检测冷却诱导的膜变化对公猪精子获能的影响.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流检测冷却诱导的膜变化对公猪精子获能的影响.精品文档.检测冷却诱导的膜变化对公猪精子获能的影响摘要：需要对精子功能用快速、灵敏的方法进行评估。由于精子是由不能够受精的卵母细胞经历了一系列复杂的生理变化才获能的，评估精子在体外的受精条件下的功能是合乎逻辑的，在这项研究中，精子在体外条件的能力，是由离子载体和由存储在公猪精液的细胞内钙离子的浓度的变动来进行调控的。在32和20稀释公猪精液存储在16和10下24和72小时， 钙离子载体引起的变化和增加细胞内钙离子的含量在条件下孵化过程中作为时间的函数用流式细胞仪检测和记录的精子的运动能力。所有的反应参

2、数（膜有缺陷的精子顶体反应的精子，细胞与细胞内钙水平高的比例增加）被证明是发生在低储藏温度下敏感微妙的生理变化。精液储存在10下精子具有高的钙含量初始水平较高的，但细胞内钙的积累是低于精液存储在16下 。膜的完整性和和增加的比例高顶体反应细胞精液储存在10下 在20C稀释对细胞膜的完整性和反应性没有影响，精液存储在24h和72h的条件下对膜的完整性，顶体反应及细胞内钙能后处理没有明显的差异。然而，在一定程度的细胞凋亡和顶体反应显示储存72h后精子的运动能力加速，特别是当精液储存在10下 可以得出结论，精子膜反应性和动力学参数的同时使用是一个敏感的工具，用于公猪精液检测与存储相关的膜变化。关键词

3、精子、 存储、 获能、反应 、顶体反应、钙离子内流、动力学1、简介 射精后，精子经过一系列复杂的生理变化统称为获能，这使他们能够相互作用和融合卵母细胞1 。在体外获能处理的前两个小时，大量的钙离子内流发生在公猪精子发生中的外源凝集素结合能力的变化和诱导刺激顶体反应2 - 5。通过施加不同的生理和非生理性刺激可以诱导在精子顶体反应1 。尽管响应于透明带或透明带蛋白似乎是最像生理诱发和非常有效的公猪精子6 -7 ，钙离子载体A23187也可被用于在其他物种中的精子评价8-11。 由于射出的精子直到完成获能才具备与卵母细胞结合的能力，可以合理地推断精子功能的评估必须在运动状态下充分的评估精子的功能1

4、2 。由于个别男性的敏感性，诱导获能的精子参数的变化，在过去的几年中成为一种广泛使用的来确定精子的功能的诊断工具。然而，关键的记录膜的变化的影响必须进行批判性评估。在女性体内精子存储在输卵管尾部区域13 仅在有限的时间可以生存。显然，和获能抑制与上皮细胞的相互作用过程中无产能精子可以选择性绑到输卵管，在许多研究中已被证明在各种精子输卵管系统14 -17 。此外，这似乎有可能完成从输卵管释放后获能发生18-19 。精子获能一直被视为一个涉及一系列积极的,不稳定的事件随后膜变性的过程。在一定的时间段，精子获能后能够高速的蠕动，并进行透明带诱导的顶体反应。在精子大量产生直至排卵维护膜的完整性的必要水

5、平的，精子在很短的时间内发生的不稳定和体外获能过程可能是不连续的。另一方面，获能要完成出现在壶腹排卵后不久的峡部交界处的流体成分的协同作用18-21 ，并且卵母细胞的寿命是有限的，因此，在体外进行的获能变化的能力非常低可能也无法反应体内获能的情况。因此，估计精子反应能力的条件和动力学的检测精子功能的变化是一个有用的工具。 然而，除了这样的方法和个别的影响对获能诱导变化的灵敏度，其实用性取决于它的存储引起的条件变化的敏感性。另一个要考虑的因素是采用存储在质膜中引起的变化的参数的灵敏度。对于实验的实用性，最好是使用存储24和72 h之间，而不是在同一天收集和使用新鲜精液的稀释液。然而，冷却至低温（

6、5C），甚至是中度（15C）的温度诱导获能样的变化22-23 ，而这种现象可能会导致加速影响到随后的一系列获能反应。如果精子膜被保持在一个影响获能条件状态和细胞中，则该维护的期间内使用的精子样品没有明显的限制。 在人工授精，公猪精液的稀释和存储过程对精子是一个额外的冲击。公猪精子是由对温度非常敏感的脂质组成的质膜24-25 ，选择合适的温度稀释和存储可能是非常重要的。公猪精液稀释的存储通常在15至17C。然而，提供稀释的样品，特别是在冬天是受温度变化影响的。这种变化的关键作用只有少数的研究对其进行了评估26 。因此，本研究公猪的精子在储存过程中的功能状态的影响，稀释温度，储存温度，储存时间延长

7、72小时的响应参数与体外获能（钙离子内流和顶体反应）。2、材料和方法2.1、试剂及方法 除另有说明外，试剂由Merck AG, Darmstadt, Germany;Alexis GmbH, Grunberg, Germany; and Sigma AG (SigmaAldrich), Steinheim, Germany.等公司购买。 使用碳酸氢盐的Tyrode平衡盐溶液（pH值7.4，300mOsm/kg）体系，由96mM的NaCl，3.1 mM的KCl，5mM葡萄糖，0.4 mM的用MgSO 4，15mM的NaHCO 3，2mM的CaCl 2，0.3mM的的NaH2 PO 4，1mM丙酮

8、酸钠，21.6 mM的乳酸钠，3mg/ml BSA，20mM的Hepes，pH值7.6（台氏培养基; Harrison等人2 ），在39，在5CO 2中（孵化器）在实验中记录钙离子内流精子获能,在实验中顶体反应用钙离子载体诱导，在培养基中添加用5mM的CaCl 2和1mg/ml PVA和PVP代替BSA。2.2、精液来源 一共有六份精液从生育能力极强的杂交动物研究获得。这些样品（一般为每周两次）用“戴手套的手”的方法通过无菌纱布（通过清除凝胶）采集。精液采集后立即转移到实验室，预先稀释比为1:1，在32和填充剂，以及最终在BTS扩展稀释后储存在32或20的浓度为310 7个 cells ml和

9、储存在10或16C24至72小时。2.3、精液的实验处理和常规参数估计从母体射精后不久收集和保存的样本的精液检查精子形态和运动后不久，Petrunkina等人28对其进行了评估。洗涤稀释精液的等分试样（在3和5毫升），通过两个步骤的梯度为35和70的等渗密度生理盐水2。除去上清液层后，松散的精子沉淀物再悬浮在剩余70的生理盐水中至最终浓度为约110 8 cells/ ml。洗涤后，精液样本被在最低温度为20下保存。处理过的样品用洗涤1小时范围内的进行实验研究。2.4、实验方案具体细节每个实验系列的流式细胞仪中的相关章节给出。通用的方案是，如下所示（参见图1）：图、1 图试验（见第2节）。洗过的

10、精子悬液，共32个等分，根据稀释温度，储存温度和存储时间对应的4倍和8个不同的稀释温度。这些等分试样培养在完整的碳酸氢盐的Tyrode介质中2含有碘化丙啶（2.5微克/毫升）。最终精子细胞浓度为0.8-110 ml-1。60，120，和180分钟的温育后，钙离子载体A23187（1M）培养的开始时和之后被添加到八个精子样品中，这些样品进一步温育15分钟。加入FITC标记的PNA（3微克/毫升）的精子悬浮液5分钟，然后加入钙离子载体。在每个采样点，子样本分别取自8个孵化精子悬液以不同的方式处理，并用流式细胞仪检测。荧光FITC-PNA和碘化丙锭的荧光（FL-3，红色荧光，和FL-1，绿色荧光，见

11、下文）的精子顶体反应和膜的完整性方面对膜的状态进行了评价。 为检测细胞内钙含量高的人群，生理盐水洗过的精子，结果装有fluo3-AM（1毫摩尔），用HBS稀释，并用蔗糖洗涤介质2以从培养基中除去游离的染料。洗过的精子的等分试样中的完整的碳酸氢盐的Tyrode介质含有碘化丙啶（PI）（每个时间点的八个平行孵育）孵育。子样本，从培养细胞悬浮液后20，60，和120分钟，并用流式细胞仪检测。荧光荧光和碘化丙啶荧光检测FL-1（绿色荧光）和FL-3通道（红色荧光）的状态的精子膜中的钙离子内流和细胞膜的完整性进行了评价。2.5、流式细胞仪的测量适当的处理和孵育后，精子悬浮液由FloMax软件所控制的DA

12、KO银河流式细胞仪(DakoCytomationGmbH,Hamburg,Germany)上分析。细胞以约600-1000cells/ s的速度通过仪器，收集10,000个细胞数据，使用氩激光细胞激发波长为488 nm。在对数刻度尺上PNA-FITC或型Fluo-3的荧光使用520-nm的带通滤波器（FL-1）进行检测，PI荧光使用610nm通滤波器（FL-3）检测。如前所述对机器的设置和调整进行控制，测量精子顶体反应的水平44。在公猪精子的钙离子内流的研究中，进行额外的测量进行了调整精子用钙离子载体的培养基中含有的CaCl 2（2mM），并且没有碘化丙啶补偿，设置/电压进行了调整，本质是由H

13、arrison等人所描述的2。这些设置保持各组内分析在任何给定的一天 。 2.6、数据监测和分析钙内流和顶体反应相关的数据进行计算作为活细胞群内反应的细胞的百分比（精子顶体反应或与细胞内钙离子水平）。从这个独特的低反应的百分比价值，可运动的细胞可能反应活性高。动力学模型的所有参数对应于具体的治疗和具体的采样点的获能治疗过程中动态监测。简要地说，这种监测方法的优点是，为每个精液的处理和存储有关的8个处理，整个过程中的变化由下式给出一个单一的数学方程（回归）。可以直接进行比较，以评估膜特性的动态（即，以确定和分析的变化率，由分化的模型相关的不同的治疗方法（假设高水平的拟合优度）的近似函数的参数函数

14、）。这种方法的进一步讨论，请参见16 。以下动能描述的最佳时间比较相对增加，每个特定的膜参数可以选择，并且对这个时间点有关的数据进行多因素方差分析。在这种方式中明显的时间依赖关系被考虑进去，并且整个过程可以直接进行比较。使用Excel软件和SAS统计软件包（第7版，SAS Inst. Inc., Cary, NC, USA).对数据进行分析。为了描述动力学能过程处理的荧光信号的变化强弱，进行了线性和非线性模拟和相应的模型函数的参数的比较（线性和非线性的REG）。使用重复测量方差分析（GLM程序）诸如时间的存储，温度的稀释剂，和存储的温度等影响因素。除非另有说明，否则数据显示为平均值SEM 如果

15、计算出的概率出现这种偶然的几率是小于5（p 0.05），我们认为差异是显着。3、结果3.1、常规精液参数 相对于传统的精子学参数，观察到一些明显的差异。（图2）。两个效果的研究（温度的稀释和存储时间）并无对精子运动能力产生影响，然而，样品中的运动性表现为存储在16下高于样品储存于10（p 0.05）。样品储存在16C正常的顶体的百分比高，（p 0.05）。然而贮存72小时后无论稀释温度是多少膜缺陷的精液中精子的比例为存储在10下是显着高于在样品储存在16下（图3）。存储在10下的精子样品比存储在16下的精子样品高钙细胞数量多(p 0.05, 图. 3b)。在开始孵育时活细胞对顶体反应没有显著影

16、响（图. 3c)。3.3、公猪精子数的动力学特性的膜参数动态 膜缺陷的细胞，细胞钙的含量升高，顶体反应的细胞的比例升高是随时间变化而变化的（p 0.05）。所有的治疗精液中存储为24和72小时进行获能条件的时间变化观察。所有的模型功能在附录A（表A.1）。由与细胞内钙的增加，并通过膜的完整性的丧失反射膜参数的变化在图中显示出。图4 a和b为在常规的方式处理的精液样本（在32和16下）为两个存储周期（24和72小时）。被观察到的整个培养周期（在24小时精液率：直径 = 0.20和0.08的样品储存于10和16下；在72小时精液：直径 = 0.25和0.14，样品在10和16下保存）。有细胞死亡的

17、样品在不同温度下的稀释率没有显着的差异。回归函数显示在24和72 h后，随着时间的推移行为是非常相似的，虽然在72小时的精液变化率略有上升（ = 0.14，而 = 0.08，在24小时精液，请参阅附录A）。然而，PI阳性细胞的绝对值在时间周期分析的差异由于精液的年龄引起几乎可以忽略不计的。培养120分钟后观察到精液样本中的死细胞的比例显着增加（存储24小时的精液样本175.2和在72小时的精液样本19.43.0，用传统的的方式处理和存储）。 一般情况下，钙离子内流的动态可以近似于精液样本存储24和72 h的指数函数（总细胞数和活细胞钙离子内流的动力学模型，在附录A，表A.1 ）。含钙量高的细胞

18、内的活细胞数的比例的变化如图所示图中.5在所有治疗24小时的精液虽然最初的百分比升高，细胞的钙含量增加，样品储存在10C以下的钙离子浓度增加，进展率较高的样品储存在16C（孵化后的第一个30分钟的;请参阅附录A，表A.1）。动力学参数无显着差异，观察到存储时间或稀释温度。仅60分钟后，更高的钙离子浓度的活细胞数朝向移位并保持在高电平（PI = 9.33.8和6.23.4的常规处理的样品，分别存储在24小时和72小时）观察到膜的完整性。参与顶体反应的精子总和活精子数的在处理后钙离子载体A23187随时间变化的（完整的动力学模型，在附录A，表A.1 所示）。图.6 a和b显示出钙离子载体获得反应能

19、力相关的变化，在32稀释的样品并存储在16和在20下，并强调由存储在20稀释的样品中总精子数存储在10C 24和72 h后的存储空间。温育60分钟后达到的顶体反应的细胞的比例的渐近饱和。（24小时精液的行为，在所有的处理中是相似的）。在样品储存72小时后，再经过120分钟的潜伏期用FITC-PNA荧光检测精子顶体反应的细胞的比例略有明显下降。 存储24小时后，活精子参与顶体反应的的比例增加内的动力学图6如图所示。随着时间的推移精液存储在24和72小时（表示对数字符的变化）有类似的行为。精液存储72小时后通过模型函数的一阶导数的变化显示出稍高的变化率。然而作为一个额外的负成分，在这些模型中，不同

20、天的绝对水平动力学参数的比较表明存储在10中的精液变化的动态相对于第二个一半的潜伏期存储在16中的精液高。在32下稀释后存储24和72h置于10存储顶体膜的完整性丧失的能力最高(10下r = 17/t-0.27；16下r = 4.5/t ; 见附录A, 表A.1)。3.4、吸受钙离子载体诱导的顶体反应及钙离子内流稀释公猪精子膜的完整性对冷却膜的完整性的敏感性 基于上面的结果，选择60分钟的孵育时间的测定反应活性。它被定义为在培养的开始和60分钟之间的相应的特性的增加。没有变更该时间之前钙离子内流在稍后的时间点检测到，因此不太适合于微妙的变化的检测以及存储精液响应于获能应力由于在总数中的膜缺陷的

21、细胞水平的提高，活的和死的应答细胞中的分布和变化的外顶体膜的可能损失等。 图7显示出的响应相对于膜的完整性的丧失（即PI阳性细胞的比例增加），在120分钟之内的精子的精液储存24和72 h。对增加的PI阳性精子的能力在存储和稀释温度上是一个显着的效果，此条件下孵育120分钟（p 0.004，p 0.05）。在低温下的存储导致膜缺陷的细胞显着增加的量与精液年龄无关。同样稀释液用温水（32C）稀释剂产生小量影响但负面影响细胞膜的完整性（图7）。在60分钟时只有贮存温度影响生存能力（附录A，表A.2），这表明膜的完整性的丧失表示的是随时间变化较不敏感的参数。图8显示出了相对于60分钟内精子顶体反应的

22、细胞内膜完整的精子数量存储24和72 h的膜-完整的精子数的响应。完整细胞中顶体反应的的增加的比例为样品保存在10（p 0.05，贮存温度的影响）。虽然在32下储存72小时后再在10下稀释有更多的顶体反应的细胞，在20下储存24小时（图8），相互作用不显着既不影响稀释温度和储存时间及内部因素（表A.2）。4、讨论精子对液体保藏和不同温度下的响应一个关键因素精子生存。事实上,野猪的精子的脂质成分大大不同于其他物种，它似乎是负责提高它们对于冷却和冷冻保存灵敏度。雌性动物的生存的需要可能需要较慢的精子的反应比那些被认为是最优的体外的受精。因此,由冷却诱导变化的敏感的检测在早期精子稀释和存储精液获能的

23、行为响应能力参数的精液重要功能评价的的方法之一。精子对于承受精子顶体获能治疗反应后和细胞内的钙内含物变化的能力内容最近被公认为在许多物种中精子功能主要参数（即种马、牛、野猪）；这些参数使区分定量膜扰动动力学成为可能。因此，这项研究主要是评估精子在被稀释和贮存在不同的温度条件下（分别为32和20 ,和16和10）获能反应能力。然而，野猪精子保存和储存在这些条件下的后精子获能治疗能力还不甚了解。然而，合理的时间对于反应的评估必须满足以下条件：（1）基本的维护膜完整性；（2）精确的动力学参数检测能力（3）在饱和条件下出现的或在这个反应时间条件下的下降。通过评价在精子顶体反应动力学和膜完整性，我们断定

24、在饱和度水平下的A23187-诱导的顶体反应(AR)是在其 60分钟之后发生的，在离子载体处理和非处理的悬浮液中膜的完整性损失进展迅速，在PI-positive细胞中120 min中达到40%的损失。在存储72 h的样本中， 百分比出现下降的开始在120-180min后可以被检测到。花生血凝素荧光标记，绑定到顶体的外部膜上用于评估精子响应能力研究，所以荧光标记可以用作探针来监控野猪的顶体反应。然而，它必须考虑到在长期潜伏条件导致失去戍糖核酸绑定点使得损失OAM（一个效果观察在体外孵化，载体和显微注射）。这种损失已经被报道了，发生在野猪的精子形成的钙离子载体后的60和120分钟。长期的贮存，特别

25、是在精液应力不足条件下保存，可能缩短这个时间。在胞质钙的增加在60分钟后达到了一半的水平。因此，在野猪的精子存储中这个时间点上被选为评价最敏感膜动力学的反应。然而，数据显示时间到120分钟时也可能是可以接受的，尤其是对评估贮存在传统的条件下的新鲜或24 h贮存后的老精液储。储存温度对膜的完整性有一个很大的效应的，它显示出，即使是适量冷却也大大减少精子的的功能。精子储存在10 下细胞死亡率升高,即细胞的恶化的加快。储存在10 条件下精子顶体反应的数量比例在贮存过程中增加钙离子载体的条件下很快的增加。它已在对狗的精子的研究中证明,对于离子载体的诱导后响应发生变化，在一定的条件下的贮存过程中可能是一

26、个精子功能和细胞质贮存的很好参数。同样的，它也在人类精子中也被证明，对精子量正常，严重少精症，畸形精子症等不同的男性来说顶体反应的参数是不同的，这表明顶体反应动力学参数作为一个精子功能的参数的潜在价值,。在最近的一项研究中,我们证实了了那个没有生育能力可能被认为与非常低的或非常高反应性对于离子载体和和较低的钙含量有关（数据没有公布）。 最近的工作对野猪的膜变化引发了争论，在温度低于5 摄氏度时的冷却有相似之处。冷却的效果可能会因此诱导过早精子获能和膜扰动。冷却的野猪精子的顶体反应的增加可能因此被解释为像获能反应一样扰乱的一个特性。然而，一个孤立的单一顶体反应测试的诊断的价值可能是不足对于评估膜

27、治疗诱导，由于其多变的或是很少的对于生育的关系，比如说牛和人类精子。这种变化监测的分析通过增加具有比例高的钙离子含量的精子，而增加的钙含量高的精子被证实对于适度冷却是不利的。精子储存在低温度下相对于增加细胞质中的钙胞质钙离子含量显示只有减少的有活力的精子的响应，但比初始水平下的高钙含量的反应升高。这些结果是与Bailey 和Buhr发现的结果是一致的，他们报道说，激冷野猪精子产生立即增加细胞内的精子，而细胞内积累的钙的低得多比在控制中的精子。这项研究的结果显示,即使是一个10 的适度冷却的精子相对于对离子载体和在细胞内钙离子浓度条件导致加速了精子获能的行为。然而，它是可能的其他获能诱导条件的改

28、变，如脂双层流动性的变化和细胞内信号传导路径的改变没有完全反映，通过在冷却过程或冷冻保存过程改变检测到相应的特征。因此，想这些动力参数的增加，不能简单地解释为一个真实的获能过程。然而，这样的行为会很大程度的缓解精子的营养潜力,因为它的功能与精子的获能能力是相似的。因此，这将有利于检测精子获能敏感反应条件的稀释和存储后为了消除精液样本发生极其迅速或非常缓慢的反应。 最终稀释后的精子样本在室温下进行常规预稀释，在20的扩展剂显然没有引起膜的任何负面变化。这一发现将有可能改善和简化处理液体常规处理过程提供保证。相反，最终在32稀释增加了早期膜变动引起膜内部钙离子变化和膜完整性变化。事实上，在较高温度

29、下长时间暴露在生理环境条件下，激活了支持代谢的途径，导致精液质量的下降。与实践相关的另一个方面是在存储在16下24小时和72小时，如图8所示，用来说明精子存储温度德尔范围广。Conejo-Nava等人报道了类似的结果。用金霉素评估精子的顶体反应，发现精子过早获能和顶体反应增重是在存储后4天才发生的。本研究结果表明，如果精液被冷却到10，在存储过成功中对精子膜的负影响似乎更显著。这些观察结果支持了该论点，一个关键因素是冷却诱导相关的保护膜发生变化，并不是与存储24小时和72小时相关。应当指出的是，虽然在潜伏期我们没有观察到显著的差异，经过方差分析确认，这并不是意味着24小时和72小时存储的精液质

30、量完全等效。精液储存72小时表现出惊人的动力学参数，加速不稳定运动的倾向，潜伏较长的时间间隔可能不适合研究储存不同时间的精液样本。 总之,这里的参数评估-膜对于离子载体和钙在活细胞人群涌入的变化响应尤其是-代表一个高度敏感参数集确定精子功能状态对于决定精子保存方法是重要的。甚至适度冷却程序考虑精子原生质膜的改变和在反应资格条件, 这可能导致生育能力下降。同时，轻微的温度效果仅是借鉴, 表明最后稀释可以执行房间温度。储存24和72 h精液的功能状态仍然可比的上对细胞内钙离子含量和应对离子载体. 证明动态特性比绝对价值的分析提供了一个更加敏感的描述, 表明利用动力学模型或精子在膜状态的微妙的变化相对反应的优势。