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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流微生物育种论文模板.精品文档.附件浙江大学宁波理工学院微生物育种学课程论文题目普那霉素生物合成机理及基因工程研究进展姓名金庆超学号*分院生物与化学工程分院专业班级*任课教师金庆超 完成日期2008年6月9日摘要普那霉素(Pristinamycin)由始旋链霉菌 (Streptomyces pristinaespiralis)产生，包含普那霉素I (PI) 和普那霉素II (PII) 两类化合物，主要用于治疗由包括耐药菌在内的革兰氏阳性菌引起的感染。目前，缺乏稳定遗传的高产菌株是制约普那霉素发酵生产和临床应用的主要原因之一，其中利用基因工程的方

2、法筛选高产菌株成为重要的研究热点，本文就此方面进行了简要介绍。关键词：始旋链霉菌；普那霉素；高产；分子机理；分子育种1. 前言普那霉素（pristinamycins）属链阳性菌素类（streptogramin）抗生素, 由始旋链霉菌（Streptomyces pristinaespiralis）产生，具有抑制生物蛋白合成的杀菌活性(1)。该类抗生素主要由普那霉素I (PI)和普那霉素II (PII)等两类化合物组成，其含量分别为30和70。普那霉素I为环六肽内酯（branched cyclic hexadepsipeptides），由普那霉素IA(含量约90-95%)、普那霉素IB(约5%)和

3、普那霉素IC(约1%)组成；普那霉素II为多不饱和环内酯(polyunsaturated macrolactones) ，由普那霉素IIA(约80%)和普那霉素IIB(约20%)组成。普那霉素IA和普那霉素IIA是普那霉素的主要组分(1;2)。2. 普那霉素的生物合成基因2.1 普那霉素I的生物合成基因普那霉素IA的分子骨架是由1个3-羟基吡啶羧酸(3-hydroxypicolinic acid chromophore)残基和L-苏氨酸(L-threonine)、D-氨基丁酸(L-aminobutyric acid)、L-脯氨酸(L-proline)、4-二甲基氨基-L-苯丙氨酸(4-dime

4、thylamino-L-phenylalanine，L-DMPAPA)、4-酮-L-六氢吡啶羧酸(4-ketone-pipecolic acid)和L-苯甘氨酸(L-phenylglycine)等6个氨基酸残基聚合而成的环状结构。PIA大环的第5位的L-DMPAPA残基被4-甲基氨基-L-苯丙氨酸(4-methylamino-L-phenylalanine，L-MMPAPA)残基替换就形成PIB, 而PIB的第3位D-氨基丁酸残基被D-丙胺酸（D-alanine）残基替换后又形成PIC分子。一般而言，PI的生物合成大体上可以分成三个过程：前体的形成，环六肽内酯的合成和大环的修饰，期间需要大量基

5、因参与。目前仅克隆到了组成PI大环的第5位L-DMPAPA残基的生物合成相关基因（图1）。该生物合成途径以分支酸(chorismic acid)为起始底物，在由基因papA、papB、papC和papM编码的谷酰胺氨基转移酶(glutamine aminotransferase)、4-氨基-L-苯丙氨酸(4-amino-L-phenylalanine synthase)、变位酶(mutase)、脱氢酶(dehydrogenase)和甲基化酶(methylase)等酶的参与下完成，其产物L-MMPAPA和L-DMPAPA作为前体物质分别参与PIB和PIA大环的合成(3)。PI环六肽内酯的生物合成

6、主要在肽合成酶（peptide synthetase）的催化作用下聚合成肽链(4)。目前已分离出催化PI大环合成的PI合成酶1、2和3的编码基因snbA、snbC和snbDE（图2）。这三种酶依次激活PI大环的1(3-羟基吡啶羧酸)、23 (L-苏氨酸和D-氨基丁酸)和47位点氨基酸(L-脯氨酸、4-二甲基氨基-L-苯丙氨酸、4-酮-L-六氢吡啶羧酸和L-苯甘氨酸)，合成PIA的前体分子PIE大环(5;6)。基因snbF的产物催化第6位L-六氢吡啶羧酸残基的羟化反应修饰PIE大环形成最终的PIA（图3）(6)。基因snbC和snbDE还能激活D-丙胺酸和L-MMPAPA分别连接到PI大环的第三

7、位和第五位，进而形成组分PIC和PIB (5;6)。2.2 普那霉素II的生物合成基因普那霉素IIA由7个乙酸单位、4种氨基酸残基（缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸）、来自丝氨酸的噁唑环和来自甲硫氨酸的甲基等组成。迄今为止，尚不明确与PII前体的生物合成相关的功能基因。已鉴定出一个与PIIB环生物合成的相关基因snaD，该基因编码的非核糖体肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase）可以激活丝氨酸残基并掺入到PIIB环中(7)。研究进一步发现，PIIB的脯氨酸残基发生氧化反应可转化成PIIA。目前已克隆到参与这一生物学过程的三个基因snaA、snaB和snaC（图4

8、）。SnaA和snaB基因编码PIIA合成酶（pristinamycin IIA synthase）的两个亚基，snaC基因编码黄素单核苷酸还原酶（FMN reductase），FMN还原酶提供PIIA合成酶催化反应所需的FMNH2(8;9)。3. 普那霉素的抗性基因抗生素产生菌通常含有多个抗性基因，抗性基因是激活生物合成基因转录的必需成分。在抗生素产生菌体内，抗性基因首先进行转录, 只有当抗性已建立后, 生物合成基因的转录才能进行，生物合成基因与抗性基因相互调节。同其它抗生素产生菌一样，S. pristinaespiralis在产生普那霉素时，ptr抗性基因已活跃表达。ptr是一个多功能抗性

9、基因，它编码一种跨膜转运蛋白，可能通过将抗生素运出细胞的方式来保护菌体免受PI、PII和利福平（rifampicin）等三种不同结构抗生素的危害(10;11)。一般来说，抗生素合成基因、抗性基因和调控基因伴随在一起表达。研究表明，当链霉菌的菌丝生长速率骤然下降时，抗性基因ptr可启动转录，此时普那霉素也大量产生(11)。Salah-Bey等还筛选鉴定出一个调控ptr基因表达的基因pip，当PI存在时，pip结合在ptr基因的启动子区域激活其表达，反之则抑制其表达，该基因在多种链霉菌中广泛存在(12)。Blanc等从S. pristinaespiralis中筛选出第二个普那霉素抗性基因snbR，

10、它与ptr基因有70同源性，仅对普那霉素表现抗性 (7)。加强对这个基因的研究将有助于了解在S. pristinaespiralis中存在的不同的抗普那霉素的分子机理。4. 普那霉素生物合成的调控基因抗生素生物合成过程需要很多调控基因的作用。目前对普那霉素生物合成进行调控的分子机理还不清楚，仅筛选出两个功能相关基因papR1和spbR。基因papR1的编码产物可正调控普那霉素的生物合成，该基因缺失使PI和PII的产量下降了30(13)。基因spbR的编码产物是papR1基因的正调控因子，该基因与papR1基因的启动子结合后可调控普那霉素的生物合成，该基因的缺失除导致普那霉素产量大幅度下降外，还

11、严重影响菌体的生长和形态分化(13)。图1. 普那霉素I的DMPAPA前体的生物合成途径(3)图2. 普那霉素IA、IB和IC组分的结构及PI合成酶的催化位点(6)图3. 普那霉素IA大环的合成(6)图4. 普那霉素IIA大环的合成(9)5. 普那霉素的生物合成和抗性基因簇一般来说，抗生素生物合成基因成簇排列, 但并不形成一个操纵子, 而是组成几个不同的转录单位, 基因表达的调控主要发生在转录过程中。目前已从S. pristinaespiralis中克隆和鉴定出11个PI或PII的生物合成基因和2个抗性基因，这些基因成簇存在，在染色体上分布于四个不重复的区域(14)：（1）A区只含ptr抗性基

12、因；（2）B区约40 kb，包括PII生物合成基因snaA、snaB、snaD和PI生物合成基因snbC和snbDE等5个基因；（3）C区只含PII生物合成基因snaC；（4）D区包含PI生物合成基因snbA、papA、papB、papC、papM和普那霉素抗性基因snbR等6个基因。由于没有发表的S. pristinaespiralis基因组序列，Bamas-Jacques等利用脉冲场电泳(pulsed-field gel electrophoresis)和DNA分子杂交技术分析了S. pristinaespiralis的染色体特征和上述普那霉素生物合成及抗性基因的遗传组织状态(14)。结果

13、表明，S. pristinaespiralis的染色体是线性的，核酸大小约7580 kb。存在于染色体上四个不同区域的普那霉素生物合成及抗性基因被分成两个基因簇，主要呈现出两个特征：1. 位于B、C、D区的所有普那霉素生物合成基因及抗性基因snbR属于同一基因簇，该基因簇区约200 kb，占染色体的2.6%（图5）。在这个基因簇中，PI和PII生物合成基因并不是分别成簇存在，而是分散在整个基因簇，可能与两类普那霉素的生物合成间的相互协调以及链霉菌进化上的协同抗性有关(15)，详细机理还有待进一步研究。2. ptr抗性基因并不与普那霉素生物合成基因紧密排列，而是单独位于一个基因簇中。由于基因pt

14、r是一个多抗性基因，它独立存在于普那霉素生物合成基因簇外可能与对利福平等抗生素的抗性有关。除此之外，大量的有关普那霉素生物合成基因簇的重要信息仍需研究探讨，如这两类不同的普那霉素组分生物合成基因形成几个转录单位，怎样进行表达；调控基因papR1及其正调控子spbR基因是否也与普那霉素生物合成基因紧密相连，它们怎样调控生物合成基因的转录等。图5. 普那霉素生物合成基因簇的遗传组织(14)6. 普那霉素生物合成的基因工程6.1 优化普那霉素组分的合成对于普那霉素II，发酵工业的主要目标产物是PIIA。自然合成的PII型抗生素含有约20的PIIB，PIIB可在基因snaA,B编码的PIIA合成酶的催

15、化下转化成PIIA。Sezonov等（1997）利用生物技术的手段来提高胞内PIIA合成酶的活性，他们采用一个来自产二素链霉菌（S. ambofaciens）的整合型质粒pSAM2，将一个拷贝的snaA,B基因转化到S. pristinaespiralis的PI PIIA PIIB型突变体中，该基因在一个强劲的ermE启动子下得到充分表达，可将PIIB完全转化为PIIA，得到100PIIA发酵产物。因此，采用增强基因表达的手段可以优化PIIA的合成。Blanc等利用基因敲除技术去掉了编码PIIA合成酶亚基的snaA基因，检测结果表明S. pristinaespiralis突变体只有PIIB的积

16、累，没有PIIA的产生，而PI组分的产生在突变体和野生型中没有明显变化(8)。这为抗生素合成过程中基因工程手段的应用与化学合成技术的结合提供了新的思路，利用基因工程技术提供纯化的PIIB前体，再利用化学合成技术进一步合成PIIA。利用基因敲除技术也为优化PI组分的合成提供了新策略。如Blanc等在S. pristinaespiralis的PI PII型突变体中敲除了控制PI前体L-MMPAPA和L-DMPAPA生物合成的关键酶的编码基因papA，突变体不能形成任何的PI组分，将突变体作为发酵菌种，当向发酵液中分别添加外源的L-MMPAPA和L-DMPAPA后，在发酵产物中分别得到单一的PIB和

17、PIA组分(3)。综上所述，基因工程手段用于生产菌种的改造，结合化学合成技术或发酵条件的改变可以很好地改进普那霉素的合成。6.2 改造普那霉素的代谢途径合成新型抗生素自然产生的普那霉素难溶于水，很难直接用于临床。利用化学合成手段对普那霉素的结构进行修饰，形成水溶性的新型普那霉素，可以直接应用于临床(16)。然而，新型抗生素的结构复杂性对化学合成提出了严重挑战。近年来，在化学合成过程中结合基因工程手段增强了新型抗生素的有效合成。Mahlert等克隆、表达了普那霉素I大环的生物合成基因snbDE te，其产物是PI合成酶的具硫酯酶（thioesterase）活性的结构域，该结构域可以催化多种肽硫酯

18、键的聚合使线性PI分子闭合形成大环。他们进而以获得的PI大环分子作为前体，运用化学合成的方法合成了多种类型的普那霉素衍生物(17)。若直接用普通的化学合成方法，由于底物分子立体结构的专化性而限制了各类硫酯键的形成，因此难以提供丰富的线性PI分子用来合成新型普那霉素。7. 总结及展望普那霉素作为一种非常有潜力的抗生素，可越来越广泛地应用于临床。加强对普那霉素代谢途径的研究可有效地寻找提高产量和优化组分的方法。目前，对普那霉素I和II的生物合成途径还不完全清楚，大量的功能相关基因还有待挖掘。近十多年来，以利用DNA重组技术对生物细胞内固有代谢途径进行改造设计为主要研究内容的第三代基因工程，即途径工

19、程，为普那霉素的代谢工程研究提供了强有力的手段。尽管已有研究者在优化普那霉素组分和合成新型普那霉素方面取得了一些成绩(17;18)，但离普那霉素的临床需求和市场化生产还相当遥远。因此，对普那霉素的途径工程还应该从以下方面加强研究(19;20)：第一，通过增加代谢途径中关键基因的拷贝数、强化基因表达系统、提高正调控基因的表达、抑制负调控基因的转录和阻断相竞争的代谢途径等手段来提高普那霉素的产量。第二，利用基因水平的操作或蛋白水平的改造等手段使链霉菌的代谢途径拓展对底物的专一性，从而达到获得新型普那霉素的目的。第三，根据已知普那霉素生物合成途径相关基因以及各步反应的分子机制，构建含新代谢旁路的高效

20、、经济价值较大的生产菌株。总之，随着代谢工程研究的深入，普那霉素在抗生素中的地位和对人类健康的贡献将日趋提高。参考文献1. Cocito C 1979 Antibiotics of the virginiamycin family, inhibitors which contain synergistic components. Microbiol Rev 43:145-1922. Cocito C, Chinali G 1985 Molecular mechanism of action of virginiamycin-like antibiotics (synergimycins) on

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