核供体：胚胎细胞：目前主要是用桑椹期前的卵裂球成体细胞：胎儿的成纤维细胞乳腺上皮细胞 输卵管细胞 卵丘细胞 孤雌生殖细胞 成体细胞从增殖的角度可分为三类：1）连续分裂细胞 2）休眠细胞 3）分化细胞核受体：处

12、于中期的卵母细胞调节细胞周期的方法其一采用人工捕获的方法，即通过限制细胞培养基中某些成份，从而使大部分细胞滞留在细胞周期的某一阶段；其二通过选择细胞类型来获得当前需要解决的问题： 远缘细胞核移植 受体细胞选择关于核供体和核受体细胞质的协调性 重构胚的卵裂速度与供核体细胞的发育速度一致 与生殖系统关系越密切的细胞重构胚发育潜力越大 核质重构后代性状主要与供体相似或为核质混合状态 性别控制方法 X和Y精子的分离 X和Y精子的分离方法 A沉降法 B密度梯度离心法： C 电泳法 D 流式细胞分选法性别鉴定 1 非损害性方法 1）测定与X染色体相关联的酶的活性 2）免疫法(HY抗原法或单克隆抗体法) 方

13、法：免疫动物选择（高度近交系） 制备抗血清 HY抗原检测A 细胞毒性分析法B 免疫荧光分析法 C 囊胚形成抑制法； 2损害性方法 1）细胞遗传学分析（又称核型鉴定）特点 准确率100%获得高质量的中期染色体分裂相难 取样 滋养层细胞 卵裂球 分割半胚 2）分子生物学分析法(DNA探针（原位杂交技术 FISH）) 方法 以待检测的核酸序列为模板 用TAQ 酶催化引物限制DNA合成经变性 退火 延伸三个步骤可使扩增片断以2N的指数积累即在2小时内使待检测的核酸扩展数百万倍 特点 特异好 灵敏度高 简便快速 难点 分离Y染色体序列 分离SRY序列 确定序列位置及拷贝数转基因是将特定的外源基因导入动物

14、受精卵或胚胎使之稳定整合于动物的染色体组并能遗传给后代的技术。能检测出导入新DNA的动物就称为转基因动物 。通过使用实验手段将外源基因导入动物的生殖细胞并由此发育成个体且整合外源基因又能向后代遗传的动物称为转基因动物。携带外源基因并能表达遗传的动物称为转基因动物 而外源基因可能只整合入动物部分组织、细胞的基因组，称为嵌合体动物。转基因的意义 经典育种方法的限制性遗传信息只能在同种或亲缘关系很近的种间才有可能交换重组选择的条件是变异或突变自然变异的比例不足1%可在没有亲缘关系的种间进行遗传信息交换和重组可在很短时间产生服从于人们需要的突变 具体表现在：可作为生命现象解密的工具 1) 转基因动物疾

15、病模型可用来进行疾病发病学和治疗性研究； 2）可以提高家畜的经济性状 3）可从遗传上改变畜产品的组成结构 4）以家畜为宿主生产有用的生理活性物质转基因技术的优点：可以培育出生产性状优良的超级动物群 可以制备出高增殖的蛋白和激素类药物 可以按人的需求提供动物产品 二 家畜转基因的方法 原生质体融合法 重组病毒感染法 微细胞介导法 高速冷冻法 细胞融合法 显微注射法 精子载体法 胚胎细胞介导法 逆转录病毒法等 乳腺暂态表达家畜转基因的方法1 显微注射法（microinjection) 在显微镜下借助玻璃微吸管将外源基因注射进细胞的一种方法。这种方法是建立得最早也是最有效的方法其最大的优点是基因转移

16、率高不需原核载体DNA片段导入外源基因长度可达100kb 2 精子载体法既往精子作载体所采用的方法为体外孵育法，如今有采用体内转染法：这其中可将外源基因直接导入精细管，可直接导入附睾管 。3 胚胎干细胞介导法 这种方法的优点：囊胚腔易于注射整合率高（50%） 可在体外对靶细胞进行基因的定位插入整合 可对目的基因型干细胞进行克隆 难点：EK/ES细胞株的建立4 原始生殖细胞介导法 原始生殖细胞（Prmordial Germ Cell,PGCs)介导法与ES法技术原理和方法相似。5 逆转录病毒感染法（Retrovirusts)方式： 1） 48细胞胚胎先去除透明带与反转录病毒共培养病毒感染胚细胞病

17、毒的RNA被逆转录成病毒DNA这样DNA就可能被整合到胚胎细胞中去体外培养1624小时移入受体。2）将浓缩的病毒或产生病毒的细胞注射到48细胞的透明带下同上。优点：无需显微操作感染率高宿主范围广可以同时处理大量胚胎外源基因为单拷贝整合可直接进行囊胚腔注射。缺点： 1）得到的大部分是嵌合体外源基因遗传给后的很少 2）每一基因都要构建一个重组逆转录病毒载体 3）这种载体容量小通常为7kb大于9.4kb就不稳定6、非病毒载体介导法脂质体介导法：脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。 基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细

18、胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。 受体介导法7 体细胞核移植法（转基因克隆）将外源基因导入到体细胞中，再将该细胞进行培养，选择其中带有外源基因的细胞进行扩增，用这种细胞的细胞核进行核移植（把体细胞核植入一个去了核的卵母细胞中，融合并激活），将重组胚进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管。8 乳腺暂态表达乳腺基因导入的方法有两种：乳头管导入法乳腺直接导入法不同转基因方法技术效果比较1 显微注射法优点： 外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过程直观；整合率高；缺点： 设备昂贵、环节较多对操作人员有较高的技术要求低效率（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚

19、胎存活率低基因整合随机性 转基因沉默2 胚胎干细胞介导法优点： 外源基因整合情况的可控性高可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便缺点： ES细胞系建立及培养困难；维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易；所得个体为嵌合体；3 逆转录病毒感染法优点： 受精卵携带外源基因的阳性率高； 外源基因多单拷贝整合；操作简单，避免注射法对卵子的损害； 宿主范围广；可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高；缺点： 容纳大小有限； 潜在致癌性,载体复杂；整合率不高,胚胎自我保护机制对其有抗性；与微注射相比，对插入序列的容量有限，总长

20、大于9.4Kb，就不稳定或很难成活,通常为7Kb。通过这种方法引入的DNA的表达取决于内部的启动子。4 体细胞核移植法优点：转基因效率显著超过显微注射可以方便的建立生产畜群可以预测基因表达水平可以使用定点整合目标基因的技术5 YAC法利用酵母人工染色体()作为载体制作转基因动物的方法。酵母人工染色体（）载体是近年来发展起来的新型载体, 能克隆百万对碱基的大片段。优点：保证大片段的完整性保证较长外源片段在转基因动物研究中的整合率高保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性,因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。因此介导法制备转基因动物具有广阔的应用前景。 转基因的整合和表达 外源基因的整合的机制目

21、前尚不清楚,整合效率与DNA的浓度,结构形式,以及卵母细胞来源都有一定关系外源基因在转基因动物体内的表达主要有三种方式： A、细胞内特异表达，大多为这种方式，表达量与内源基因相似； B、外源基因在所有器官显著表达，改变了动物表型和原来形状； C、外源基因在动物发育的适当时期与内源基因一起激活。大部分转基因在宿主基因组中的表达比较低的,之前对这种现象的解释是转基因受位置效应的影响。现在认为之所以不表达是由于多拷贝重复序列导致了该区域异染色质化,从而使转基因沉默。培养转基因家畜的技术问题第一 是技术本身的问题：理论基础积累不足和技术不完全，结果随机整合，且整合率低；家畜的外源基因的整合率低于实验动

22、物。一般是高度近交系品种整合具有稳定性 。表达率不高,产生的转基因动物效率低。不了解基因表达的发育控制和组织特异性控制。第二是家畜本身的问题：排卵数的差异，卵细胞透明度差，采集原核期胚胎的准确时间难以把握，妊娠期长产仔数少费时耗资大。六 基因敲除和基因嵌入技术基因敲除简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除基因嵌入(gene knock in)又称基因置换，它是利用内源基因序列两侧或外面的断裂点，用同源序列的目的基因整个置换内源基因。 干细胞：是具有自我复制和多项分化潜能的原始细胞 胚胎干细胞简称ES/EK细胞，是一种从早期胚胎ICM或原始生殖细胞（Primodial Garm Cells

23、 PGCs）图，经体外分化抑制培养分离和克隆得到的具全能性的细胞（图6-3）。 2 干细胞的类型（表6-1）成体干细胞 胚胎干细胞 (全能性 多能性多向分化 / 跨系分化 单向)一 研究进展 1958年Stevens最早发现畸胎瘤细胞(Embryonic carcinoma cell EC)，他通过把小鼠早期胚胎移植到129只小鼠精巢或肾脏的被膜下得到EC细胞。这些细胞可在体外进行培养，被用作研究动物胚胎发育与遗传，以及细胞诱导分化的实验模型与正常胚胎的未分化细胞极为相似胚奖体。 注入囊胚可形成嵌合体（但常会形成肿瘤或导致胚胎死亡） 有胚胎细胞发育的多能性 在体外能不断增殖并保持不分化的状态

24、多数EC细胞不具正常的二倍体核型,染色体数也不完整 ES细胞的特征：全能性和相当于44.5日龄的胚胎细胞；具胚胎细胞特征核型，为正常二倍体；具外分化能力，皮下接种可产生畸胎瘤。目前研究的侧重点在于： 1)ES细胞系的建立条件 2)影响因素的探讨 3)细胞核型的稳定性及变异 4)ES细胞系的利用途径 用PGCS 建立干细胞系虽然由于其迁移特性导致贴壁率较低但来源比较丰富一存在问题：不同细胞系和同一细胞系不同亚系之间细胞的多能性和注射到胚胎腔后参与生殖系典型嵌合的能力不同分离到的ES细胞在以后的培养中由于实验室的条件不同或培养条件中某些不良因子作用和积累以及倍增水平的增加ES细胞的染色体也会出现不

25、稳定。胞质对后代的影响还有待研究 克隆胚的培养冷冻及重复克隆仍有待改进和提高 体细胞克隆其技术还待完善和提高成功率大型动物克隆还有亟待解决的问题 二 建立ES细胞系的方法与步骤 1建立ES细胞系的条件使ES细胞成千上万倍的克隆而不分化 STO （小鼠成纤维细胞无限系）成纤维细胞PMEF（原始成纤维细胞） 前者国外已商品化饲养层细胞具上述作用的原因： 这两面类细胞可释放出成纤维细胞生长和分化抑制因子，如白血病抑制因子 2 饲养层细胞的制备 用STO或胎儿成纤维细胞试验表明后者优于前者方法：1）取适龄的胎儿去头 内脏及血管剪粹蛋白酶消化取细胞液置DMEM中培养细胞贴壁生长后胰蛋白酶消化分离细胞培养

26、 2）生长抑制处理 一是辐照 二是加丝裂霉素 3 ES细胞的分离：ES细胞取自附植前的胚胎措施：一要选择适当胚龄的胚胎 二要采用正确的分化抑制物方式一是免疫外科手术法消化透明带、滋养层细胞以暴露内细胞团 二是直接机械剥离法将胚胎培养至孵出囊胚阶段然后用机械方法直接捡出内细胞团细胞 前一种方法，分离率高，所得细胞的数量多，但复杂繁琐；后一种方法简单易行，但滋养层细胞不易去除干净。如何确定内细胞团细胞的全能性：目前多采用AKP和SSEA1进行检测 三是 热休克法 四是 延缓着床法4 ES细胞的培养 ES细胞在经处理的饲养层细胞上培养液是DMEM其中还要添加血清、巯基乙醇、四种核苷酸及少量必须氨基酸

27、抗菌素等 值得注意的是：1）培养时及时定期更换培养液 2）细胞系生成后要及时转移消化、克隆传代或冷冻保存 5 ES细胞系的验证明体外 细胞形态特征体积 大小一致细胞核大胞质胞浆少细胞排列紧密边缘整齐完整 核型上可见核和核仁与完整的染色体数和整倍体核型在没有饲养层的情况下 体外悬浮培养能分化成多种组织体内 将ES细胞注射至皮下 产生畸胎瘤或与正常胚胎嵌合构成嵌合体三 应用前景 1 探讨早期胚胎发育的条件 2 研究早期胚胎组织分化的发生与诱导3 用ES细胞与正常胚胎细胞嵌合在体外重建胚胎三种方法 核移植法 细胞聚合法 囊胚注射法 重组前可根据目的和试验设计需要对ES细胞进行处理得到特殊用途的动物

28、4 ES细胞体外定位整合外源DNA对于研究有关早期胚胎发育与表达中基因的活动及其功能有十分重要的意义： 利用ES细胞体外定位整合外源DNA 通过对特定基因的灭活或修复得到转化的ES细胞 可以在体外培养中观察其细胞生理及生化性质变化 引入动物种系后可间接了解基因的功能与作用机理 可通过动物模型对人类的某些遗传疾病进行模拟定位，整合的原理是DNA的同源重组其程序：构建同源序列（靶序列）引入ES细胞产生同源重组（即外源DNA取代与其同源的染色体DNA片断而进入受体基因组） 引入的方法： 病毒感染法 显微注射法 电穿孔导入法基因打靶：1）选定要改造的基因 2）克隆该基因的全部或部分DNA序列（靶序列）

29、 3）克隆靶序列的载体（靶载体）插入或目的基因 靶序列从靶载体上切下来 筛选整合外源DNA的ES细胞构建嵌合体 关于ES细胞的研究在人类疾病的治疗具有重要的潜在价值干细胞又一个重要的潜在用途是生产细胞和组织，它们可用于所谓的“细胞疗法”。许多疾病及功能失调往往是由于细胞功能障碍或组织破坏所致。虽然这项研究有着极为诱人的前景，但要使其成为现实，尚有许多工作和技术挑战等着我们去解决。 首先我们必须做些基础研究，以理解导致人体中细胞特化的细胞事件，从而能够指导这些多能干细胞发育成移植所需的特殊组织类型。 其次，在利用这些细胞进行移植之前，还必须克服免疫排斥问题。由于来自胚胎或胎儿组织的人体多能干细胞

30、与移植受者在遗传上有差异，因此将来的研究将集中于改变人体多能干细胞，将组织不相容性降到最低，或是创建具有通用组织类型的组织库。 ES细胞的分离培养原则上应满足两个条件： 1 促进ICM细胞增殖 1） 培养基 DMEM 适用于生长速度快贴壁性差的细胞Evans和Kaufman 2） 添加剂的运用 非必需氨基酸 柠檬酸 核苷酸 硒酸钠 丙酮酸钠等（作为蛋白质合成原料或提供能量物质） 3） 血清 供给营养 促进合成（血清质量影响组织培养） 4） 生长因子对胚胎保持最佳生长速度有一定作用 胰岛素样生长因子 胰岛素表皮生长因子 转铁蛋白成纤维细胞生长因子抑制ES细胞分化的因素：1) 胚龄的选择 用于分离

31、ES细胞的胚胎，胎龄越小，分化程度越低，越具有全能性. 目前，各种动物一般采用囊胚期的胚胎来分离ES细胞。2）饲养层选择 胚胎成纤维细胞用来制作饲养层后，能够抑制ES细胞的分化，其原理一般认为是饲养层能够分泌白血病抑制因子和aFGF、bFGF。目前采用的饲养层细胞有3种：STO（已建系的小鼠胚胎成纤维细胞即小鼠成纤维细胞无限系） MEF（小鼠胚胎原始成纤维细胞）HEF（同源胚胎成纤维细胞）3）条件培养基和几种分化抑制因子的应用 应用CM的优点：消除饲养层干扰得到纯化的ES细胞 使ES细胞免受丝裂霉素C致癌剂的影响 手术简单可以进一步分析ES细胞分化的启动和关闭机制分化抑制因子BRL4）滋胚层细

32、胞的影响 滋胚层细胞能够分泌滋胚层蛋白1和干扰素有诱导细胞分化的作用 滋胚层的存在其扩增速度极高要消耗培养基中的营养物其代谢产物蓄积较快 去除滋养层细胞的方法： 胚胎培养法 免疫外科法 显微手术法动物转基因研究历程中的三大里程碑1980 Gordon等报道用DNA显微注射法获得转基因小鼠1982 Palmiter等用微注射方法得到比正常鼠大一倍的“超级鼠”1985 Hammar等获得转基因兔、绵羊和猪辅助生殖技术是指配子、胚胎或者基因物质体内外系统操作而获得新生命的技术。辅助生殖新的技术主要体现在超数排卵、体外受精阴道培养法、经子宫肌层胚胎移植技术、经腹腔精子与卵子移植技术、配子输卵管内移植技

33、术、合子输卵管内移植技术、配子宫腔内移植技术、卵子和胚胎捐赠、代孕母亲、胚胎冻融技术、显微人工授精技术、着床前遗传学诊断技术、囊胚培养技术、细胞核移植技术、人类胚胎干细胞等。1952年Robert Briggs和Thomas J.king把一个青蛙的体细胞核移植到一个去核的卵母细胞中，发育成了蝌蚪，其中许多蝌蚪发育成了未成年青蛙。19611962年，John B.Gurdon和Robert G.McKinnell用相同克隆方法成功地得到了成年青蛙，这些青蛙能正常繁殖。1966年John B.Gurdon和V.Uehpinger通过移植蝌蚪小肠细胞核克隆出了成年青蛙。1970年代，John B.Gurdon等人移植成年青蛙的体细胞核得到了蝌蚪，但这些蝌蚪没有长到可以进食阶段就死了。1980年代，Robert G.McKinnell通过移植成年青蛙红细胞核（与人类不同，青蛙红细胞有核），获得了能够进食的蝌蚪，但是这些蝌蚪没有发育成青蛙。所有这些实验表明，动物已分化的体细胞似乎不可能再完全逆转。因此，科学家们把对胚胎克隆的注意力转向了细胞逆分化潜能上。1996年多莉羊的诞生，表明已分化的体细胞完全具有逆向分化的潜能，其细胞核完全具有合子细胞核的功能。