5 第四章 动物生物技术及其应用47.ppt

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1、1,第四章 生物技术在动物生产中的应用,华南农业大学动物科学学院动物生产与管理系王军 ,第二部分 动物科学中的生物学,目录,胚胎动物克隆动物转基因动物基因工程疫苗基因治疗,2,3,前言,生物技术是21世纪高新技术的支柱,生物技术产业是21世纪重要的支柱产业.现代生物技术由多学科的理论和技术综合而成，已广泛地外延到许多学科和产业,包括农林牧渔,医药卫生,食品,轻工,能源,环境等,促进了传统产业的改进和新兴产业的形成.根据操作对象和研究目的,衍生出许多分支学科.动物生物技术以动物为操作对象,旨在改良动物生产性能,为人类提供量多质优的动物产品,不断满足人们日益增长的需求.同时还与医药学相结合,开拓医

2、药生物技术新产业,为人类的疾病防治和健康长寿作出贡献.,刘德武专题,4,一胚胎动物,1890年,世界上首例胚胎移植成功.Heape将4细胞期的安哥拉兔早期胚胎移植到比利时兔输卵管内,移植成功.1982年,世界上第一头试管牛诞生. Brackett采用体外授精和胚胎体外发育技术获得.目前,胚胎工程已发展到卵子切割,嵌合体制作,核移植,转基因动物等定向控制改造和创造新性状,因为这些技术都是在胚胎发育过程中进行的,所以统称为胚胎工程（embryo technology）.,5,1 胚胎移植,1.1概念将一头母畜发情排卵并经交配后,从其生殖道中取出胚胎,移植到另一头母畜生殖道中.供体的胚胎在受体的子宫

3、内生长发育至产下后代.,6,1.2 目的发挥优良母畜繁殖潜力:让优良母畜更多的卵泡成熟排卵,通过借腹怀胎获得更多优良后代.提高家畜改良速度:母畜在繁殖周期内得到更多的仔畜.作为其他技术的基础:例如试管动物,克隆动物,转基因动物.长期冷冻保存:便于运输,可用于建立“胚胎库”.,7,1.3 胚胎移植的主要技术超数排卵:正常情况下,一个性周期只有一个或几个卵母细胞成熟排出.注射激素(孕酮)可使更多的卵泡相继生长成熟排出.充分利用母畜卵巢中大量的卵原细胞(母牛5万以上).同期发情:胚胎移植必须要供体与受体同步发情,进入相同的生殖周期.黄体有调节发情周期的功能,采用激素可使发情同步化.胚胎采集:经超排处

4、理的母畜发情后进行人工输精,受精卵发育成胚胎.用外科手术或非手术法采集.,8,胚胎移植将收集到胚胎移植到受体母畜的子宫内。,9,2试管动物,2.1 概念利用精子-卵子体外受精,胚胎体外培养和胚胎移植等技术所获得的动物.又称体外授精动物或试管动物.,10,2.2 试管动物技术环节精子采集与体外获能卵子回收及成熟培养卵子与精子体外受精受精卵体外发育试管胚胎移植,11,（1）精子采集与体外获能动物精液经上浮分离法处理,可以得到活力强的精子.应用改变精子培养条件和添加诱导精子获能的成分,可以使精子体外获能.（2）卵母细胞收集与体外成熟从屠宰家畜卵巢中采集,或使用阴道超声波监视等方法直接从卵巢中采集.卵

5、母细胞体外成熟,是模拟体内成熟的环境,使采集的未成熟卵母细胞具备受精和发育能力.,刘德武专题,12,（3）体外受精提供适宜精卵共培养的复合培养液.控制卵母细胞体外培养时间,减少多精受精的发生.采用辅助技术帮助精子进入卵细胞(显微注射单精子等).（4）受精卵体外培养胚胎细胞分化出内细胞团称滋胚层,滋胚层细胞固定在子宫壁上称着床.目前未能在体外模拟子宫环境供胚胎继续发育.在体外把受精卵培养至胚胞期并不容易,要克服早期胚胎存在的发育阻滞现象.,13,（5）胚胎移植最适宜移植的是发育至8细胞以上的胚胎，直接移植到子宫角前端。,14,二克隆动物,Clone:指遗传上完全相同的分子细胞或来自同一祖先的无性

6、生殖生物群体.克隆由名词(指无性繁殖体)外延为动词(如把某物克隆)或形容词(如克隆羊).理论上,任何一个细胞都含有该生物体的全部基因,都可以被克隆.植物细胞全能性已全部实现,动物细胞全能性尚在探索.,中国医生成功将克隆猪肝脏移植藏猕猴体内,15,1 细胞的拆分与重组,1.1细胞的拆分细胞核分为核与质两部分,诱导核质分离用细胞松驰素.去核后的细胞称为胞质体,分离出来的核称为核体.1.2细胞重组胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种.胞质体与核体重新组合形成重组细胞.,16,2细胞核移植,胞质体与核体重组:将某一个细胞核移植到另一个去核的细胞中,通过无性生殖方法产生新个体.早期的细胞核移植多以鱼类和两栖

7、类为材料.卵数量较多,体积较大,容易获得,便于操作.1989年童第周将鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼的去核末受精卵中,成功无性繁殖出“鲤鲫核鱼”新品种.哺乳动物最早用的是小鼠.1981年,瑞士和美国科学家首次对小鼠进行核移植获得成功.,17,3克隆动物的方法,3.1 胚胎分割法采用显微手术将未着床的胚胎分割成2、4、6等多等分,给每个受体植入一块分割物而妊娠产仔.一个胚胎可以克隆出多个遗传上完全一样的个体.二等分胚已克隆出小鼠,兔,山羊,绵羊,猪,马,羊等.严格定义上胚胎分割不是真正的克隆,只能算是“细胞的复制”.,刘德武专题,18,3.2胚胎细胞核移植法将未着床的早期胚胎分散成单个细胞,在电流作用下

8、与去核的卵母细胞融合,发育成胚胎后移入受体.3.3 胎儿成纤维细胞核移植法从妊娠早期胎儿分离出胎儿成纤维细胞,采用细胞核移植方法克隆出胚胎移植给受体后妊娠产仔.3.4 胚胎干细胞核移植法从早期胚胎内细胞团分离出的,能在体外培养的高度未分化的多能细胞.每个细胞都是有发育成个体的能力.理论上,胚胎干细胞核移植可以产出更多克隆动物.,19,3.5 体细胞核移植法19970227nature报道罗斯林研究所和PPL制药公司合作,用体细胞核移植法克隆了一只雌性小绵羊-多利.核供体是高度分化的体细胞-乳腺上皮细胞,独到之处在于没经过受精而得到受精卵的过程.有史以来第一次通过成熟细胞的核移植生产出的动物.人

9、类胚胎克隆成功:20011125美国宣布人类胚胎克隆成功.先从人卵细胞中取出DNA,再将体细胞的遗传物质植入空卵壳,卵细胞开始发育到胚胎状态.目的是为了获得能够治疗一系列人类疾病的材料和方法.,20,4 体细胞克隆成功的意义,哺乳动物分化细胞的全能性在一定条件下可逆已完全分化的动物体细胞仍然保持全部遗传信息,经技术处理后,体细胞能恢复失去的全能性形成完整的个体.为动物转基因提供一条新途径先将目的基因导入供体细胞核,经检测后再与去核卵融合,由此产生的胚胎便携带有目的基因,由此产生的克隆动物就是转基因动物.生物技术发展史上一个划时代的里程碑理论意义和应用价值,将对生命科学研究和人类生活产生重大的影

10、响.,21,三转基因动物,将目的基因导入动物基因组中并得到表达而产生的动物称为转基因动物.1974年首次成功获得AV40DNA转基因小鼠;1980年获得带有胸苷激酶基因的转基因小鼠;1982年将大鼠GH基因导入小鼠受精卵雄原核获得比对照小鼠长速快2-4倍,体型大1倍的转基因硕鼠动物转基因技术打破动物的种间隔离，实现动物种间基因重组和遗传物质交流，为动物性状的改良和新性状的获得提供了新的途径.,22,1 转基因动物技术的主要步骤,获取外源目的基因外源目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞选择携带目的基因的细胞,选择体外培养系统和宿主动物转基因胚胎的发育及鉴定筛选所得的转基因动物,23,2转基因动物的技

11、术路线(了解),经典的技术路线 目的基因 显微注射已交配的 取出 移植 受体动物 妊娠供体动物 受精卵 输卵管 转基因动物 缺点：注入目的基因的命中率低，目的基因的整合率低，受精卵移植的受孕率低。,刘德武专题,24,核移植（克隆）的技术路线 目的基因 转基因动物 导入 动物胎儿成纤维细胞 妊娠 取核动物 去核 重组的 体外培养 囊胚期 胚胎移植 受体卵细胞 受精卵 胚胎 动物子宫特点:体细胞核移植,核移植前导入目的基因.,25,3目的基因的制备和转基因的方法,3.1 目的基因的制备目的基因的获得:逆转录合成法,化学合成法,PCR扩增法.目的基因的扩增:通过载体在宿主中克隆,通过PCR扩增目的基

12、因.3.2 转基因动物的方法显微注射法胚胎干细胞法 病毒载体法精子介导法,刘德武专题,26,4转基因动物的应用研究,4.1 改良动物经济性状通过转移单个基因改良动物经济性状.转基因动物的性状表现,以及生化代谢途径,基因互作,基因定位整合,基因定量表达,组织特异性表达等还需要深入研究.,27,4.2 乳腺生物反应器的研究1987年Gordon首次报道小鼠乳腺中表达tPA蛋白.现在利用转基因羊、牛生产出抗胰蛋白酶,乳铁蛋白,人凝血蛋白因子,蛋白质C等药用蛋白.预期10年后转基因动物生产的药物销售额超过250亿美元.基因药物生产:第一阶段是细菌基因工程,第二阶段是动物细胞基因工程,第三阶段是转基因动

13、物乳腺生物反应器.,刘德武专题,28,乳腺生物反应器乳腺是自我封闭系统,表达的蛋白不回流到体内,避免外源基因表达蛋白对动物本身的影响；乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器.一头奶牛一年可生产乳蛋白250-300Kg,一只绵羊或山羊一年可生产乳蛋白25-30Kg.如果有1%乳蛋白代换成医用蛋白,产量十分可观.乳腺分泌的基因产物产量高,易提纯,表达的蛋白经过充分的修饰加工,具有稳定的生物活性,接近天然产品.动物乳腺表达的外源基因可以遗传,可用常规技术繁殖生产群体.,29,5转基因动物研究存在的问题,转基因动物的低效性转入基因引起完整基因突变转入基因表达混乱病毒转基因对宿主的影响转基因动物模型与预期不符

14、乳腺反应器的完善转基因动物及产品的认可,可能吗？科幻！,30,四基因工程疫苗,注射或口服疫苗可以激活免疫系统,产生相应的抗病原体的抗体,是预防传染性疾病的有效手段之一.我国宋朝就有接种人痘预防天花的记载,明朝则已广泛种植痘苗.1796年英国医生Jenner发现牛痘可感染人,但症状较微,可获终身对天花的免疫能力.1980年,第3届世界卫生大会宣告全世界已消灭天花.这是人类利用疫苗战胜烈性传染病的壮举.根据病原体的不同可区分为病毒性疾病疫苗,细菌性疾病疫苗和寄生虫疾病疫苗.目前还在致力研究避孕疫苗.,31,1 疫苗制备技术的发展,32,1.1 第一代疫苗-传统疫苗利用病原体减毒弱化或灭活制备的疫苗

15、,19世纪中叶一直沿用至今.如百日咳杆菌疫苗,白喉杆菌疫苗,破伤风杆菌疫苗,结核杆菌疫苗(卡介苗)等.第一代疫苗对预防传染病的传播作出了巨大的贡献.缺点:存在安全隐患.生产过程大量繁殖的病原体对工作人员是严重威胁;使用中偶见因病毒或灭活不彻底而导致被免疫者感染的报道.,33,1.2第二代疫苗-基因工程疫苗将病原体的抗原(蛋白质)基因克隆在细胞或真核细胞内,利用细菌或细胞内抗原基因表达的产物作为抗原的疫苗.优点：利用抗原而不是利用病原体制备疫苗,安全性高；把同一病原体的不同抗原决定簇重组在一个基因中,以表达含不同抗原决定簇的多表位抗原,提高免疫效果;将不同病原体的抗原克隆于同一工程苗或工程细胞,

16、以表达不同病原体的抗原,制备成多价疫苗.,34,1.3 第三代疫苗-核酸疫苗 （DNA疫苗,基因疫苗）将含有编码蛋白质基因序列的质粒载体经肌肉注射或微弹轰击等方法进入人体内,通过宿主细胞表达系统表达抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,以达到预防和治疗疾病的目的.1990年首先报道了小鼠肌肉注射质粒DNA被细胞摄取,质粒中的基因可以表达,此后研究便迅速开展.兼有基因工程疫苗的安全性和减毒灭活疫苗激发机体强免疫反应的特点,免疫效果持久,制备简单,使用方便,前景广阔.,35,2乙型肝炎疫苗,2.1 乙型肝炎的严重性已发现甲,乙,丙,丁,戊5种肝炎病毒.尚未确定是否与肝炎有关的还有己,庚,辛

17、3种病毒.全世界肝炎病毒携带者5亿,以乙肝最多,达2亿人.乙肝病毒携带者可能转移为慢性肝炎,发生肝癌的比例是非携带者的50倍.我国是乙肝多发区.乙肝无特效药,HBV携带者也无理想的消除措施.乙肝疫苗可以阻断HBV传播和降低人群慢性携带率.,36,2.2 乙型肝炎疫苗血源性疫苗1982年首次在美国面市.从人携带者的血液中分离出病毒,经灭活后制成.受血液来源和技术限制,数量少,价格高,难推广.另外,由于是血源制品,安全无保障.有些国家已禁止使用,避免受艾滋病病毒传染.基因工程疫苗1981年成功克隆乙肝表面抗原(HBsAg)基因并获得大量表面抗原.1986年美国批准基因工程乙肝疫苗上市.方法:重组D

18、NA导入酵母菌,由酵母菌产生乙肝抗原而制成疫苗;重组DNA导入仓鼠细胞,由仓鼠细胞生产疫苗.我国采用酵母表达系统表达乙肝表面抗原制备疫苗,也建立了哺乳细胞的高效表达系统.,37,3核酸疫苗,丙型肝炎疫苗大部分丙型肝炎病人可发展为肝硬化和肝癌,无特效治疗药物和预防方法.丙型肝炎病毒基因型多,突变率高,至今未见疫苗上市.Tokushige采用丙肝病毒C区基因构建重组DNA,免疫小鼠检测到抗丙肝抗体.还可诱发产生细胞免疫反应.艾滋病病毒疫苗全称人类获得性免疫缺陷综合症,由人类免疫缺陷病毒HIV感染引起.美国新DNA疫苗公司宣称开发一种HIV的DNA疫苗,将HIV-1病毒的tat和vpr基因以及nef

19、和gp160基因部分序列克隆于质粒上.这种疫苗能激发人体从受感染的组织中清除病毒的攻击.,刘德武专题,38,流感病毒疫苗 极易发生变异,包膜蛋白的易变性使流感病毒能逃避中和抗体的作用,因而出现流感周期性大流行.将流感病毒高度保守的NP基因插入质粒,注射BALB/C小鼠肌肉,可诱发小鼠对流感病毒产生抗体免疫反应和细胞免疫反应.思考:你对禽流感的看法?,?,?,?,39,五基因治疗(gene therapy),人类遗传疾病有5000多种,基本上不可能用常规方法治疗.个别病例只能对症疗法,减轻症状,但不能治愈.基因治疗可能是唯一的方法.基因治疗是向靶细胞导入外源基因,以纠正或补偿基因的缺陷,达到治疗

20、遗传病的目的.1990年美国批准治疗腺苷脱氨酶(ADA)的临床治疗方案,2个病例症状有改善.1991年复旦大学与第二军医大学合作用基因疗法治疗血友病B的临床试验,患者症状有所改善.,刘德武专题,40,1基因治疗的类型,基因调控治疗从基因水平调控缺陷基因的表达,以达到改善症状的目的.镰型细胞贫血症是因珠蛋白的链基因突变,产生不正常的血红蛋白所致.用5-氮胞苷抑制甲基化酶,使因甲基化而关闭的基因重新开放,产生HbF以代替HbA.用抑制基因表达的反义RNA或能切割RNA的核酶(ribozyme),阻断基因的表达.在肿瘤的治疗上,可以在基因水平上抑制肿瘤细胞基因的恶性表达和引导肿瘤细胞逆转.,刘德武专

21、题,41,基因矫正治疗基因增补将正常基因导入患者体内,补偿缺陷基因的功能.基因替换以正常基因取代变异的基因.基因修复对异常基因进行原位的特异性修复.,42,2基因治疗的条件对导入的基因及其产物有详尽的了解;外源基因有效导入受体细胞、稳定整合、适量表达;不能使受治细胞基因组及表达调控受影响;导入基因方法安全,载体对靶细胞无害.3基因治疗的原则对象是病情严重、预后极差、别无他法的患者;转移的基因被克隆;无需高水平的表达和精确定量控制就有治疗效果;靶细胞获取或回输安全,转移基因的表达对细胞微环境无严格的特异性要求.,43,4基因疗法的步骤目的基因选择:根据基因治疗的类型选择相应的目的基因(增补、替换

22、、添加).基因载体构建:使目的基因在受体细胞内高效、可控、稳定地表达.受体细胞选择:容易分离获取,在体外增殖存活,大量扩增.如成纤维细胞、淋巴细胞、骨髓造血干细胞等.,44,5基因治疗的应用,治疗恶性肿瘤 将已导入IL2基因的TIL细胞回输给病人,启动自身免疫,治疗黑色素瘤.美国已批准8种基因治疗方案.治疗艾滋病用射线照射已导入HIV 基因的成纤维细胞,细胞停止分化,但能产生g p160,将细胞回输给病人,能激活免疫系统,杀伤HIV 感染细胞.治疗家族性高胆固醇血症(FH) 是肝细胞低密度脂蛋白(LDL)受体基因混乱造成的遗传病,将LDL基因导入病人离体培养的肝细胞中,然后经导管注入门脉循环的

23、血液中,进入肝细胞后表达相应的功能蛋白.,45,治疗先天性免疫缺陷综合症 病人因缺少腺苷脱氨酶基因(ADA)导致T、B淋巴细胞发育不完全,功能障碍,造成严重免疫缺陷.将正常ADA 基因经转录病毒转染进入白细胞,回输患者体内,ADA基因表达正常,患者ADA达正常值的25%.治疗B型血友病 将人凝血因子的cDNA经逆转录病毒转染到患者的成纤维细胞,再植入患者腹腔中.患者的凝血因子已从此以7.1ng/ml上升到24.5ng/ml,其活性从2.9%上升到6.3%.病情明显好转,不需要输血治疗.,46,后语,21世纪是生命科学世纪,生命是物质运动最复杂的形式,生命科学发展道路是遥远而漫长的,需要我们不懈的努力,执着的追求,持久的探索。生物技术是生命科学中发展最迅速,最活跃的前沿领域,有巨大的发展空间,广阔的用武之地。生物技术是多学科的综合,又向多领域延伸。具备的素质:广博的知识,扎实的基础,熟练的技术,创新的思维和实践的能力。,作业2,介绍一种动物生产中的新技术或新方法要求： （1） 图文并茂 （2）自拟题目，避免重复 （3）以班为单位收齐（打印纸质版）,