植物组织培养校本教材123.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流植物组织培养校本教材123.精品文档.植物组织培养与实训校本教材王 利 楼男楠杭州职业技术学院临江学院2011年1月前 言经过40多年的发展，植物组织培养技术已渗透到生物学科的各个领域，广泛应用于农业、林业、工业和医药业，成为生物技术的重要组成部分和基本研究手段。尤其是在植物优良品种的快速繁殖、脱毒苗木生产、新品种培育、种质资源保存、药用植物工厂化生产等方面发挥了重大的作用，产生了可观的经济效益和社会效益，成为生物科学中最有生命力的学科之一。植物组织培养技术不仅在生产上起作用，也是细胞学、生理学、遗传学、生物化学等基础研究的重要手段，促进了生

2、物学基础学科的发展。因此无论是在生产应用上还是基础理论研究上，植物组织培养技术都是十分重要的。根据学院“工学结合”、“项目化”课程的要求，使高职学生能更好的掌握实用的技能，本教材在编写上以强化技术应用能力为主线，以高职教学目标为切入点，本着理论与实践结合、课堂与工厂化结合、做中学、做中教的原则，力图通过一些贴近企业实际操作的实例，阐明植物组培培养的基本理论和技能。本教材分基础应用和技能训练两部分。基础应用主要介绍植物组织培养的基本概念、发展历史及应用，组培实训室的设计与设备使用，植物组织培养的基本操作技术及一般培养方法、植物脱毒技术等。重点突出培养基的制备、外植体的选择与消毒、材料培养、炼苗移

3、栽和植物脱毒等实用技术。技能训练部分选取了实用性较强的11个实训项目（其中项目二、四为两个项目合并）为学生实训提供指导。教材编写过程中也得到了企业专家的大力支持，其中传化大地生物公司的楼男楠工程师更是参与了教材的编写工作，企业专家的大量意见和建议，使项目在内容设置和技能的培养方面能更好的接近企业的操作，使学生能身临其境的感受企业化操作的各种要求。目 录第一章 植物组织培养概述41.1植物组织培养的发展现状41.2植物组织培养的基本概念5第二章植物组织培养实训室设计与设备使用72.1植物组培实训室设计82.2 实训室的组成及相关设备8第三章 植物组织培养的基本操作技术103.1植物组织培养的工作

4、流程103.2植物组织培养培养基及配制113.3 灭菌技术173.4外植体的选择与消毒183.5材料的培养21第四章 实训项目30实训项目一 组培室设备参观及器皿的洗涤和灭菌30实训项目二 母液的制备及培养基的配制、灭菌32实训项目三 植物组织培养整体方案设计操作36实训项目四 常见花卉植物的初代培养37实训项目五 试管苗的继代培养与转接39实训项目六 植物的生根培养41实训项目七 药用植物铁皮石斛的组织培养42实训项目八 药用植物的花药培养44实训项目九 试管苗的驯化移栽45附录一植物生长调节剂47附录二相关设备48附录三植物组织培养流程图49参考文献 50第一章 植物组织培养概述1.1 植

5、物组织培养的发展现状 植物组织培养是从20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。它是指在无条件下,将离体的植物器官(如根、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等) 、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等) 、细胞(如体细胞、生殖细胞等) 、胚胎(如成熟和未成熟的胚) 、原生质体(如脱壁后仍具有生活力的原生质体)培养在人工配制的培养基上,给予适宜的培养条件,诱发产生愈伤组织、潜伏芽等,进而培育成完整的植株,统称为植物组织培养。由于是在试管内培养,而且培养的是脱离植株母体的培养物,因此也称之为离体培养或试管培养。根据外植体来源和培养对象的不同,又分为植株培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、原生质体

6、培养等。从20世纪50年代我国植物组织培养创始人之一罗士韦教授在中国科学院上海植物生理研究所开展了组织培养的研究以来,植物组织培养技术已有丰硕的研究成果。在近10多年来其发展更为迅速,全国各地许多农业科研院所和高校都开展了植物组织培养研究工作,对农作物、观赏植物、园艺作物、经济林木等上千种植物进行组织培养研究并取得了成功,同时在实践中总结出很多有益的经验,如郑文静等较好地总结了植物组织培养中的常见问题和具体解决方法;吴毅明等在植物组织培养的环境微生态的研究中,用通透性好的化学纤维、纸卷、蛭石、沙子等代替琼脂作培养基,可有效地改善根际环境,促进小植物生根;刘思九采用的暴露培养法,即在敞口培养器中

7、用特制的粉沫状灭菌材料覆盖培养基和外殖体,使其不受污染,通过特制装置补水,让组培苗暴露在室内空气中生长,其长势优良,不炼苗即可移栽。肖玉兰等研究的无糖箱式培养法(培养基不放糖,在培养瓶内用特殊装置注入CO2 ,然后加强光照35倍,小植物能进行光合作用自给养分) ,使植株生长量成倍增长,有效地降低了生产成本。植物组培快繁的国内现状与趋势表明该项技术已由试验阶段进入了生产阶段,花卉、蔬菜、果树、中草药等已有100多个品种能工厂化生产,花卉年出口创汇能力已达8 000多万美元。同时,随着我国加入WTO后国内农业的国际贸易出现更加自由宽松的环境,要抓住机遇,引进、吸收、消化国外先进的组培经验和成果,根

8、据我国现在的经济和农业发展情况,积极发展组培业,适当创建半自动化、专业化的组培快繁工厂,有选择地生产一些名贵、珍稀及国内外紧俏的植物品种,或在植物脱毒、转基因上进行商业化生产,在实践中培养和造就出一批组培产业的生产技术及经营管理人才,形成自己的特色和生产格局,在未来的国际竞争中和在组培苗品种、生产技术、经营管理、市场流通等方面逐步缩小与组培业发达国家的差距,逐步与国际市场接轨,从而为发展我国现代农业提供可靠的技术支撑。1.2 植物组织培养的基本概念1.2.1 植物组织培养的概念植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下

9、进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义是指组培指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。1.2.2 植物组织培养的类型1.2.2.1 按外植体的来源，植物组织培养可分为以下几种类型：1）植株培养 植株培养是指对具有完整植株形态的幼苗或较大的植株进行离体培养的方法。2）胚胎培养 指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。3）器官培养 指以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离体无菌培养，如根的根尖和切段，茎的茎尖、茎节和切段，叶的

10、叶原基、叶片、叶柄、叶鞘和子叶，花器的花瓣、雄蕊（花药、花丝）、胚珠、子房、果实等的离体无菌培养。4）组织培养 指以分离出植物各部位的组织（如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳组织、薄壁组织、髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。这是狭义的植物组织培养。5）细胞培养 指以单个游离细胞（如用果酸酶从组织中分离的体细胞，或花粉细胞，卵细胞）为接种体的离体无菌培养。6）原生质体培养 指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养。1.2.2.2 按培养过程，可分为以下几个类型：1）初代培养 将植物体上分离下来的外植体进行最初几代培养的过程。目的是建立无菌培养物，诱导腋芽

11、或顶芽萌发，或产生不定芽、逾伤组织、原球茎。2）继代培养 将初代培养诱导产生的培养物重新分割，转移到新鲜培养基上继续培养的过程。目的是使培养物得到大量繁殖，也称增殖培养。3）生根培养 诱导无根祖培苗产生根，形成完整植株的过程。目的是提高组培苗移栽后的成活率。1.1.3 植物组织培养的特点 1）培养条件可以人为控制 组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。 2）生长周期短，繁殖率高 植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求

12、而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往20-30天为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。3）管理方便利于工厂化生产和自动化控制植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，极利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。4）培养材料来源广泛由于植物细胞

13、具有全能性，单个细胞、小块组织、茎尖或茎段等经离体培养均可再生完整植株。殊的培养方法和操作技术。第二章 植物组织培养实训室设计及设备使用2.1 植物组培实训室设计在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来没计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条

14、件。设计原则：环境适宜、操作方便、满足“5S”管理要求、能保证无菌操作及避免污染 1）实训室选址组培实训室最好选择在空气清新、光线充足、通风良好、环境清洁、水电齐备的地方，避开各种污染源，以利于组织培养的顺利进行，降低培养过程的污染率，培育出优质试管苗。2）实训室设计大型的组培实训室可设置洗涤室、培养基制备室、灭菌室、接种室、培养室、观察记录室、贮藏室，此外室外还配有一定面积的移苗温室。这种设置一般为企业车间操作的设计形式，可满足流水式生产。学校考虑场地原因可设计小型实训室，把同类操作加以合并，如洗涤室、培养基制备室、灭菌室、药品室、称量室合并为一个准备室，但接种室、培养室、移苗室需单独设置。

15、实训室布局要合理，通常按组培的工作程序，设计成一条连续的生产线，以保证工作的连续性。设计时要做到工作方便、降低污染、节省能源，同时应设有消防设施，安全使用。2.2 实验室的组成及相关设备按照小型实训室的设计原则，实训室设计如下：2.2.1 准备室包括洗涤室、称量室、灭菌室、药品室、培养基制备室2.2.1.1洗涤室：主要用于玻璃器皿、实验用具的清洗和干燥，培养材料的清洗、预处理，设备组成如下：1）器皿柜：2-3个 ，主要用于放置各种玻璃器皿。2）恒温干燥箱：1台，主要用于接种瓶、培养皿等的干燥。3）水槽：1-2个，主要用于器皿的洗涤和培养材料的清洗。4）搁架：2-3个，主要用于玻璃器皿的放置、晾

16、干等5)玻璃器皿：烧杯（500ml、100ml）、容量瓶（1000ml、500ml、100ml）、试剂瓶、锥形瓶、培养皿、接种瓶、移液管。2.2.1.2 称量室：用于试剂和药品的称量，要求：干燥、密闭、无直射光源，设备组成如下：1）电子天平：读数精度0.1mg 1台2）普通天平：2台读数精度0.1g2.2.1.3 药品室：主要用于各种药品试剂的存放，要求：干燥、通风、避光，设备组成如下:1)药品柜：用于存放可室温下存放的药品和试剂2）冰 箱:用于存放各种配制好的母液和有机物、生长素、细胞分裂素等对温度敏感的药品和试剂。2.2.1.4 培养基制备室：主要用于母液和植物生长调节剂原液的配制，培养基

17、的配制、分装、包扎和灭菌的暂时存放。设备组成如下：1）酸度计：1台， 主要用于调节培养基的PH值2）微量可调移液器：1-1000um ，用于培养基的分装2) 磁力搅拌器：1台， 用于搅拌混匀3）中央实验台：1个 4）电 炉：2个 ，主要用于试剂和琼脂的溶解5）锥形瓶、容量瓶、接种瓶、大烧杯（500或1000ml）、移液管、玻璃棒。2.2.1.5 灭菌室：用于培养基和器皿的灭菌以及蒸馏水的制备。设备组成如下：1）蒸汽压力灭菌锅：1台 主要用于高压蒸汽灭菌2）干热灭菌箱：1台 主要用于干热灭菌3）橱柜：1台 主要用于器皿和培养基的放置2.2.2 接种室：进行无菌操作的场所，培养材料的消毒、接种、无

18、菌材料的继代、丛生苗的繁殖、切割、嫩芽扦插生根等在此完成。需安装紫外灯照射杀菌，同时应留有缓冲间，以更换服装。1)超净工作台：双人 2台 主要用于培养材料的接种操作2）接种器具杀菌器：4台 主要用于接种和接种过程中的消毒灭菌3）组培用推车：1台 用于放置培养基和接种好的试管苗4）剪刀、镊子、手术刀、记号笔、酒精灯、无菌培养瓶若干5）传递窗：2台 在设置风淋室情况下，传递所需要的材料6）紫外灯：1台 主要用于室内的消毒2.2.3 培养室：接种好的材料应放入培养室培养。培养温度25左右。安装紫外灯进行定期杀菌。1）高效节能培养架：2-6个 主要用于试管苗的培养2）调频多用振荡器：1台 3）微电脑光

19、照培养箱：2台 主要用于小型试验研究和材料保存。有调温、定时和光照装置，可根据需要选择培养温度和光照时间。4）温湿度计：2个 主要用于监控房间内温度5）空调:1台 主要用于调节室内温度6）除湿机：1台 主要用于降低培养室内的湿度，防止湿度过高引起污染7）摇床：1台 主要用于培养物的液体培养，通过摇床的振动来改善液体培养基中的细胞或组织的营养及氧气供应，加快细胞或组织的生长速度。附：设备图见附录第三章 植物组织培养的基本操作技术植物组织培养除需要有设计合理、配备必需的仪器设备、器皿用具外，还必须熟练掌握植物组织培养的基本操作技术，这是培养成功的前提条件。植物组织培养的基本操作通常包括器皿的洗涤、

20、灭菌，培养基的配制、灭菌，外植体的选择、消毒，无菌操作技术，材料的初代培养、继代培养、生根培养、炼苗移栽等。3.1 植物组织培养的一半工作流程一个完整的植物组织培养过程一般包括以下几个步骤：1）准备阶段 该阶段需要查阅相关文献，根据已成功培养的相近植物资料，结合实际制订出切实可行的培养放方案。然后根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段所需的培养基，并经高压灭菌或过滤除菌后备用。2）外植体的选择与消毒 选择合适的部位作为外植体，采回后经过适当的预处理，然后进行消毒处理。将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块，接种到初代培养基上。3）初代培养 接种后的材料置于培养室或光照培养箱

21、中培养，促使外植体中已分化的细胞脱分化形成愈伤组织，或顶芽、腋芽直接萌发形成芽。然后将愈伤组织转移到分化培养基中分化成不同的器官原基或形成胚芽体，然后发育成再生植株。4）继代培养 分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的继代培养基经反复切割转接。当芽苗繁殖到一定数量后，再将一部分用于壮苗生根，另一部分保存或继续扩繁。进行脱毒苗培养的需提前进行病毒检测。5）生根培养 刚形成的芽苗通常比较弱小，多数无根，此时可降低细胞分裂素浓度或不加，提高生长素浓度，促进小苗生根，提高其健壮度。6）炼苗移栽选择生长健壮的生根苗进行室外炼苗，待苗适应外部环境后，再移栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮阴、防止病

22、虫为害。当组培苗完全成活并生长一定大小后即可移向大田用于生产。3.2 培养基3.2.1 培养基的成分培养基是植物组织培养的物质基础，也是组织培养能否成功的重要因素之一。培养基的主要成分是植物生长发育所必需的各种营养元素、对植物组织培养起调控作用的生长调节物质以及碳源、维生素、有机添加物等。3.2.1.1 水分培养基中的主要成分是水，在组织培养中水分既是培养物生命活动必需的成分，也是各种成分溶解所必需的介质，同时提供O、H两种元素。3.2.1.2 无机盐类包括大量元素和微量元素，为培养物提供除O、H之外的一切必需元素。1）大量元素：包括氮、磷、钾、钙、镁、硫、氯等，它们与植物结构物质和功能物质的

23、构成、物质代谢和生长发育的调控密切相关。2）微量元素：包括铁、锰、锌、硼、铜、钴、钼。微量元素大多是生物酶的辅酶或辅助因子，对调节物质代谢以及叶绿素的生成起到重要的作用。微量元素浓度一般在10-7-10-10mol/L，添加过多会产生毒害。3.2.1.3 有机营养成分植物组织培养中的培养物不同于完整的植株，没有系统的物质合成等自养功能。因此为了使离体的培养物能正常发育和生长，需添加碳源、维生素、氨基酸等有机成分。1）碳源：包括糖类、醇类和有机酸，其中糖类最重要。蔗糖是目前所用的最好碳源，它加热后会分解为葡萄糖和果糖有利于植物的吸收和利用。糖类的使用浓度一般在2%-5%。2）维生素：维生素在植物

24、细胞中主要以各种辅酶的形式参与代谢活动，对生长发育和分化有促进作用。主要包括：维生素B1又名盐酸硫胺素，它对逾伤组织的产生和生活力有重要作用；维生素B6又名盐酸吡哆醇（辛），它能促进根的生长；维生素B5又名烟酸，它与植物代谢和胚的发育有一定关系。维生素C又名抗坏血酸，它作为抗氧化剂防止组织褐变。通常在组织培养中需添加一种到数种维生素，用量一般为0.1-1.0mg/L。3）肌醇：在糖类的相互转化中起重要作用，也是细胞壁的构成成分，适当的使用肌醇，能促进逾伤组织的生长以及胚状体和芽的形成，对组织和细胞的繁殖、分化以及细胞壁的形成起到作用。使用浓度为50-100mg/L。4)氨基酸：它是蛋白质的组成

25、成分，也是很好的有机氮源，可直接被植物细胞吸收利用。常用的氨基酸有：甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸等。用量一般在10-1000mg/L。5）有机复合物：为促进某些逾伤组织和器官的生长，在培养基中还常加入某种化学成分不明的天然营养混合物。常见的有：椰乳：对逾伤组织有促进作用，常用浓度10%-20%；香蕉汁：对PH值缓冲作用大，对外植体的分化有促进作用，用量为150-200mg/L；马铃薯汁：对对PH值缓冲作用大，多用于壮苗的培养，添加用量为150-200g/L；其他：酵母提取液主要成分为氨基酸和维生素类，用量为0.01%-0.5%。3.2.1.4 植物生长调节剂培养基中植物生长调节剂用量虽然少

26、，但是却是不可缺少的，不同浓度不同比例关系的植物生长调节剂，可以调节培养物的生长发育进程、分化方向和器官发生。1）生长素类：主要生理作用为促进细胞伸长和分裂，也有促进生根、抑制器官脱落、性别调控、产生顶端优势、促进单性结实等作用。在植物培养中生长素主要用于诱导逾伤组织的形成、根的分化以及细胞的分裂和伸长，此外还用于不定芽、胚状体的诱导。主要包括：IAA（吲哚乙酸）分子式：C10H9NO2,在酸性中不稳定，碱性溶液中较稳定。主要用于诱导逾伤组织形成、促进生根。IBA（吲哚丁酸）分子式：C12H13NO2，性状稳定不溶于水，易溶于乙醇等有机溶剂。主要用于促进生根，诱导持效期长，诱导的不定根多而细长

27、。NAA（萘乙酸）分子式：C12H10O2，性状稳定，易潮解，见光变色，其钠盐能溶于水。主要用于促进植物生长、生根、促进开花、抑制抽芽、促进早熟和增产。2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）分子式：C8H6O3CL，难溶于水，常温下性状稳定，成盐后易溶于水。主要作用因其浓度不同而不同，低浓度（0.510-6-1.010-6）促进逾伤组织形成；中浓度（1-2510-6）可防止落花落果，诱导无籽果实形成等；高浓度(100010-6)可杀死多种阔叶杂草。2）细胞分裂素，在植物组织培养中主要作用是促进细胞分裂和分化，诱导胚状体和不定芽的形成，延缓组织的衰老并促进蛋白质的合成。常用于芽的诱导和继代增殖培养。

28、主要包括：6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）分子式：C10H9N50，是目前应用最广泛的细胞分裂素，主要作用诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长；促进细胞分裂扩大；抑制根的分化。赤霉素 ，分子式：C19H22O6，稳定性随PH升高而降低，易溶于冷水。主要作用，促进芽的伸长、叶的扩展、器官和胚状体的生长、提高种子发芽率。3.2.1.5 其他成分除营养成分外，因培养目的和培养材料不同，还需要加入一些其他成分。如培养基的凝固剂、活性炭、抗生素、抗氧化物质、诱变剂等。1）凝固剂：为使培养材料在培养基上固定和生长，需要添加凝固剂形成固体培养基。常用的有琼脂：琼脂溶于95的热水成为溶胶，当温度降低到40时，凝固为固体

29、状凝胶。用量6-10g/L，用量太少，培养基不容易凝固；用量太多，培养基硬度过高，不利于培养物的吸收。2）活性炭 可吸附培养基中由培养物所分泌的抑制物质及琼脂中的杂质，起到抑制褐变、促进生根、减轻玻璃化等作用。3）抗生素 培养基中添加抗生素可防止菌类污染，减少培养材料的损失，常用的抗生素有青霉素、链霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等，用量一般为5-20mg/L.4)天然有机添加物 天然有机添加物的成分比较复杂，大多含氨基酸、生长调节剂、酶等一些复杂化合物。它们对细胞和组织的繁殖与分化有明显的促进作用。常有的天然有机添加物有椰子汁、酵母提取液、番茄汁、香蕉泥等。5）硝酸银 离体培养中植物

30、组织会产生和散发乙烯，乙烯在培养容器中的积累会影响培养物的生长和分化，严重时甚至导致培养物的衰老和落叶。硝酸银中的银离子通过竞争性地结合于细胞膜上的乙烯受体蛋白，从而可起到抑制乙烯活性的作用。硝酸银的使用浓度一般为1-100mg/L，使用前过滤除菌。6）抗氧化物 植物组织在切割时会溢出一些酚类物质，渗出细胞外就造成自身中毒，使培养材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。常有的抗酚类氧化剂有半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮及抗坏血酸，可用浓度为50-200mg/L。3.2.2 培养基的类型及选择目前，基础培养基的配方很多，根据其成分及浓度特点，可分为四类：1）含盐量较高的培养基，主要代表MS培养基。特

31、点：无机盐浓度高，具有高含量的氮、钾，尤其是铵盐和硝酸盐的含量很大，能满足快速增长的组织对营养元素的需求，有加速愈伤组织和培养物生长的作用。但不适合生长缓慢、对无机盐浓度要求比较低的植物，尤其不适合铵盐过高易发生毒害的植物。2）硝酸钾含量较高的培养基，包括B5、N6、SH培养基。3）无机盐中等含量的培养基，包括H培养基、Nitsch培养基、Miller培养基等。4）无机盐低含量的培养基，包括White、WS培养基。目前，药用植物组织培养中用的最广泛的是MS培养基。3.2.3 培养基的制备3.2.3.1 母液的配制与保存所谓母液是欲配培养液的浓缩液，使用母液可以保证培养基各物质成分的准确性及配制

32、的方便性，同时便于保藏。通常母液是将培养基配方扩大10倍、20倍、100倍甚至更高倍数的浓缩溶液配制要求：1）按试剂种类分别称量、分别溶解，以防止产生沉淀。2）配制采用纯度较高的蒸馏水或去离子水。3）配制所用试剂应选用等级较高的分析纯或化学纯药品，以免带入杂质。4）母液一经发现出现沉淀、长菌或变质则停止使用。配制方法：1）大量元素母液大量元素一般配成浓度10倍或20倍的母液。配制时应分别称量、溶解，充分溶解后才能混合，混合时注意先后顺序，特别要将钙离子与硫酸根和磷酸根离子错开，以免产生沉淀，混合时要慢，边加边搅拌，然后定容至容量瓶。必要时应将钙单独配制。2）微量元素母液微量元素一般配成100倍

33、或200倍的母液，配制要求同大量元素。3）铁盐溶液铁盐溶液通常配成100倍或200倍母液。称取定量的硫酸亚铁和EDTA，分别充分溶解，再混合，调节PH至5.5，定容倒入棕色试剂瓶。4）有机物母液有机物母液一般配成100倍或200倍溶液，琼脂、蔗糖等可现用现配。5）植物生长调节剂母液植物生长调节剂大多难溶于水，应先用少量的适当溶剂（稀酸、稀碱、酒精）溶解，再加水定容至刻度。一般配成1mg/L或0.1mg/L，配制50或100ml贮存于棕色瓶中。母液配制好后，应贴上标签，注明母液名称、配制倍数、日期等。有机物母液、植物生长调节剂母液最好放入冰箱中保存，如出现沉淀、变质等应重新配制。见MS培养基配制

34、表3-13.2.3.2 培养基的配制1）将母液按顺序摆好，按照培养基配方的数量计算所需成分的量，进行量取。根据配制的量，称取凝固剂、蔗糖。2）在容器内加入1/3的纯水，按计算量加入琼脂融煮，等琼脂完全溶解后，依次加入大量元素、微量元素、铁盐、有机物、生长调节素及其他添加物，最好加入蔗糖，搅拌均匀。3）加水至规定体积，搅拌均匀。4)调节PH值。培养基配好后，应立即调节PH值，根据不同的中草药植物对PH值的要求不同，一般调节范围为5.3-6.0，用盐酸（氢氧化钠）1.0mol/L,搅拌均匀后再测定。5）分装。已经配好的培养基应及时分装，防止放置后凝固，分装至接种瓶中的培养基厚度一般为2-3cm。分

35、装时避免沾到瓶口，导致染菌。分装好的接种瓶上应做上标记，注明种类和日期。6）封口。培养基分装好后，应立即封口，以防止污染。表3-1 MS培养基母液配制表母液名称化合物名称配方含量mg/L贮备液倍数母液称取量/mg母液体积移取量/ml大量元素硝酸铵1650.0020倍33000.001000ml50硝酸钾1900.0038000.002水氯化钙440.008800.007水硫酸镁370.007400.00磷酸二氢钾170.003400.00微量元素碘化钾0.83200 166.001000ml5硼酸6.21240.00四水硫酸锰22.34460.00七水硫酸锌8.61720.00五水钼酸钠0.2

36、550.00五水硫酸铜0.0255.00六水氯化钴0.0255.00铁盐七水硫酸铁28.72005560.001000ml5EDTA+2水37.37460.00维生素和氨基酸肌醇100.0020020000.01000ml5烟酸0.5100.0甘氨酸2.00400.0盐酸吡哆醇0.5100.0盐酸硫胺素0.120.03.3 灭菌技术灭菌操作是植物组织培养的关键技术，因为培养基含有丰富的营养物质，不仅适宜植物的生长发育，更适合微生物的生长。一旦微生物接触到培养基，就会迅速生长和繁殖，不仅大量消耗营养成分，其繁殖过程中还会形成有毒有害物质直接危害植物组织，甚至直接利用和消耗植物组织，导致组织坏死直

37、至失去培养价值，因此培养环境的灭菌和培养过程的无菌操作是至关重要的。3.3.1 环境灭菌为确保组织培养环境的无菌应对环境进行定期或不定期灭菌。环境灭菌的目的主要是消灭环境中微生物或减少微生物基数，防止污染，一般采用物理或化学方法。物理方法：空气过滤和紫外线照射。化学方法：利用70%-75%的酒精或0.1%新洁尔灭进行喷洒，如果污染严重，可对环境进行熏蒸灭菌，用福尔马林或福尔马林配好高锰酸钾进行熏蒸，密闭24小时后开窗。3.3.2 培养基灭菌因培养基原料和盛装容器均带细菌，而且在分装和封口过程中也会引起污染。因此，分装封口后的培养基一定要立即灭菌，一般采用高温湿热灭菌法。高温蒸汽灭菌的操作程序：

38、将分装好的培养基放入高压灭菌锅的消毒桶内，添加适量水，盖好灭菌锅盖。对角拧紧螺丝，检查排气阀，如无故障，打开排气阀。打开电源加热，温度达100时，关闭排气阀，至温度升高至121，压力为0.105MPa时，保持此压力15-20min进行灭菌。然后切断电源，使其冷却，等压力降至0时，打开排气阀放气，至冷却后取出培养基。使用高压蒸汽灭菌锅的注意事项：灭菌过程中应该注意：锅内应添加足量的水，以免造成空烧或烧干。装锅时培养容器不要过度倾斜，以免培养基粘到瓶口或流出。锅内培养基不可装得过满，应保留一定的空间，以利于热蒸汽的上下回流，达到灭菌效果。增压前高压锅内的冷空气必须排尽，否则虽然压力能够达到要求，但

39、温度达不到相应压力下所对应的温度，而且锅内升温不均匀，影响灭菌效果，除前述讲到的排除冷空气方法外，也可采应用先打开排气阀，待锅内水沸腾，有大量热的水蒸气排出后，再关闭排气阀来进行。在高压蒸汽灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵守灭菌时间，压力过高或时间过长会使培养基中的一些化学成分被破坏分解，影响培养基的有效成分，同时也易使培养基pH值发生较大幅度的变化；压力下低或时间过短则达不到灭菌效果。不同体积的培养基对灭菌时间的要求可参照其下图表。排气降压时应缓慢进行，否则会引起锅内培养基因减压沸腾，导致溢出。只有待高压锅压力表指针恢复到零后，才能开启压力锅，以免产生危险。高压锅在工作过程中，应有专人

40、看守，如发现异常情况，应及时采取措施，以 免发生安全事故。） 为使培养基灭菌更加安全可靠，可采用操作方便的智能型蒸汽灭菌锅，只需按要求设定所需灭菌的时间和温度，就能自动完成整个灭菌程序。除了培养基外，外植体消毒处理所需的无菌水、玻璃器皿和接种器械也可采用高压蒸汽灭菌，但灭绝时间比培养基稍长些。3.4 外植体的选择与消毒3.4.1 外植体的选择3.4.1.1 外植体的概念在植物组织培养中，用来进行培养的植物材料称外植体（explant）。一般指初次接种，即在初代培养中用来接种的植物材料，包括各种植物器官、组织和细胞。将外植体经过处理后接种到培养基上是植物组织培养的第一步，这一环节被称初代培养。3

41、.4.1.2 外植体的选择 外植体的选择是进行组织培养建立无菌体系以及植株再生关键一步。尽管所有的植物细胞都具有全能性，即重新形成植株的能力，也就是植物的任何器官在理论上都可以用作外植体。但不是任何细胞都能表现出来，所以，接种时要选择那些在培养时易起反应，容易进行再分化产生植株的部位作实验材料。 实际上，在同一植物的各个不同部位的组织，器官中，其形态发生的能力，可因植物的年龄、季节及生理状态而有很大不同。这会影响到繁殖效果以及成本。因此，在决定选用一个合适的培养材料时应考虑到：1）植物的种类及品种的选择：应考虑选择具有良好表型的植物，如抗逆性强、产量高、产品质量高等植株，为育种选择的外植体应选

42、择表型最优的材料。理论上任何一种植物都能进行组织培养，实际上物种间、品种间或类型间差异很大。一般的选易于离体培养的种类、品种或类型；选生产上或研究意义比较大的种类、品种或类型。2）外植体的增殖能力：外植体必须有良好的增殖能力，并且应在培养基中继续筛选增殖能力最强的材料，同时需要考虑通过试验筛选繁殖不同基因型植物所需要的特殊培养基。3）外植体的大小选择：培养效果是一个外植体细胞总体对各种培养因子的综合反应，因此外植体的表面积、体积、细胞数量等都会影响培养效果。一般选择的外棋体大小可以在0.51cm。外植体太大容易污染，过小不容易启动或启动后仅仅产生愈伤组织或容易褐化死亡。在以植物脱素为培养目的时

43、，应选用较小的外植体，一般在0.20.5cm。如果选择的外植体过大，则达不到脱素的目的。对于茎尖、胚、胚乳等培养，则以器官或组织为单位切离即可。4）取外植体的季节和时间：选取外植体的季节和时间，对培养材料的启动和培养至关重要。特别是进行离体培养快速繁殖时，显得尤为突出。一般处于生长季，较幼嫩的外植体培养容易。春夏季取材灭菌容易，秋冬季取材难以存活，雨季湿热季节取材不容易成功。3.4.2 外植体灭菌作为植物组织培养中的外植体材料有叶、茎、器官、吸芽等，灭菌过程要求既能有效的杀死微生物，又不损失植物组织。操作步骤如下：1）将采来的植物材料去除不需要的部分。2）将外植体置于流水下冲洗数小时，必要时需

44、在洗衣粉溶液中浸泡清洗。3）将清洗后的外植体用无菌水冲洗数次，置于70%的酒精中浸泡15-30秒。4）将浸泡过的外植体置于升汞（次氯酸钠、漂白粉）中浸泡5-10分钟，然后用无菌水清洗干净，以防止消毒剂对外植体的伤害。药用及花卉植物外植体常用消毒剂及效果，见表3-2.表3-2 药用植物外植体常用消毒剂及效果消毒剂使用浓度%消毒时间min去除难易效果 升汞0.1-0.25-8易最好次氯酸钠2-55-30易很好漂白粉9-105-30较难很好过氧化氢10-125-15中好硝酸银15-30中好抗生素4-50mg/L30-60中较好3.4.3 外植体的接种外植体的接种是把经过表面消毒后的植物材料切割或分离

45、出器官、组织、细胞，转移到培养基上的过程。整个接种均需在无菌条件下进行操作，一切用具、材料、培养基、接种环境等都要无菌。3.4.3.1接种前准备接种前30min应对接种室和超净工作台消毒，操作人员也应洗手，消毒并穿上工作服。组织培养中污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子，因此每次接种前均应进行地面清洁和环境消素，用70酒精喷雾使空气中的细菌和真菌孢子，随灰尘的降落而沉降，并用紫外线灯照射20min。接种前超净工作台面要用新洁尔灭或70的酒精擦拭。培养皿、酒精灯和其它工具也应预先放在超净工作台上，一起用紫外灯照射。由于工作人员的头发、衣服、手指都不同程度地带有杂菌，因此在接种时要穿上工作服，戴

46、上帽子，也必须修剪指甲，并用肥皂洗手，最好在新洁尔灭溶液中浸泡10min，接种操作前则用70酒精擦拭。工作人员呼吸也会产生污染，特别是在接种时谈话或咳嗽更易引起污染，因此，在操作时应禁止谈话并应戴上口罩。3.4.3.2外植体接种切取外植体材料时，较大的材料用肉眼观察即可操作分离，较小的材料需要在双筒实体显微镜下放大操作。分离工具一定要预先放好，工具要锋利，切割动作要稳且快，防止挤压，以免材料受损伤而导致培养失败。材料的分割应在无菌培养皿中进行，为避免接种时发生交叉污染，通常在无菌滤纸上切取材料。刀和镊子、剪刀等接种工具在每次使用之前，均应在酒精灯火焰上反复灼烧，但应放凉后再接种，以防烫伤外植体。也可先放入70酒精中浸泡，再在酒精灯火焰上灼烧。外植体接种的具体操作如下：左手持培养容器（三角瓶、试管、果酱瓶等），右手轻轻取下封口纸或拧开瓶盖，将容器口靠近酒精灯火焰，瓶口略倾斜，以防空气中微生物落入瓶中造成污染，将容器口外部在火焰上灼烧数秒，以将灰尘杂质等固定在瓶口处。用灭过菌的镊子夹取切割好的外植体送入容器中并置于培养基上，这一过程要轻缓，并避免外植体材料碰到容器口和容器壁。外植体在培养容器内要分布均匀，一方面保证培养基养分供应均匀，同时也保证出芽后小植株不会相互