氨基甲酸酯类农药检测用免疫传感器的研究.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流氨基甲酸酯类农药检测用免疫传感器的研究.精品文档.氨基甲酸酯类农药残留检测用免疫传感器的研究The Study of Immunosensor on Carbamate Pesticides Residue Detection摘要：近年来，食品生物安全问题越来越受到各国政府和百姓的重视，寻找一种优良的检测方法成为当前食品安全监督部门的当务之急。农药残留成为危害食品安全的重要问题之一，这就对食品农药残留的快速检测提出高要求。生物传感器技术具有快速、灵敏、特异、简便等特点，在食品检测领域具有广阔的应用前景，因此生物传感器作为一种新的检测分析工具，

2、在检测食品农残中具有广泛的应用前景。本文主要介绍免疫传感器的特点、优点、国内外的研究现状、存在的问题及我们要研究的氨基甲酸酯类农药检测用免疫传感器的内容和预期达到的效果。 关键词：农药残留；生物传感器；检测Abstract: In recent years, governments and people paid more attention to problem of food bio-safety. Finding an excellent method to solve these problems becomes an urgent work in food safety superv

3、ision departments. The one of the most important problems for harming food safety is the pesticide residues, and a rapid detection of pesticide residues in food make high demands. Because of the expert, sensitive, quick-responding reaction and simple, biosensor is widely applied in the food analysis

4、. So biosensor as a novel detection and analysis tools are widely used in detection of pesticide residues in food. In this paper, the characteristics, the advantage, research home and abroad, open questions of immunosensor, as well as the study of immunosensor on carbamate pesticides detection were

5、discussed.Keyword: carbamate pesticide residue；immunosensor；detection引言农药是重要的农业生产资料，在农产品生产中对病、虫、草等危害的防治有着不可替代的作用，由于使用农药我国每年仅粮食一项就挽回损失约占总产量的7%。 由此可见，农药的发明和使用给农业生产带来了革命性的变化， 而且在农业生产中发挥着越来越重要的作用。虽然农药在我国农业生产中有着不可替代的作用，但由于农药的不合理使用，导致很多农产品中农药残留超标，这严重威胁了人类的饮食安全1。农药残留是农药使用后一个时期内没有被分解而残留于生物体、收获物、土壤、水体、大气中的微量

6、农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称，不仅对环境造成了极大的污染，同时，通过食物链的富集作用，进入人体，对人体产生各种危害。1.氨基甲酸酯类农药残留检测用免疫传感器研究的意义食品安全问题除了作为重大公共卫生问题外,也是一个社会问题,涉及到管理监督水平、食品生产经营者的素质、全社会消费观念等。然而,长期存在的科技“瓶颈”是影响我国食品安全的重要因素。为了能够改善我国食品安全现状、减少食源性疾病的发病率、更有效的对市场进行卫生监管,对于关键检测技术的研究非常重要。1.1农药残留的传统检测方法农药残留分析既要有精细的微量操作手段，又需要高灵敏度的痕量检测技术。经典的分析方法,如液相色谱（LC）、

7、气相色谱（GC） 以及超临界流体层析等分析方法。目前实验室使用最多的农药检测方法是高效液相色谱法（HPLC） 和气象色谱-质谱（GC-MS）以及特异性检测如电子捕捉检测、氮磷检测已与质谱分析法结合并应用于农药残留包括主要的农药代谢物和降解物分析2-4。这些分析方法虽然具有高选择性， 但是操作繁琐、耗时长、成本高， 并且要求对样品进行预浓缩和衍生处理， 难以得到广泛的应用。因此,人们迫切需要快速、可靠、经济和适合于现场应用的快速检测方法。于是,廉价、快速、可信、敏感的生物传感器应运而生。与传统的分析方法相比,生物传感器具有如下特点：待测的样品不用经过预先处理，,除缓冲液外无需其他试剂， 可以同时

8、对样品进行分离和检测。 专一性强，只对特定的底物起反应， 而且不受颜色、浊度的影响。分析速度快，可以在一分钟得到结果。准确度高， 一般相对误差可以达到1。 操作系统比较简单，可以实现连续监侧，容易实现自动分析 成本低， 在连续使用时， 每例测定仅需要几分钱人民币。有的生物传感器能够可靠地指示微生物培养系统内的供氧状况和副产物的产生。敏感物质经固定化可重复使用。响应快,样品用量微传感器连同侧定仪的成本远低于大型分析仪器,便于推广普及1-3。1.2生物传感器简介根据生物传感器中分子识别元件即敏感元件用于农药残留的生物传感器可分为五类： 酶传感器（enzymesensor）， 微生物传感器（micr

9、obialsensor），压电生物传感器（piezoesensor）和免疫传感器（immunolsensor），显而易见， 所应用的敏感材料依次为酶、微生物个体、抗原和抗体。免疫传感器是根据抗原和抗体特异性结合所引发的免疫反应的原理研制成的传感器。相对于强特异性的免疫传感器而言前几种生物传感器分别存在，酶的价格较高、稳定性稍差；稳定性和选择性不高；增加了操作时间,蛋白质活性在干燥过程易受到损害，更突显了免疫传感器的优越性。免疫反应一般难以检测到小分子物质,通常用荧光素、放射性同位素或酶等物质来标记抗原或抗体,然后用现代测试仪器检测。免疫分析分类方法较多,按标记技术的不同可分为酶联免疫吸附分析法

10、、生物发光免疫分析、荧光标记免疫分析及化学发光免疫分析等;按反应体系物理状态的不同可分为均相免疫分析和非均相免疫分析。电化学免疫传感器是生物技术和电化学技术相结合的产物，而免疫感受器在检测过程中只有抗体和抗原污染物结合没有化学反应， 需要其他体系帮助才能完成信号的转换和放大5-7，在早期的免疫传感器中较多的使用酶标抗体或抗原，但是酶标的步骤繁琐，且酶易失活，研究一种无标记得电化学免疫传感器受到很多学者的重视。1.3氨基甲酸酯类农药残留检测用免疫传感器研究的目的本研究重点研究了无标记免疫传感器的设计方法如应用了自组装技术，凝胶溶胶技术，定向固定技术，纳米固定技术等将无标记的抗原或抗体固定在电极上

11、，优化出最适宜的固定方法，进一步降低检测限，并应用于果蔬中农药残留的检测。在目前的研究基础上免疫传感器的发展还存在很多问题：为了保证生物传感器的高稳定性和高灵敏度， 应当使尽可能多的高特异性抗体或抗原分子与固相载体结合。为了缩短生物传感器的感应时间， 延长使用寿命， 如何将基膜尽可能的做薄则成为另一个难题； 如何使生物传感器在使用环境中更加稳定也需要进一步的研究。2. 该领域目前的国内外研究水平和发展趋势免疫分析法(Lnmunoassay)正是基于抗原和抗体特异性结合前后物理和化学性质的变化建立的分析方法。免疫传感器是根据抗原和抗体特异性结合所引发的免疫反应的原理研制成的传感器。免疫生物传感器

12、以免疫生物分子作为识别元件，通过固定化技术将免疫蛋白结合到感受器表面，发生免疫识别反应后，生成的免疫复合物与产生的物理或化学信号相关联，由换能器将其转化为与待测物质浓度(或活度)有关的可定量或者可处理的物理化学信号，如电信号、光信号或者声波信号等，再通过二次仪表放大并且输出信号，从而可实现对待测分子的快速灵敏检测。因此免疫生物传感器主要由生物识别系统(感受器)和换能器等元件组成。由于生物传感器在临床医学、环境和食品工业等方面都有重要用途，以及其具有体积小、精度高、专一度强、灵敏度高、检测快速方便、成本低和容易实现实时在线活体检测等优点，己成为当前研究的热点课题之一。2.1国内研究现状西南大学的

13、袁若课题组在免疫传感器方面的研究较为系统，该课题组研究了无标记免疫传感器的多种固定材料，首先基于纳米材料如：纳米金、铁氰化镍纳米颗粒、二氧化硅-亚甲基蓝纳米复合物、碳纳米管、纳米银等纳米材料的优异的电子传输能力，以此为基础的固定方法近期研究较多；其次研究了几种基于分子膜如：有机-无机氧化还原复合膜、纳米结构功能膜、功能化壳聚糖生物复合膜、Nafion 膜等应用于固定的材料。从另一个大方面来说，该课题组研究了免疫传感器的多种检测方法如：应用于检测目标物的电位型免疫传感器，电流型免疫传感器和酶电流型免疫传感器。使用了包括电沉积媒介体、电聚合、层层自组装、多层自组装、静电吸附技术制备了系列的无标记的

14、免疫传感器用于抗原浓度的检测7-14。中山大学的蔡沛祥课题组在无标记免疫传感器方面的研究的成果也较为突出，研究了酶和其它分子的生物杂化膜、双层类脂膜、自组装膜和凝胶溶胶膜为基础的免疫传感器。其中特别是凝胶溶胶技术和改进的可再生凝胶溶胶技术因其制作简单，通过优化影响免疫反应的多种因素如：电解质、pH、温度等，可得到系列稳定性较高的免疫传感器用于目标物的检测14-15。宁波大学的干宁研究组利用多层自组装技术制作了一系列的安培型免疫传感器，主要用于农产品和水产品中的真菌毒素（黄曲霉毒素）和抗生素的检测。另外在医学上应用的传感器的制作也有一定得成绩，在电极的再生和一次性使用的成本较低的免疫传感器方面也

15、有进展16。中国科学院电子学研究所传感技术联合国家重点实验室边超课题组对免疫传感器做了大量的研究，主要在免疫微传感器和免疫微传感芯片方面研究，其中包括了电位型和电流型微传感器，采用了电聚合膜、凝胶溶胶、蛋白A定向固定等技术制的稳定的免疫传感器用于了医学、食品安全等许多方面的检测17。江南大学的孙秀兰等人对无标记的阻抗性电化学免疫传感器进行了研究18，优化了初始电位、抗体固定质量、抗原抗体孵育时间等，进而得到了性能可靠的免疫传感器。在溶胶凝胶和自组装方面也进行了研究。浙江大学的应义斌研究了压电免疫传感器在电极表面固定有机磷单克隆抗体，使用直接免疫的方法检测有机磷农药的残留，对多种固定方法进行比较

16、，在0.00510 g/mL 范围内呈现良好的线性范围，其检测限为2.16103g/mL19。此研究为国内使用直接免疫方法检测农药残留的典型例子。2.2国外研究现状Yanbin Li 20-22 课题小组研制了一系列的无标记的阻抗型的免疫传感器用于致病菌等方面的检测，其研究了叉指型阵列微电极传感器的制备及应用，并使用阻抗方法为检测方法。在具体的组装过程中使用磁性纳米微粒材料，得到了较理想的检测限。Enrique23-26在免疫传感器方面也做了大量的研究，在农药残留检测中做了莠去津的检测，其课题组使用的是叉指型电机，为了扩大免疫传感器的响应电流使用纳米金标记的抗体，也使用了固定抗原的方法，对实验

17、进行了一系列的优化，进而得到了23g/L。Mani27利用标记了磁珠的抗体研制了超灵敏的免疫传感器，利用的磁珠的直径大约是1103mm，对待侧样品的最低检测限达到5 fg，灵敏度是已研究方法的8倍。其免疫传感器的制作过程如下：此方法同ELISA和仪器分析的结果相比较吻合度较好。 Ronghui Wang28 对叉指型阵列电极的研究较多，基于阻抗型制作的叉指型阵列微电极作为一种新颖的具有高灵敏度和高特异性的方法应用于医学等其它方面的研究，研究中表明了微电极的电阻随着蛋白A的固定，抗体在电极表面的固定和辣根过氧化物酶（HRP）对免疫传感器的封闭步骤的进行而逐步扩大，在抗原和抗体的特异性反应中电阻值

18、进一步扩大，况且扩大值与待测物的浓度成比例，从而得到待测物的浓度。此研究的优很突出，首先使用在电阻测量方面有优势的插指型阵列微电极，可以起到放大信号，缩小非特异性吸附和减少测量时间的作用；其次利用蛋白A的定向固定方法可以最大量的把抗体固定在电极表面，并且可以使抗体呈现定向固定可以更有效的吸附抗原。其组装方法图如下： 从图中可以看出步骤较为简便，可控制和可操作性较强。应用阻抗图谱描述了组装效果，使用原子力显微镜（AFM）研究抗体抗原的特异性结合，其线性检测范围从103到107 EID50/ml，检测限为103 EID50/ml。 Jun Okuno29研究了单壁碳纳米管(SWNTs)的特性及在无

19、标记的电化免疫传感器中的应用，在此实验中使用查分伏安法（DPV）为检测方法，其目标检测物前列腺抗原的检测限达到0.25 ng/mL。由于SWNTs独特的、特定的电学和机械学特性经常被用于免疫传感器的设计中。近些年来生物传感器的发展一直紧随着新材料的进展，在Fang30的文献中使用了介电材料钛酸钡，使用溶胶凝胶技术在电极上形成一层薄的衍生非结晶型钛酸钡（BST）薄膜，在制作传感器的过程中应用溶胶凝胶技术联合自组装技术共同应用，使用阻抗的方法进行测量，并对实验条件如：电解液的浓度、抗体的浓度、pH进行了优化，最终得到的检测线为40ng/ml，其具体组装方法和等效电路如下：虽然此实验的采用的两电极系

20、统，但是其固定方法、检测方法、优化指标给我很大的启示。Thavarungkul 等31制备了无标记阻抗分析流动注射免疫传感器，检测牛奶中的青霉素。青霉素抗体固定在自组装硫辛酸单层膜修饰的金电极上，阻抗实时检测的频率为160Hz，在1.0 10-13-1.0 10-8mol/L 范围内阻抗与青霉素的浓度是线性的，检出限为3.0 10-15mol/L。青霉素抗体在自组装硫辛酸单层膜修饰的金电极上的固定稳定，重复使用45 次后的RSD 小于4%。2.3存在的问题及发展趋势免疫分析技术是现代分析测试领域里的一个重要的研究课题,该技术不仅适用在医学领域检测生物大分子,也越来越多的用于检测复杂样本中小分子

21、物质如农药等痕量组分 ，由于抗原抗体的免疫反应具有极高的特异性和灵敏性,并且快速、简便,可进行现场检测,能够弥补仪器分析技术的不足,因此,农药残留的免疫检测技术研究与开发,能够更加有效的监测和检测样品中的农药残留,对指导生产实践中的合理使用农药、卫生现场监督、农药残留超标和中毒的快速检测、加强食品安全控制的研究工作等,都具有重要的现实意义。（1）免疫传感器多用于痕量检测，如何进一步提高灵敏度和选择性,解决检测干扰和样品前处理问题是制约技术发展的关键。（2）免疫传感器的应用受到可利用的抗体种类少、抗体的不稳定性、抗体膜的可重复性、膜的固定化及再生问题等诸多条件的制约使得其在食品安全检测中实现商业

22、化比较困难，大部分停留在实验室水平。抗体膜的固定化及再生问题将是免疫传感器今后研究工作的重点。（3） 缺少对免疫传感器的检测结果进行认证和标准化的标准，因此免疫传感器的应用和商品化生产必然会受到制约。（4）实验装置的微型化是21 世纪分析化学发展的主题之一，免疫传感器与微流控芯片、微阵列技术相结合是未来发展的必然趋势。近年来，随着微机械电子加工技术(MEMS)及微细蚀刻技术应用于免疫传感器研究与开发，多通道，阵列式免疫传感集成化芯片将会逐步应用到检测当中。3. 氨基甲酸酯类农药残留检测用免疫传感器要研究的内容及实施方案3.1.研究内容与预期成果（1）研究单克隆抗体的特性，用经典的酶联免疫（EL

23、ISA）技术检测抗体的活力，和抗体抗原结合的特异性，确定抗体的可应用参数，为实验的精确性和可操作性奠定基础。（2）制备一些用于形成抗体膜的材料，进行纳米材料如纳米金，纳米Si02粒子，磁性纳米颗粒Fe3O4，纳米钛酸钡，溶胶凝胶等，使用透射电镜（TEM）原子力显微镜（AFM）或扫描探针电镜（SPM）研究其纳米粒子的直径大小，进而得到比表面积可以反映粒子的电学特性。（3）应用制备的材料结合制备抗体膜的技术设计制备免疫传感器的敏感界面。首先利用自组装技术，通过制备的不同材料把单克隆抗体组装在电极表面；其次：使用溶胶凝胶技术将抗体固定在其空隙中；然后，为了实现对抗体的定量固定已达到节约抗体和可以精确

24、计算的目的使用定向固定的方法；最后把研究稳定了的的方法相互组合以便达到更理想的效果。（4）对于制备的免疫传感器的测量可使用循环伏安（CV）电流检测，交流阻抗（ELS）电阻检测，差分伏安（DPV）检测方法等。对于检测系统采用稳定的三电极系统。（5）对实验的参数进行优化，需要优化的参数包括制作基础材料的影响条件（温度、时间、pH），制作抗体膜过程中的影响因素：膜的固定时间和固定温度，抗体的浓度，测试底液的pH，孵育时间，孵育温度，孵育pH等，得到一组最优制备效果数据和最稳定的检查结果。（6）为了进一步验证抗体抗原的结合情况，使用原子力显微镜（AFM）或扫描隧道电镜（STM）对电极表面的抗体抗原复合

25、物的比率进行研究，对测试结果进行进一步的精确，得出信号与检测物浓度的标准曲线。（7）考察免疫传感器好坏，利用的参数除了分析方法中常见的灵敏度、准确度、精确度之外,还涵盖选择性(交互反应率大小) 、响应时间、样品通量、传感器寿命、是否能进行实时在线分析、是否能够再生(regeneration) 、是否能检测实际环境样品以及是否能够实现集成化和小型化等进行评价。（8）对实际样品进行处理，对用直接溶解，超声提取，样品榨汁等多种方法进行优选，选择精准、简单易行的样品处理方法，将免疫传感器应用到实际的果蔬样品中农药残留的检测。3.2具体的实验方法（1）应用EL I S A检测技术对克百威单克隆抗体的活性

26、和特异性进行检测，确定抗体的使用浓度等指标，并确定此方法的最低检测限。（2）制备材料并描述材料的基本性质的表征。（3）清洗电极，电极的表面积对实验结果有较大的影响，因此经过抛光、超声清洗、硫酸活化得到彻底清洁的电极。（4）电极的修饰，使用自组装的方法制备免疫传感器，其具体操作步骤即组装效果表征如图所示：（5）经过对实验参数的优化得到最佳的实验条件，并在最优条件下对农药浓度进行检测，形成电流变化与农药浓度或浓度对数的校正曲线，每个浓度进行多个平行实验，进而得到回归方程计算出检测限。（6）对免疫传感器的稳定性（重复扫描稳定性、10天后的稳定性）、精确性、可重复利用性（免疫传感器的复活）、特异性（不

27、同种类的常见农药及结构相似物）进行检测，得出免疫传感器的应用参数。（7）为了进一步验证所制作免疫传感器的性能，与仪器测试方法如液相色谱（LC）、气相色谱（GC）和经典方法酶联免疫（ELISA）的结果进行比较。用于实际样常见果蔬品检测和添加回收率的检测。4. 课题研究的创新之处电流型免疫传感器将电化学分析方法与免疫学技术相结合，具有快速、灵敏、选择性高、操作简便等特点。本实验从功能化固定材料的制备，传感器敏感界面的构建以及新型信号增强的免疫传感器的研制等方面进行了以下几点的探索和研究：(1)基于用于农药检测的酶生物传感器的基础上制备了新型电流型无标记免疫传感器，将直接竞争的方法应用到农药残留的检

28、测，这种方法到目前还鲜有报道。(2)基于新的物质材料如纳米磁性材料（TiO2、Fe3O4）、电介质材料（BST、SiO2），结合相应的技术如自组装成膜技术、溶胶凝胶成膜技术、电沉积技术、定向固定技术等，设计一系列新的用于农药检测的免疫传感器。参考文献1 王兆守，刘丽花，邵宗泽，陈小兰，黄加扬，农药残留检测新方法研究进展，化工进展，27（2008），137013892 黄科林，吴睿，韦生敏， 慕朝师，刘宇宏，农药残留测定用生物传感器研究进展，企业科技与发展，268（2009），19233 Xia Sun, Xiangyou Wang, Wenping Zhao. Polyaniline modi

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