微生物综合实验设计方案生技121+第八组.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流微生物综合实验设计方案生技121+第八组.精品文档.土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定生技121班吴金明 闫瑞强 邝毅璋 李北娇 邓其芬关键词：淀粉酶 芽孢杆菌 淀粉酶活力一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域。

2、在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌、凝结芽孢。由于芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤和植物体表面及水体中。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。二、实验目的要求掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法；学会微生物分离纯化原理及方法和技术；学会掌握产淀粉酶活力测定的原理和方

3、法。培养学生的综合应用微生物实验方法的能力培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力三、实验原理自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm30 cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少。从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度

4、和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。为了获得某种微生物的纯培养,一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同,而供给它适宜的培养条件,或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其他菌生长的环境,从而淘汰其他一些不需要的微生物,再用稀释涂布平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物,直到得到纯菌株。在自然界的土

5、壤中有可能分布着能产淀粉酶的芽孢杆菌，通过土样稀释、加热土壤悬液杀非芽孢细菌、平板分离可获得细菌的单菌落，经革兰氏染色、芽孢染色可判断分离菌株是否为芽孢杆菌，将单菌落点接含有淀粉的平板，凡是具有产淀粉酶能力的的芽孢杆菌能水解淀粉，从而在淀粉平板上菌落周围会出现水解圈，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。由此可将产淀粉酶能力的菌株分离，分离后再进一步划线纯化，对分离出的各菌株可通过形态观察及染色，得到纯培养的芽孢杆菌。根据从伯杰式细菌学手册芽孢杆菌属中检索到的芽孢杆菌的生理生化特点，选取能从土壤中分离到的芽孢杆菌种为标准菌种，通过对目的菌种进行多项生理生化实验，对比伯杰式手册的实验结果，从

6、而鉴定出目的菌的种别。 芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25到75以上；最低生长温度大约5到45；生长最低pH值，从7.58到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养明胶（22）7天内液化1厘米或1厘米以上。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源四、实验材料和试剂图书馆和生化楼附近的土壤、无菌防水纸袋，草酸铵结

7、晶紫染色液，路戈尔氏碘液，95乙醇，石炭酸复红染液，香柏油，二甲苯，5孔雀石绿染色液，显微镜，载玻片，盖玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，试管，培养皿，滴管，洗瓶，吲哚试剂，乙醚，40NaOH，无菌玻璃涂棒，无菌培养皿，无菌试管，三角瓶，烧杯，玻璃棒，移液管，移液枪，恒温培养箱，超净工作台，高压蒸汽灭菌箱。营养琼脂：蛋白胨1g、牛肉膏0.3g、氯化钠0.5g、琼脂1.5 2.0g、蒸馏水100ml、将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.27.4。加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。糖发酵培养基：蛋白质0.4g，氯化钠1g，K2HPO40.04g,溴麝香草酚蓝

8、水溶液0.4ml，葡萄糖2g,水200ml蛋白质0.4g，氯化钠1g，K2HPO40.04g,溴麝香草酚蓝水溶液0.4ml，乳糖2g,水200ml淀粉牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：可溶性淀粉0.4g，牛肉膏0.6g，蛋白胨2g，水200ml，氯化钠1g，琼脂3.6g，PH7.2-7.4葡萄糖蛋白胨培养基：葡萄糖1g，蛋白胨1g，氯化钠1g，水200ml，PH7.2-7.4蛋白胨水培养基：蛋白胨2g，氯化钠1g，水200ml,PH7.2-7.4西蒙斯氏柠檬酸盐培养液：柠檬酸钠0.4g，氯化钠1g，1溴麝香草酚蓝水溶液10ml，琼脂3-4g，水200ml，MgSO47H2O 0.04g，KHPO43H2

9、O 0.2g，(NH4)2HPO4 0.2g耐盐培养基：蛋白胨1g 牛肉膏0.3 g 氯化钠2g 琼脂1.5 2.0g 蒸馏水100ml 蛋白胨1g 牛肉膏0.3 g 氯化钠5g 琼脂1.5 2.0g 蒸馏水100ml 蛋白胨1g 牛肉膏0.3 g 氯化钠7g 琼脂1.5 2.0g 蒸馏水100ml 蛋白胨1g 牛肉膏0.3 g 氯化钠10g 琼脂1.5 2.0g 蒸馏水100ml 蛋白胨1g 牛肉膏0.3 g 氯化钠15g 琼脂1.5 2.0g 蒸馏水100ml明胶培养基：蛋白胨 1g 牛肉膏0.6g 明胶2.4g 水200ml pH 6.87.0酪氨酸水解培养基：5%2-酪氨酸10mL 营

10、养琼脂100mL.用时再混匀.运动性穿刺培养基: 蛋白胨2g 牛肉膏0.6g 氯化钠1g 琼脂0.8-1.2g 水200ml (pH7.27.4)酪素水解培养基：20g脱脂奶粉200mL蒸馏水;6g琼脂,200mL蒸馏水.分开灭菌,现配现用.硝酸盐培养基：硝酸钾0.02g，蛋白胨0.5g，蒸馏水100ml，ph7.4，分装试管5ml丙二酸盐培养基： 丙二酸盐0.3g，酵母浸膏0.1g，Nacl0.2g，硫酸铵0.2g，K2HPO40.06g 、K2H2PO4,水100ml，pH6.8，高压灭菌备用，0.2%溴麝香酚兰乙醇1.25ml氰化钾培养基: 蛋白胨1g，氯化钠0.5g，磷酸二氢钾0.02

11、25g，磷酸氢二钠0.564g，蒸馏水100ml，0.5%氰化钾溶液2ml，pH7.6醋酸铅试纸培养基：蛋白胨1g，胱氨酸0.1g,硫酸钠0.1g，水100ml，ph7.0-7.4，滤纸剪成0.51.0cm宽，用5%-10%de 醋酸铅浸湿，烘干，置于培养皿备用。马尿酸钠培养基：马尿酸钠1g、肉浸液100mL （将马尿酸钠溶解于肉浸液内，分装于小试管内，并于管壁画一横线。以标志管内液面高度，高压灭菌12120min。）三氯化铁(FeCl36H2O)12g，溶于2%盐酸溶液100mL中即成。试剂： (1)2% 淀粉溶液 (2) 0.4mol/L 氢氧化钠 (3) pH5.6 柠檬酸缓冲液：称取柠

12、檬酸 20.01g ，溶解后定容至 1000mL ，为 A 液。称取柠檬酸钠 29.41g ，溶解后定容至 1000mL ，为 B 液。取 A 液 13.7mL 与 B 液 26.3mL 混匀，即为 pH5.6 之缓冲液。 (4) 3,5- 二硝基水杨酸：精确称取 1g3,5- 二硝基水杨酸溶于 20mL 1mol/L 氢氧化钠中，加入 50mL 蒸馏水，再加入 30g 酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至 100Ml ，盖紧瓶塞，防止 CO 2 进入。 五、实验步骤和方法（一）纯培养的获得1、土壤的采集取两个土壤样点，用酒精消毒过的小铲子铲土，取其土表10cm处的土壤部分，用无菌纸袋装好，编号

13、并记录土壤附近的环境条件。土样序号地理位置颜色气味湿度周围植被1靠近图书馆河边的附近草地黄褐色青草味较大杂草2生化楼附近的草地红色青草味较大杂草2、分离纯化2.1梯度稀释两个土样分别取5g，放入各自装有45mL无菌水的三角瓶，振荡10min,即为稀释10-1的土壤悬浮液。每个环境的土样装1个锥形瓶，记好第一组第二组。 将锥形瓶加塞、包扎、摇匀（无菌室里），利用恒温水浴装置80左右水浴，水浴锅温度恒定后维持20min（制悬液时就应先开始加热），制成10-1 g/ml的土壤悬液再分别另取装有9mL无菌水试管8支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5各两支。取已稀释成10-1土壤液，振

14、荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10-2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。同法从10-2的试管中吸取1mL稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次连续稀释为10-4、10-5土壤稀释液。选择稀释度10-2、10-3、10-4，加热8020min处理稀释液以杀死无芽孢细菌，浓缩芽孢杆菌。2.2稀释涂布平板法是将已熔化并冷却至约50(减少冷凝水)的琼脂培养基, 先倒入无菌培养皿中, 制成8个无菌平板，在平板底部写好组别、稀释度等。待充分冷却凝固后，将两组不同稀释度的悬液抽取约1ml滴加在对号的

15、平板上，再用三角形无菌玻璃涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面, 倒置温箱培养后挑取单个菌落。2.3平板划线法是将已熔化并冷却至约50(减少冷凝水)的琼脂培养基, 先倒入无菌培养皿中, 制成8个无菌平板，在平板底部写好组别、稀释度等。 平板凝固后，各组分别用接种环以无菌操作挑取平板上长出的单菌落分区划线，先在平板培养基的一边作第1次平行划线34条，再转动培养皿约60角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行划线，再用同法通过第2次平行划线部分作第3次平行划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于2829C温室中培养约20h.。再继续分区划

16、线2-3次，以获得较纯的菌种。结合镜检个体形态特征，以此确定该菌株为纯培养若没有获得纯培养，继续进行分区划线，再镜检，直到获得纯培养。镜检时可将非杆菌的菌落剔除掉。将纯化得到的单菌落每样都分为两部分，其中一部分接种到培养基内，用以保存菌种，另一部分用来做实验。（二）初步鉴定1、形态学检验革兰氏染色法 将每个菌落都做一张涂片、干燥及固定初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1-2分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约25秒，后立即用流水冲洗。复染：滴加番红染色液，染2分钟，水洗后用吸水

17、纸吸干。 镜检：观察染色结果图。再次确定每个菌落都为杆菌，若有不是杆菌的菌落，则剔除掉。芽孢染色法将已确定为杆菌的菌落进行芽孢染色法，检出有芽孢的杆菌。制备菌液：加1-2滴蒸馏水于试管中，从斜面挑取2-3环的菌苔于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。加染色液：加5%孔雀绿2-3滴于试管中用接种环搅拌，使其充分混合。加热：将此试管浸于沸水浴中，加热15-20分钟。涂片：从试管底部挑菌液于洁净的玻片上，涂成薄膜，晾干。固定：将涂片通过微火3次。脱色：水洗，直到流出的水中无绿色为止。复染：加番红染色2-3分钟后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸去余水，于酒精灯火焰上烘干。镜检：用油镜观察，筛选出有

18、芽孢的杆菌菌落。2、生理生化实验淀粉水解实验（淀粉牛肉膏蛋白胨琼脂培养基）以18-24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区划“+“字接种，）或直接移种于淀粉肉汤中，于361培养24-48h，或于20培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。以此筛选出产淀粉酶的菌株。淀粉水解是逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性

19、或微酸性，以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。糖类发酵试验 （糖发酵培养基两种）可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。 操作前注意观察未接种细菌的正常单糖发酵管状况。接种培养：以无菌操作分别将少量菌苔接种于乳糖发酵管及葡萄糖发酵管中。置37恒温箱中培养，分别在培养24h、48h、和72h观察结果。观察记录 ：若接种培养液保持原有颜色，

20、其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“”表示。乙酰甲基甲醇试验(VP试验)（葡萄糖蛋白胨培养基） 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP（+）反应。标记试管 ：取数支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记好做实验的菌株组别，类型接种培养 ：以无菌

21、操作分别接种少量菌至以上相应试管中，置37恒温箱中，培养2448h。 观察记录 ：取出以上试管，充分振荡2min。每管分别加入40NaOH溶液1020滴，并加等量-奈酚，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37恒温箱中保温1530min后，若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性反应（用“”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性反应（用“”表示）。 注意：原试管中留下的培养液用作甲基红试验。甲基红试验（M.R.试验）（葡萄糖蛋白胨培养基）肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下

22、降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。 于V.P.试验留下的培养液中，各加入23滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“”或“”表示。吲哚试验 （蛋白胨水培养基）有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。 试管标记 ：取装有蛋白胨水培养液的试管数支，分别标记好菌株的组别类型。接种培养 ：以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，置37恒温箱中培养2448h。 观察记录 ：在培养液中加入

23、乙醚12ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入510滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“”、阴性用“”表示。 明胶水解试验（营养明胶培养基）有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。方法：挑取18-24h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于20-22培养7-14天。明胶高层亦可培养于361。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化

24、时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，若为阳性，10-20min后，菌落周围应出现清晰带环。否则为阴性。耐盐性试验（耐盐培养基）将分离获得的细菌分别接种在NaCl浓度为1%，2%，3%，4 %，5%的牛肉膏蛋白胨液体培养基中,置37下培养,观察生长情况 5。运动性试验（运动性穿刺培养基）使用半固体营养琼脂试管,将接种针从直立柱培养基中央自上而下直刺到离管底11.5cm处,沿原穿刺线拔出接种针.于37度温箱24h,观察是否产生树根状生长,若有,则菌株有鞭毛,若直立生长,则菌株无鞭毛. 柠檬酸盐试

25、验（西蒙氏柠檬酸盐培养基）取装有西蒙斯氏柠檬酸盐培养基的试管分别标记待测菌种的编号，以无菌操作分别将少量菌苔接种于各支相应的管中，然后置于37恒温箱中培养24h。观察结果，若培养基变蓝色，则表明该菌能利用柠檬酸盐作为碳源而生长，即为阳性反应，以“”表示。若培养基仍为绿色则为阴性反应，以“”表示。温度对微生物生长的影响 将牛肉膏蛋白胨培养基熔化倒平板。（培养基厚度为一般培养基的1.5 到2倍） 取30 套牛肉膏蛋白胨平板，分别进行标号。 在上述各平板中分别划线接种不同的菌种，每个菌种重复接种六个平板。各取每个菌种两套平板倒置于4 （冰箱）、37（或者室温），60下保温培养24 小时，观察细菌的生

26、长状况。（“”不生长，“+”生长较差 ， “+”生长一般，“+”生长良好。硝酸盐还原实验（硝酸盐培养基）将菌种接种于硝酸盐培养基中，37摄氏度培养三至五天，每支菌做两支重复。取两支干净空试管或在比色瓷盆小窝中倒入少许培养三五天的培养液，再加入一滴格里斯氏试剂A液及B液，。当培养液中加入AB液后，溶液变成粉红色，玫瑰色，橙色棕色等，表示亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，则可加一两滴二苯胺试剂，此时如成蓝色，则表示仍有硝酸盐存在，有无亚硝酸盐反应。如不成蓝色，则表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都被还原成其他物质，故仍然按硝酸盐还原阳性处理。酪素水解试验（酪素水解培养基）将两液分别融化,混匀倒

27、平板,即成牛奶平板.然后将菌种点接在平板上,37度温箱中培养24h.记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明酪氨酸水解试验（酪氨酸水解培养基）将营养琼脂融化,冷却至温热,与L-酪氨酸混匀.分别将菌种点接在平板上,37度培养24h,记录菌落周围是否有透明圈.若有,则菌株能够水解酪氨酸. 硫化氢（H2S）试验 （醋酸铅试纸培养基）有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。 试验方法：在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中，沿管壁穿刺接种，于361培养2428h，培养基呈黑色为阳性。也可用醋酸铅纸条法：将待试菌接种于一般营养肉汤，再将醋酸铅纸

28、条悬挂于培养基上空，以不会被溅湿为适度：用管塞压住置361培养16天。纸条变黑为阳性。丙二酸盐试验 （丙二酸盐培养基）丙二酸盐是三羧酸循环中琥珀酸脱氢酶的抑制剂。能否利用丙二酸盐也是细菌鉴定中的一个鉴别性特征。许多微生物代谢有三羧酸循环，而琥珀酸脱氢是三羧酸循环的一个环节，丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶，与丙二酸不被分解，所以琥珀酸脱氢酶被占据，不能释放出来催化琥珀酸脱氢反应，抑制了三羧酸循环。 接种和观察结果：用幼龄菌种接种测定培养基和空白培养基，于适温培养12d，观察培养基变色情况。如测定培养基生长并变蓝色，表示可利用丙二酸盐，为阳性结果。反之，如测定培养基未变色，而空白对照培养基生长，则

29、为阴性，即不利用丙二酸盐。氰化钾试验 (氰化钾培养基)氰化钾（KCN）是呼吸链末端抑制剂。能否在含有氰化钾的培养基中生长，是鉴别肠杆菌科各属常用的特征之一。接种和观察结果：用幼龄菌种接种于加氰化钾的测定培养基和未加氰化钾的空白培养基中，适温培养1-2d，观察生长情况。能在测定培养基上生长者，表示氰化钾对测定菌无毒害作用，为阳性。若在测定培养基和空白培养基上均不生长，表示空白培养基的营养成分不适于测定菌的生长，必须选用其它合适的培养基。而测定菌在空白培养基上能生长，在含氰化钾的测定培养基上不生长，为阴性结果。 应该注意：氰化钾是剧毒药品，操作时必须小心。培养基用毕，每管加几粒硫酸亚铁和0.5mL

30、20%KOH以解毒，然后清洗。马尿酸钠盐水解试验（马尿酸钠培养基） 用纯培养物接种，于42培养48h，观察培养液是否到达试管壁上记号处，如不足时，用蒸馏水补足至原量。经离心沉淀，吸取上清液0.8mL，加入三氯化铁试剂0.2mL，立即混合均匀，经1015min，观察结果。 结果：出现恒久之沉淀物为阳性。根据形态与生理生化试验的结果,查阅伯杰氏手册,鉴定菌株的菌种（三）酶活的测定将筛选的纯菌种接种于30/250ml种子培养基，37、250r/min摇床培养过夜。种子液以2%接种量接种于产酶液体培养基50/500ml，相同条件培养72h，发酵液8000r/min离心10min，取上清液测酶活，每个样

31、品重复3次，最后于结果取平均值。1、取7支20 ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表加入试剂。摇匀,至沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20 ml,以1号管作为空白调零点,在520 nm的波长下比色测定吸光度值。并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。表1 标准麦芽糖溶液成分表及OD测定值试剂1234567麦芽糖标准液（mL）00.20.61.01.41.82.0H2O（mL）2.01.81.41.00.60.203,5-二硝基水杨酸（mL）2.02.02.02.02.02.02.0麦芽糖含量（mg）00.20.61.01.41.82.0OD5202、粗酶液淀粉

32、酶活力测定待测粗酶液的制备：发酵24 h后发酵液4000 r/ min离心10 min,去除菌体，在上清液中加入65饱和度的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于4盐析2h，然后5000r/min离心20min，得到初步纯化的淀粉酶。按以下顺序操作：取预先洁净灭菌干燥试管,编号。取粗酶液1 ml于各只试管中，于60水浴中预热5min柠檬酸淀粉缓冲液同时在60水中预热5min，取柠檬酸淀粉缓冲液1ml加入试管中,于60水浴中保温30min加入1.5 ml 3,5-二硝基水杨酸,沸水中5 min,加入氢氧化钠溶液终止反应,加蒸馏水至20 ml。摇匀,用分光光度计测定OD520 nm值。在上述条件下以单位体积

33、样品在30 min释放1 mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位表示酶活性。在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量按下列公式计算酶活力酶活力测定公式：淀粉酶活力=麦芽糖含量（mg）淀粉酶原液总体积（mL）/所加淀粉质量每个样品按下表所示步骤操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支管中加入试剂的时间间隔要绝对一致：表2样品酶活力测定步骤反应顺序样品（重复3个）样品空白标准空白样品稀释液（ml）110蒸馏水00160预热5min依次加入淀粉溶液（ml）1.51.51.5混合60保温30min依次加入DNS试剂（ml）1.51.51.5混合100煮沸5min加入0.4mol/L NaOH溶液终止反应加入蒸

34、馏水至总体积（ml）202020反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4,000rpm离心10min，上清液以标准空白调零，在分光光度计520nm波长处测定样品空白（A0）和样品溶液（A）的吸光值，AA0为实测吸光值。用直线回归方程计算样品淀粉酶的活性。3、活性计算酶活力单位定义：在60、PH5.6条件下，每小时从2的可溶性淀粉溶液中释放出1mg尔麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位（U）淀粉酶活性U按下式计算：K（AA0） F S（3060）180 U = 其中：U样品淀粉酶活性，U/ml； K标准曲线斜率；F样品溶液反应前的总量，ml；S样品测试量；表1中S1ml；601

35、小时为60min；30反应时间，min。六、注意事项及可能存在的问题1、严格遵守无菌操作要求，防止污染情况发生；2、称取药品过程中，药勺不要混用，避免交叉感染，称完药品要及时盖上盖子，放回原位；3、革兰氏染色注意控制好脱色时间，过长过短都会影响实验结果； 4.4调pH是小心操作，避免回调，从而引起误差；4、在芽孢染色过程中，注意温度的控制，避免因菌体细胞破裂而释放大量游离芽孢；5、预期实验结果：通过对土壤中微生物的分离和筛选，得到3种以上的产淀粉酶芽孢杆菌，并通过生理生化试验成功将其一一鉴定，进一步测定各菌种的淀粉酶活力，总结出各菌种的特性和应用价值。七、参考文献【1】 伯杰细菌鉴定手册( 第

36、八版) M . 北京: 科学出版社,1984.【2】 周德庆.微生物实验手册M.上海: 上海科学技术出版社, 1986: 65-70, 178- 180【3】 张双民，土壤中淀粉酶高产菌株的分离及产酶条件的优化J 土壤肥料， 2006，( 2) 【4】 1. 唐丽江，王振华，王迪. 高产淀粉酶芽孢杆菌菌株的筛选J. 安徽农业科学, 2009，(12)；【5】 2. 王晓红. 产低温淀粉酶菌株的筛选及其酶学性质的研究D. 新疆农业大学， 2006；【6】 4. 张家磊. 产耐高温淀粉酶菌株的筛选及离子束诱变研究D. 安徽农业大学， 2008；【7】 6. 张应玖，朱学军，关键，李吉平，薛雁，郝黎明，赵文斌. 一种新型淀粉酶的鉴定及其产酶菌株的筛选J. 微生物学通报，2002，(05)；