微生物工程复习复习资料.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流微生物工程复习复习资料.精品文档.A知道 B理解 C看看传统发酵：最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或是指酒的生产过程。生化和生理学意义的发酵：指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式。在无氧等外源氢受体的条件下，底物脱氢后所产生的还原力H未经呼吸链传递而直接交某一内源性中间代谢物接受，以实现底物水平磷酸化产能的一类生物氧化反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。工业上发酵 发酵：利用微生物在有或无氧条件下的生命活动来生产微生物菌体或代谢产物的过程。微生物工程涵义 微生物工程是渗透有

2、工程学的微生物学。利用微生物的特定性状、功能，通过现代化工程技术，生产各种生理活性物质的技术体系是在酵母发酵生产饮料酒的基础上发展起来的，又称为发酵工程是将传统发酵技术与基因工程、细胞工程、代谢工程和计算机自动控制等新技术结合并发展起来的现代发酵技术微生物工程的发展阶段 1天然发酵阶段 2纯培养技术的建立：巴斯德，科赫等。人为地控制微生物的发酵进程。3 通气搅拌发酵技术的建立 4代谢控制发酵技术5开拓发酵原料时期 6基因工程阶段 定向地改变生物性状发酵的流程 见笔记第二章国外菌种保藏中心 美国典型微生物菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所(NCTC)日本大阪发酵研究所（IFO）法国

3、巴斯德研究所（IPL）国内菌种保藏中心 1普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC) 中科院微生物所，北京：真菌、细菌 中科院武汉病毒所，武汉： 病毒 2农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC) 农科院土壤肥料所，北京 3工业微生物菌种保藏管理中心(CICC) 中国食品发酵工业科学研究所，北京菌种筛选主要步骤和掌握一种菌的分离方法 见笔记诱变育种：利用诱变剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过合适的筛选办法获得所需的高产优质菌种的方法物理诱变剂：射线如紫外线、X射线、射线，快中子等化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂C诱变剂的选择1碱基

4、类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。2亚硝酸和烷化剂应用较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。3吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。4紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的功能。诱变育种步骤1出发菌株的选择 2处理菌悬液的制备 3诱变处理 4中间培养 5分离和筛选出发菌株的选择 4出发菌株开始时可以同时选23株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。中间培养 由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的

5、过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。少一个营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素或碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。筛选营养缺陷型的步骤 1诱变 2淘汰野生型 3检出缺陷型 4确定生长谱少一个营养缺陷型应用工程菌的稳定性问题 工程菌在发酵生产和保存过程中表现出不稳定性，具体表现为：质粒的丢失；重组质粒发生DNA片断脱落；表达产物不稳定。在生产上常常表现为有质粒的工程菌生长状况不如无质粒的宿主细胞，使发酵受到影响，产量降低。措施 组建合适载体，引入一段特殊DNA片断或基因使宿主细

6、胞分裂时，质粒能较稳定的遗传到子代细胞中；选择适当宿主，相对而言重组质粒在大肠杆菌中的稳定性大于枯草杆菌和酵母；施加选择压力，即利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能生长，常用方法有抗生素添加法、营养缺陷型法等；控制外源基因过量表达，外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定；控制培养条件，这是工业化生产关键步骤；将质粒上不需要的DNA部分除去原生质体：在人为的条件下，除去细胞壁或抑制新生细胞壁的合成，得到的仅有一层细胞膜包裹的圆球状的渗透敏感的细胞。A原生质体融合育种的特点：1杂交频率较高 2受接合型或致育型的限制较小 3遗传物质传递更为完整4存在着两株以上亲株同时参与融合形

7、成融合子的可能性。5提高菌株产量的潜力较大。A原生质体融合育种步骤 1标记菌株的筛选和稳定性验证。2原生质体制备。3等量原生质体加聚乙二醇促进融合。4涂布于再生培养基，再生出菌落。5选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。6生产性能筛选。原生质体的制备 原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。影响原生质体制备的因素3酶浓度 对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，就是对酶的浓度也有差异。另外

8、，最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。营养缺陷型的应用 1. 氨基酸发酵生产 3. Ames试验 利用一组鼠伤寒沙门菌的组氨酸营养缺陷型菌株，能否发生回复突变，来检测被检物是否具致突变性。 第三章斜面培养基:对于放线菌或霉菌产孢子培养基，氮源碳源不宜太丰富，否则易长菌丝而较少形成孢子。种子培养基特点：1. 必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子2. 种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。供孢子发芽生长用的种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源。3. 种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。前体物质：是指某些化合物添加到发酵培养基中，能直接被微生物在生

9、物合成过程中结合到产物中去，而其自身的结构没有多大的变化，但产物量提高。(在发酵中添加前体物质将有利于产物的合成和显著提高产量，如苯乙酸及其衍生物被认为是青霉素的前体物质)用法：前体使用时普遍采用流加的方。前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利。苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%。前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前体的转化率。金属离子的影响：有些种类的发酵生产对金属离子相当敏感，因为有些金属离子是中间代谢酶抑制剂或激活剂。对于有重大影响的金属离子必须严格控制。如柠檬酸发酵中铁、锰和锌离子都能明显影响产量，钙离子对细菌淀粉酶的生产有促进作用，而钴离子对葡萄

10、糖异构酶的发酵是必需的，这些在培养基配制时都必须予以注意。碳源 葡萄糖：是最易利用的糖，并且作为加速微生物生长的一种有效的糖。过多的葡萄糖会过分加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要。油和脂肪：在微生物分泌的脂肪酶作用下水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，氧化成水和CO2。因此用脂肪作碳源时需比糖代谢供给更多的氧。淀粉：一般要经菌体产生的胞外酶水解成单糖后再被吸收利用。可克服葡萄代谢过快的弊病。来源丰富，价格比较低廉。常用的为玉米淀粉、小麦淀粉和甘薯淀粉。无机氮源：铵盐、硝酸盐、氨水等。微生物对其吸收利用比有机物快，所以也称速效氮。利用无机氮时应注意引起的pH变化。实验室中常用蛋白

11、胨、牛肉膏、酵母膏等作为有机氮源，工业生产上常用硫酸铵、尿素、氨水、豆饼粉、花生饼粉、麸皮等原料作氮源。根据经济效益选择培基原料：碳源的代用方向主要是寻找植物淀粉、纤维水解物，以废糖蜜代替淀粉、糊精和葡萄糖，以工业葡萄糖代替食用葡萄糖。同时，使用稀薄的培养基，适当减少碳氮配比。 有机氮源代替主要为减少或代替黄豆饼粉、花生饼粉、食用蛋白胨和酵母粉等含有丰富蛋白质的原料。代用的原料可以是棉籽饼粉、玉米浆、蚕蛹粉、杂鱼粉或麸汁、饲料酵母、石油酵母、骨胶、酒糟，及各种食品工业下脚料等。pH的具体控制方法：1. 可在培养过程中加入酸或碱或流加某些营养物质调节培养基的pH，但更应在配制培养基时考虑所用营养

12、物质的组成成分，使pH值适合该微生物生长或合成代谢产物的需要。2. 还要注意有些营养物质被利用后培养基的pH变化情况.3. 控制pH最常用的方法是在培养基中添加具有一定缓冲能力的物质作为营养物，如以磷酸盐作为磷的成分；或者避免使用容易产生生理酸性或碱性使培养基pH波动太大的物质。发酵生产中如何解决溶解氧不足? 通气可以供给大量的氧。搅拌能使新鲜氧气更好地与培养液混合，保证氧的最大限度溶解.。若培养罐深，搅拌转速大，通气管开孔小或多，气泡在培养液内停留时间就长，氧的溶解速度就大。利用透明颤菌血红蛋白（VHb）基因工程菌解决溶解氧不足固体培养特点：原料:以谷物和农业废物为主要原料，只需外加适量水分

13、、无机盐等。培养基组成简单。防止污染:利用霉菌能在水分较低的基质表面进行增殖的特性，在这种条件下，细菌生长不好，因此不易引起细菌污染。通气:无论浅盘或深层固体通风制曲，可以在曲房周围使用循环的冷却增湿的无菌空气来控制温湿度，并能根据菌种在不同生理时期的需要，灵活加以调节。固体培养中，氧气是由基质粒子间空隙的空气直接供给微生物，比液体培养时的用通气搅拌供给氧气节能。液体深层培养：用液体深层发酵罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，称为深层培养法。B控制点:灭菌：发酵工业要求纯培养，因此在发酵开始前必须对培养基进行加热灭菌。所以发酵罐具有

14、蒸汽夹套，以便将培养基和发酵罐进行加热灭菌，或者将培养基由连续加热灭菌器灭菌，并连续地输送于发酵罐内。温度控制：培养基灭菌后，冷却至培养温度进行发酵，由于随着微生物的增殖和发酵会发热、搅拌产热等，所以为维持温度恒定，须在夹套中以冷却水循环流过。通气、搅拌：空气进入发酵罐前先经空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进人，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。为了延长气泡滞留时间，可在罐内装挡板产生涡流。搅拌目的除了溶解氧之外，可使培养液中微生物均匀地分散在发酵罐内，促进热传递，以及为调节pH而使加入的酸和碱分散等。C两步法:酶制剂生产两步法的特点是将菌体生长条件(营养期)与产酶条件区分开来。菌

15、种先在丰富的培养基上大量繁殖，然后收集菌体浓缩物，洗涤后再转入添加诱导物的产酶培养基，在此期间，菌体积累大量的酶，一般不再繁殖，营养成分或诱导物得到充分利用。在氨基酸的两步法液体深层培养中，每一步菌种和培养基等均不相同。第一步属有机酸发酵或氨基酸发酵。第二步是在微生物产生的某种酶作用下把第一步的产物转化为所需的氨基酸，这种生产方法又称为酶转化法。连续培养法:在往发酵罐中连续供给新鲜培养基的同时，将含有微生物和产物的培养液，从发酵罐中连续放出，叫做连续培养法。泡沫的危害：培养过程中产生的泡沫与微生物的生长和合成酶有关，泡沫的持久存在影响着微生物对氧的吸收；妨碍二氧化碳的排除，因而破坏其生理代谢的

16、正常进行，不利于发酵；由于泡沫大量生成，致使培养液的容量一般只能等于种子罐容量的一半左右，大大影响了设备的利用率，甚至发生跑料，导致染菌，造成巨大损失。消泡措施:1机械法：消沫桨、引出法、超声波2改进培养基成分3育种4化学法：天然油脂、聚醚类、高级醇、硅酮类、脂肪酸、亚硫酸等。少量多次加效果好。加增效剂后，促进消沫剂扩散，延长作用。染菌的控制：1必须加强接种室的消毒管理工作，定期检查消毒效果，严格无菌操作技术。2如果新菌种不纯，则需反复分离。已出现杂菌菌落或噬菌斑的试管斜面菌种，应予废弃3对于菌种扩大培养的工艺条件要严格控制，对种子质量更要严格掌握。反馈抑制：一条代谢途径的终产物，有时可与该代

17、谢途径的第一步反应的酶相结合，结合的结果使这个酶活性下降，从而使整条代谢途径的反应速度慢起来。凡能促进酶生物合成的现象，称为诱导。能阻碍酶生物合成的现象，则称为阻遏。分解代谢物阻遏：当细胞内同时存在两种可利用底物(碳源或氮源)时，利用快的底物会阻遏与利用慢的底物有关的酶合成。现在知道，这种阻遏并不是由于快速利用底物直接作用的结果，而是由这种底物分解过程中产生的中间代谢物引起的，所以称为分解代谢物阻遏。葡萄糖效应：碳分解产物的阻遏作用。当大肠杆菌培养于含有葡萄糖和乳糖的培养基中，菌体出现两次生长旺盛期，这是菌首先利用葡萄糖进行生长繁殖，在葡萄糖耗尽后，过一段时间菌体才开始利用乳糖。在上述培养基中

18、即使加入乳糖酶诱导物，葡萄糖没耗尽，利用乳糖的酶系也不能合成。代谢调控在发酵工业中的应用 （一）应用营养缺陷型菌株以解除正常的反馈调节。为了解除正常的代谢调节以获得赖氨酸的高产菌株，工业上选育了谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸缺陷型来生产赖氨酸。其不能合成高丝氨酸脱氢酶，故不能产生高丝氨酸。通过补加高丝氨酸（或苏氨酸、甲硫氨酸），即可产生大量赖氨酸。（二）应用抗反馈调节的突变株解除反馈调节 抗反馈调节突变菌株，就是指一种对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性的菌株，或兼而有之的菌株。在这类菌株中，因其反馈抑制或阻遏已解除，或是反馈抑制和阻遏已同时解除，所以能分泌大量的末端代谢产物。（三）控制细胞膜的渗透性。微生

19、物的细胞膜对于细胞内外物质的运输具有高度选择性。细胞内的代谢产物常常以很高的浓度累积着，并自然地通过反馈阻遏限制了它们的进一步合成。采取生理学或遗传学方法，可以改变细胞膜的透性，使细胞内的代谢产物迅速渗漏到细胞外。这种解除末端产物反馈抑制作用的菌株，可以提高发酵产物的产量。第五章生长得率：是指每消耗1g(或mo1)基质(一般指碳源)所产生的菌体重(g)。产物得率：是指每消耗1g(或mo1)基质所合成的产物g数(或mol数)。这里消耗的基质是指被微生物实际利用掉的基质数量，即投入的基质量减去残留的基质量。发酵周期：指接种开始至培养结束放罐这段时间。在工业生产上计算劳动生产率时则还应把发酵罐的清洗

20、、投料、灭菌、冷却等辅助时间也计算在内。即从第一罐接种经发酵结束至第二次接种为止这段时间为一个发酵周期，这样才能正确反映发酵设备的利用效率。延滞期长短的因素：接种材料的生理状态，如果接种物正处于指数生长期，则延滞期可能根本就不出现。培养基的组成和培养条件也影响延滞期长短。接种物的浓度对延滞期长短也有一定影响，加大接种浓度可相应缩短延滞期。第六章空罐灭菌也称空消。无论是种子罐、发酵罐、还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基（或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，为空罐灭菌。实罐灭菌：将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达到预定灭菌温度后，维持一定时间，再冷却到发酵温度，然后接种发酵，这叫做实罐灭菌，又

21、称分批灭菌。 三路进汽：蒸汽直接从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。这就是所谓的“三路进汽”。连续加压灭菌法优点：采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又可最大限度减少营养成分破坏，提高了原料利用率，比“实罐灭菌”（120，30分钟）提高产量510；提高了发酵罐子、锅炉的利用率；降低了劳动强度；适宜自动化操作。采用高温灭菌的原理及优点：杀死微生物芽孢的活化能大于维生素分解的活化能，灭菌中总体上希望尽可能的杀灭微生物，同时少破坏营养成分。灭菌温度上升，灭菌速度常数增加速度大于培养基成分破坏增加的速度，因此，灭菌温度上升，则杀死微生物速度增加大于培养基成分破坏速

22、度的增加。因而生产中多采用高温或超高温灭菌，其在杀灭微生物的同时可减少培养基营养成分的破坏。发酵对无菌空气的要求是 ：无菌、无灰尘、无杂质、无水、无油等。在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过。空气净化的流程：1吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤。2进入空气压缩机（120-150）。3冷却（20-25），除去油、水，再加热至30-35。4最后通过总过滤器和分过滤器除菌，获得洁净度、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。深层过滤原理：这些改变引起微粒以对滤层纤维产生惯性冲击滞留、阻拦滞留、重力沉降、布朗扩散、静电吸附等作用而把微粒滞留在纤维表面上。空气过滤除菌介质：棉花玻璃纤

23、维活性.超细玻璃纤维纸.石棉滤板.烧结材料过滤介质新型过滤介质影响介质过滤效率的因素：介质过滤效率与介质纤维直径关系很大，介质纤维直径越小，过滤效率越高。对于相同介质，过滤效率与介质滤层厚度、介质填充密度和空气流量有关。棉花活性炭过滤器：棉花是最常用的过滤介质，通常用纤维不太长的原棉，其具有一定的弹性，经湿热灭菌、干燥后仍能保持原有疏松状态。过滤阻力较活性炭大（1012倍）。活性炭常被加工成粒状，其过滤效率比棉花低，但具有阻力小，吸附力强（可吸附空气中有害物质，如油、水）的特点，通常与棉花介质一起使用，减少过滤层的阻力。第七章C发酵相关设备：1种子制备设备2主发酵设备3辅助设备(无菌空气和培养

24、基的制备)4发酵液预处理设备5粗产品的提取设备6产品精制与干燥设备7流出物回收、利用和处理设备酒精发酵罐:为圆柱形，底盖和顶盖均为碟形或锥形。多为密闭式。罐顶装有人孔、视镜及二氧化碳回收管、进料管、接种管、压力表和测量仪表接口管等。罐底装有排料口和排污口。罐身上下部装有取样口和温度计接口，对于大型发酵罐，为了便于维修和清洗，往往在近罐底也装有人孔。发酵的冷却装置:对于大型发酵罐，罐内装有冷却蛇管或罐内蛇管和罐外壁喷洒联合冷却装置三种。锥形罐特点：一般置于室外。发酵最旺盛时，使用全部冷却夹套，维持适宜的发酵温度。冷媒多采用乙二醇或酒精溶液，也可使用氨(直接蒸发)作冷媒；罐身和罐盖上均装有人孔，罐

25、顶装有压力表、安全阀和玻璃视镜。罐身装有取样管和温度计接管。设备外部包扎良好的保温层。优点：（1）能耗低，管径小，生产费用低。（2）最终沉积在锥底的酵母，可打开锥底阀门，把酵母排出罐外，部分酵母留作下次待用。朝日罐特点（1）利用离心机回收酵母（2）利用薄板换热器控制发酵温度（3）利用循环泵把发酵液抽出又送回去。优点：使用酵母离心机分离发酵液的酵母，可以解决酵母沉淀慢的缺点，减少了排除酵母时发酵液的损失。三种设备互相组合，解决了前、后发酵温度控制和酵母浓度的控制问题。利用凝聚性弱的酵母进行发酵，增加酵母与发酵液接触时间，促进发酵液中乙醛和双乙酰的还原，减少其含量。C发酵罐的基本条件:（1）发酵罐

26、应具有适宜的径高比。（2）发酵罐能承受一定的压力。（3）要保证发酵液必须的溶解氧。（4）发酵罐应具有足够的冷却面积。（5）发酵罐内应减少死角，避免染菌。（6）搅拌器的轴封应严密，减少泄漏。发酵罐罐体的尺寸比例：H/D=1.74，d/D=1/2-1/3，W/D=1/8-1/12，B/D=08-1.0，H-高，D-直径，d-搅拌器直径。W-挡板宽度，B-下搅拌桨距底部高度A发酵罐的结构 1 罐体：由圆柱体及椭圆形或碟形封头焊接而成，材料为碳钢或不锈钢，对于大型发酵罐可用衬不锈钢板或复合不锈钢制成，衬里用的不锈钢板厚为2-3毫米。可在一定压力下操作、空消或实消。2搅拌器有平叶式、弯叶式、箭叶式三种。

27、其作用是打碎气泡，使氧溶解于醪液中，从搅拌程度来说，以平叶涡轮最为激烈，功率消耗也最大，弯叶次之，箭叶最小。3挡板的作用是改变液流的方向，由径向流改为轴向流，促使液体激烈翻动，增加溶解氧。通常挡板宽度取（1/8-1/12）D，装设4-6块即可满足全挡板条件。所谓“全挡板条件”是指在一定转速下再增加罐内附件而轴功率仍保持不变。4罐内轴承不能加润滑油，应采用液体润滑的塑料轴瓦（如石棉酚醛塑料，聚四氟乙烯等）。轴瓦与轴之间的间隙常取轴径的0.4-0.7%，以适应温度差的变化。5空气分布装置的作用是吹入无菌空气，并使空气均匀分布。管口对正罐底中央，装于最低一挡搅拌器下面，管口与罐底的距离约40 mm。

28、空气由分布管喷出上升时，被搅拌器打碎成小气泡，并与醪液充分混合。6轴封的作用：使罐顶或罐底与轴之间的缝隙加以密封，防止泄露和污染杂菌。常用的轴封有端面轴封和填料函轴封两种。7冷却装置 5 M3以下发酵罐一般采用夹套冷却。大型发酵罐采用列管冷却（四至八组）。夹套内设置螺旋片导板，来增加换热效果，同时对罐身起加强作用。冷却列管极易腐蚀或磨损穿孔。8消泡器C气升式发酵罐 工作原理：将空气上升管装在罐外，下端与罐底连通，管底装空气喷嘴，压缩空气高速喷出（250300m/s），与上升管内醪液接触，由于气液混合体密度小于罐内醪液，所以在管内上升，管上端与罐身切线相连，液体由切线进入在罐内回旋下降，形成循环

29、。第八章原料液特点：1原料液中目标产物的浓度一般都很低，如 L-异亮氨酸浓度为2.4，青霉素为3.6，庆大霉素为0.2，胰岛素仅为0.001。2原料液中成分复杂，常存在与目标分子结构极其相似的分子及异构体。3当生物技术产品是食品或药物时，溶剂的使用受到一定的限制，萃取、色谱等手段会受到一定的限制。发酵液成分一般不稳定。发酵液放罐后，应及时快速操作，原因在于：1.菌体可能自溶2.容易被杂菌污染3.引起产物的破坏和降解。原料液中常存在降解目标产物的杂质，如可水解目标蛋白质蛋白酶。因此要求采用快速的分离纯化方法除去影响目标产物稳定性的杂质。下游技术：1预处理 2细胞分离 3细胞破壁 4碎片分离 5提

30、取 6精制 7成品制作见笔记发酵液预处理1、降低黏度：加水稀释：简单，增体积、降低产物浓度。加热升温：柠檬酸发酵，90，蛋白质变性凝固，利于过滤2、凝聚、絮凝改变粒子分散状态，形成大颗粒，利过滤3、调整PH4、加入反应剂 环丝氨酸发酵液，氯化钙、磷酸盐生成沉淀。凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁盐类）作用下，使胶体体系不稳定并使粒子相互聚集成 mm 大小块状凝聚体的过程。絮凝：指使用高分子絮凝剂将胶体粒子交联成网，形成10 mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。常用絮凝剂：聚丙烯酰胺类：用量少，絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快，适用范围广。无机高分子聚合物，聚合铝盐和聚合铁盐等。天然

31、有机高分子絮凝剂，如壳聚糖和葡聚糖等聚糖类，还有明胶、骨胶、海藻酸钠等。微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，由微生物产生的具有絮凝细胞功能的物质。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。高价无机离子的去除：Ca2+ 草酸 Mg2+ 三聚磷酸钠 Fe3+ 黄血盐 （普鲁士蓝）蛋白质去除：加热 调pH (草酸，无机酸或碱)细胞破碎方法：1. 酶消化法 细胞悬浮液中加入酶能迅速和细胞壁反应并破坏它们。酶选择性的与细胞壁反应，不破坏细胞内的其它物质。反应条件温和。此法的缺点在于酶的消耗限制了在大规模

32、生产中的使用。2. 机械法1）匀浆法2）研磨法 3）超声波法：利用频率高、波长短的超声波进行细胞破碎，效率更高4）高压均质法膜分离存在的问题在操作中膜面会发生污染，使膜性能降低；膜的耐压性、耐热性、耐溶剂是有限的，故应用范围受限制；仅采用膜分离技术分离效果有限，往往需要与其他分离工艺组合起来使用。按膜孔径大小分类1微滤膜0.0210 m 2超滤膜0.0010.02 m （120 nm）3反渗透膜0.00010.001 m （0.11 nm）4纳米过滤膜平均直径2 nm膜污染的处理与再生1用物理方法清洗2化学清洗方法起溶解作用的物质：酸、碱、酶（蛋白酶）、螯合剂、表面活性剂、分散剂。起切断离子结

33、合作用的方法：改变离子强度、pH、电位。起氧化作用的物质：过氧化氢、次氯酸盐。起渗透作用的物质除内毒素：内毒素是细菌新陈代谢和细菌死后分解的产物，主要成分是脂多糖、脂蛋白等，相对分子质量较大。在静脉注射药液时，如果将其带进血液，会对人体造成相当大的危害。传统的针剂用水除内毒素的方法是过滤加活性炭吸附，此法并不可靠。在医药工业上用超滤法制造无菌水。带溶剂是指能和产物形成复合物，促使产物更易溶于有机溶剂相中，在一定条件下又要容易分解的物质。第九章抗生素是微生物或其他生物生命活动过程中合成的次生代谢产物或其人工衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或干扰它种生物的生命活动。根据抗生素的化学结构分类：-内酰

34、胺类：青霉素类(penicillins)头孢菌素类(cephalosporins ) 氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素 大环内酯类：红霉素、麦迪霉素四环类 ：四环素、土霉素 多肽类 ：多粘菌素青霉素母核：6-氨基青霉烷酸(6-APA) 头孢菌素母核：7-氨基头孢烷酸（7-ACA）青霉素菌株改良：Fleming点青霉, 适用固体发酵2 U/ml。1943,美国甜瓜分离的产黄青霉利于液体发酵120 U/ml诱变Wisconsis菌株Wis Q176 900 U/mlWis.B13-D10无色素。诱变，提高产量，目前已超过80,000U/ml。青霉素发酵总体流程：1菌种 (strain)：产黄青霉菌 (

35、Penicillium chrysogenum)2孢子培养 (spore cultivation)：25 C, 6-7 d 3种子培养 (seed cultivation)：25 C，2-3 d 4发酵培养 (fermentation)：22-26 C, 6-7 d 5加糖控制 (sugar feeding)：残糖降至0.66补氮 (nitrogen feeding)：氨控制在 0.01-0.05,补硫酸铵、氨水或尿素。 7前体 (precursor)：残余苯乙酰胺 0.05-0.08 8温度控制 (temperature)：前期 25-26 C (菌丝生长)后期 23 C(分泌青霉素) 9通

36、气与搅拌 (aeration & stir)：1 : 0.8 VVM 10泡沫 (foam)：天然油脂, 如豆油 11控制铁离子浓度，小于30 g/ml 12分离：过滤醋酸丁酯萃取、脱色过滤结晶天然抗生素的改造：1抗耐药菌、降低毒性、提高疗效2青霉素的改造：3过敏、不易口服、耐药4保留母核(6-APA)对R基团改造苄青霉素为原料，以青霉素酰化酶进行裂解后制取6-APA 。将6-APA 与化学合成侧链进行酶法催化，得到半合成青霉素。B氧对氨基酸发酵的影响及其控制：1要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵：生物合成与TCA循环有关。2适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸发酵：菌体呼吸受阻时产量

37、最大。3供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸族氨基酸发酵B谷氨酸产生菌特点：1革兰氏阳性2不形成芽孢3没有鞭毛，不能运动4需要生物素作为生长因子5在通气条件下才能产生谷氨酸。谷氨酸生物合成机理：由三羧酸循环中产生的a-酮戊二酸，在谷氨酸脱氢酶和氢供体存在下进行还原性氨化作用而得到。淀粉水解糖的制备：酸水解或酶水解。1、调浆：干淀粉用水调成10-11波美度的淀粉乳，加盐酸0.5-0.8至pH1.5。 2、糖化：蒸汽加热，加压糖化25min。冷却至80下中和。3、 中和：烧碱中和，至pH4.0-5.0。 4、脱色：活性炭或脱色树脂脱色。活性炭用量为0.6-0.8 ，在70 及酸性条件下搅拌后过滤。酶

38、法糖化：以大米或碎米为原料时采用。大米进行浸泡磨浆，再调成15波美度，调pH6.0，加细菌a-淀粉酶进行液化，85 30min，加糖化酶60 糖化24h，过滤后可供配制培养基。糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源，因含丰富的生物素。预处理方法：活性碳或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素。也可以在发酵液中加入表面活性剂吐温60或添加青霉素。谷氨酸发酵控制：（1）生物素：作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合在，进而影响磷酯的合成。当磷酯含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，

39、不产或少产谷氨酸，产物中乳酸和琥珀酸明显增多。（2）种龄和种量的控制：接种量为1。过多，菌体娇嫩，不强壮，提前衰老自溶，后期产酸量不高。（3）pH。谷氨酸脱氢酶最适pH为7.0-7.2，转氨酶最适pH 7.2-7.4。发酵中后期保持pH不变，过高转为谷氨酰胺，过低氨离子不足。（4）通风：在发酵产酸阶段，需要大量通风供氧，以防过量生成乳酸和琥珀酸。第十章微生物脱氮基本原理：生物脱氮主要通过硝化作用和反硝化作用来完成。分别为好氧段和缺氧段。硝化作用段：硝化作用是指NH3被氧化成NO2，再被氧化成NO3的过程。反应： NH3 NO2 NO3。微生物：亚硝化细菌和硝化细菌，两者为化能自养菌，专性好氧，

40、要求中性、弱碱性环境，最适温度25 30 ，pH值范围7.58.0。硝化作用阶段包含脱碳、硝化两个反应脱碳氧化去除COD脱碳菌好氧有机物呼吸的细菌，以有机物为碳源硝化菌好氧氨盐呼吸的细菌，以碳酸盐为碳源（NH4+NO2-NO3-)硝化菌的碳源是脱碳菌的代谢产物；有机碳源丰富时，脱碳菌世代周期短生长迅速 ，硝化菌氧利用不足，生长缓慢；反硝化作用段反硝化作用是指兼性厌氧的硝酸盐还原菌将硝酸盐还原为N2的过程。反应：H NO3 H NO2 N2O N2微生物：假单胞菌属的微生物在厌氧条件下利用NO3 氧化有机质，获得能量，碳源来自有机物，最终电子受体为NO3、 NO2，要求中性、弱碱性环境，最适温度

41、10 35 ，pH值范围7.08.0，细菌：反硝化细菌（兼性厌氧菌）碳源：原水中BOD硝酸盐来源：回流出水中的硝化产物生物除磷:就是利用聚磷菌一类微生物，能够过量的从外部摄取磷，并将磷以聚合形式贮藏在菌体内，形成高磷污泥，排出系统外，达到从废水中除磷的效果。原理：积磷菌是一类生长缓慢的细菌，在厌氧条件下，分解体内的聚磷来获得能量生长繁殖，在好氧条件和外界营养基质少的情况下，分解体内的PHB获得能量而生长繁殖，故它与不积磷菌相比更能适应厌氧、好氧交替的环境而成为优势菌群。好氧时：大量繁殖（消耗好氧状态能源聚-羟丁酸（PHB）， 逆浓度梯度过量吸磷（贮备厌氧状态能源多聚磷酸盐颗粒(即异染颗粒) ）

42、；厌氧时：正相反不繁殖，释放磷酸盐于体外（产生能量供其储备消耗好氧状态能源PHB）。可用于生产酒精的原料有哪些？(1)薯类原料 甘薯、木薯和马铃薯等。(2)谷物原料 玉米、高梁、大米和小麦等。(3)糖类原料 废糖蜜、甘蔗、甜菜等。(4)野生植物原料 椽子仁、土茯苓、楝树果等。(5)纤维原料 森林工业和木材加工工业的下脚料、农作物秸秆、甘蔗渣、废纤维垃圾和废纸浆等。(6)其他原料 亚硫酸纸浆废液、淀粉渣等。 纤维素、糖蜜、淀粉生产酒精大体流程1. 纤维素生产酒精工艺2糖蜜生产酒精工艺3.淀粉质原料酒精生产工艺1）.原料粉碎2.）蒸煮糊化3.）曲霉糖化：经蒸煮糊化后的醪液，通过曲霉菌的淀粉酶进行糖

43、化作用生成可发酵性糖，供酵母菌利用。4.）酵母发酵5.）蒸馏提纯：发酵液内，除含有酒精和大量水分外，还含许多杂质。蒸馏是把发酵醪液中含有的酒精提纯出来，通过粗馏和精馏，最后取得合乎规格的酒精，同时得到副产物杂醇油、酒糟等。酒精生产对酒母的要求(1)含有较强的酒化酶，发酵能力强，而且迅速；(2)繁殖速度快；(3)耐酒精、耐温、耐酸、抗杂菌能力强(4)生产性能稳定，变异性小；(5)发酵时产生泡沫少。 可利用酵母、霉菌、细菌生产酒精，各记住1-2个菌种1常用菌种为真酵母属中啤酒酵母及其变种，如拉斯2号、拉斯12号、K字及从我国筛选的南阳五号(1300)、南阳混合(1308)等。 2用于酒精发酵(纤维

44、素原料)的霉菌有：粗糙脉孢霉、拟青霉、链孢霉等。假丝酵母可直接发酵木糖生产酒精。3利用厌氧发酵单胞菌、棕搁发酵菌等细菌生产酒精。酒精发酵一般分几个时期，各时期分别进行了什么主要生化反应1. 前发酵期：加入酒母与糖化醪后，酵母细胞数还不多，醪液中含有少量的溶解氧和营养物质，酵母能进行繁殖。醪液中的糊精继续被糖化酶作用，生成糖分，温度较低，糖化作用较缓慢。从外观看，由于醪液中酵母数不多，发酵作用不强，酒精和CO2产生得很少，所以发酵醪的表面显得比较平静，糖分消耗也比较馒。前发酵延续时间一般为l0小时左右。由于前发酵期间酵母数量不多，发酵作用不强，所以温度上升不快。在接种时温度为26-28.前发酵期

45、温度一般不超过30。防止杂菌污染。 2主发酵期：酵母大量生成，细胞数可达1亿毫升以上。 发酵醪中的氧气已消耗完毕酵母菌基本停止繁殖而主要进行酒精发酵。 醪液中糖分迅速下降，酒精逐渐增多。因为发酵作用的增强，醪液中产生了大量的CO2。随着CO2的逸出，可以产生很强的CO2泡沫响声。 温度上升很快。生产上应加强控制。根据酵母菌的性能，主发酵温度最好能控制在30-34主发酵时间一般为12小时左右。 3后发酵期： 糖分大部分被酵母菌消耗掉，残存部分糊精继续反应生成葡萄糖。这一作用进行的极为缓馒，生成的糖分很少，所以发酵作用也十分缓慢。因此，这一阶段发酵醪中酒精和CO2产生得也少。后发酵阶段，因为发酵作

46、用减弱，所以产生的热量也减少，发酵醪的温度逐渐下降。此时醪液温度应控制在30-32左右。淀粉质原料生产酒精的后发酵阶段一般约需40小时左右才能完成。 各章教学结构及具体要求第一章 绪论1. 微生物工程的应用2. 微生物工程组成及研究内容3. 发酵工业4. 发酵方法的类别与流程5. 微生物工程的发展简史及我国发酵工业的科技进步第二章 生产中常用菌种的分离、选育和保藏1. 菌种的分离简介2. 培养分离3. 工业菌种的育种方针4. 诱变育种5. 营养缺陷型的选育6. 基因育种7. 原生质体育种8. 筛选新的代谢产物第三章 发酵工艺条件的确定1. 培养基的选择和确定2. 培养工艺的确定方法3. 厌氧培

47、养第四章 微生物的代谢机制1. 微生物的能量代谢2. 分解代谢和合成代谢间的联系3. 微生物的代谢调控与发酵生产第五章 发酵动力学模式和发酵培养方法1. 微生物反应过程概论2. 发酵动力学分类3. 微生物生长动力学第六章 发酵工程基本操作1. 严格消毒灭菌2. 空气除菌第七章 发酵设备1. 发酵设备概述2. 嫌气发酵设备3. 通风发酵罐4. 固体发酵设备第八章 微生物工程下游技术1. 发酵液预处理2. 微生物工程下游技术第九章 微生物工程生产实例1. 酒精生产工艺学2. 抗生素生产3. 氨基酸生产工艺第十章 微生物工程在环境保护中的应用1. 微生物工程在环境保护中的应用2. 活性污泥法、生物膜法处理废水