版免疫学专业实践能力培养技术指南1.doc
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1、【精品文档】如有侵权,请联系网站删除,仅供学习与交流版免疫学专业实践能力培养技术指南1.精品文档.免疫学实验课的目的和要求免疫学是动物医学科学领域中的一门重要学科。在学习免疫学的过程中,不仅需要掌握本学科的基础知识、基本理论,同样重要的是不能忽视免疫学作为实验性科学而不断发展的事实。因而,我们在教学过程中,注重对学生进行免疫学技术操作及实验能力的培养。免疫学实验课是整个免疫教学中重要的有机组成部分。一、实验课目的: 1 加深和巩固对系统理论知识的理解和体会。 2 熟悉和掌握免疫学实验的基本技能。 3 培养正确的科学态度和思维分析能力。 二、实验课要求: 1为提高实验课效果,每次实验前必须认真预
2、习。了解实验原理、材料与方法、注意事项以及预期的实验结果。认真写实验计划。2加强基础训练,每次实验过程中应注意基本技术、基本操作、基本训练。坚持严肃性、严格性和严谨性。3示教实验和录像实验要仔细观察。 4自行操作要认真、准确。 5为提高科学思维、分析、总结能力,每次实验结束后必须认真地记录结果,进行分析,得出结论,完成实验报告。 6. 全部实验课结束后,以小组为单位,完成一份科研项目申请书的撰写任务,并按时交给老师。实验室守则 1尊重教师、友爱同学,严肃认真,严谨求实。2进入实验室应穿白大衣,保持安静,遵守秩序,不允许在实验室接听电话。3爱护仪器设备。节约试剂。尤其是贵重仪器的使用,未经指导教
3、师许可,不得擅自动用。如遇器材损坏或其它意外情况应及时报告指导教师。4保持实验室整洁、卫生,实验完毕后应整理好器材、物品,关好水、电、门窗,废弃物应根据不同性质作适当处理,并将实验室打扫干净。桌椅放回原处。5. 严格遵守国家生物安全法和动物传染病法,不得擅自处理试验后的动物及其器官,要在专业教师的指导下进行严格消毒和无害化处理。 本科生免疫学试验计划写作格式淋巴细胞增殖 试验计划专业与班级 姓名 学号 成绩: 1. 理论依据或原理;2. 本试验的用途(举例说明,例如,诊断、治疗、疫苗评价等);3. 目的(解决什么问题,达到什么要求);4. 材料:必须有3种主要试剂的公司联系电话、价格、试剂规格
4、、 多 少优惠、到货时间、保存条件等;5. 仪器设备,规格,型号等注明;6. 试验方法:写明方法名称,主要步骤等;7. 小组人员分工:小组内人员的安排;8. 注意事项,安全,卫生,记录等。注:实验计划应在实验开始前一周提交给任课教师。实验报告的书写兽医免疫学、免疫学实验报告按学校的统一格式进行书写。特别注意:每次试验结束后,要求各位同学到图书馆查找一篇学术论文,这篇论文的研究方法中应用了你刚学过的方法,并要写出短评,对其方法应用是否合理作出评价。注:实验报告应在实验结束后一周提交。实验一 凝集反应一、 目的1. 了解血清学方法的原理2. 血清学方法在微生物诊断中的作用3. 学会利用血清稀释法测
5、定免疫血清的效价。二、 原理:颗粒性抗原(如细菌或红血球)的悬液与含有特异性抗体的血清混合,在适量电解质存在的情况下,经过一定时间,出现肉眼可见的凝集块,称为凝集反应。 参加反应的抗原称凝集原(灭活的布鲁氏菌体),其血清(布鲁氏菌阳性血清)中的抗体,称为凝集素。凝集反应的机制是由于抗原与其相应抗体间存在着相对应的极性基。极性基的相互吸附,使抗原外周的水化膜除去,由亲水溶胶变成疏水溶胶。疏水溶胶性质不稳定,水中的电解质使抗原颗粒间的排斥力消除,从而产生了凝集现象。试管凝集反应(agglutination in test tubes)是用已知颗粒性抗原检测未知抗体及其相对含量的半定量试验。此法为免
6、疫血清定量测定效价法。三、应用:凝集试验可以用于定性的检测,即根据凝集现象的出现与否判定结果阳性或阴性;也可以进行半定量检测,即将标本作一系列倍比稀释后进行反应,以出现阳性反应的最高稀释度作为血清效价。可进行细菌的抗原分析、鉴定及分型,也可应用已知细菌检查未知血清的抗体。诊断伤寒、副伤寒病的肥达氏反应(Widal test)、布鲁氏菌病的瑞特氏反应(Wright test)均属定量凝集反应。这种反应适用于各种抗体和可溶性抗原的检测,其敏感度高于沉淀反应,因此被广泛应用于兽医临床检验。四、材料:(1)耗材:试管、试管架、移液器、记号笔;(2)试剂:生理盐水、布鲁氏菌悬液、阳性血清、阴性血清;(3
7、)仪器:恒温箱;五、方法:(1) 取清洁干燥的小试管12支,排列在试管架上,(最好标记好序号,以免弄混)。(2) 用移液管加入生理盐水,第1管加入2.3 m1 ,其余2-9管加入0.5m1生理盐水。(3 )用移液管吸取待检血清0.5m1,注入第一管,并吸吹三次混匀;然后由第一管依次吸 取0.5m1注入第二管、第二管到第三管如此类推到第九管为止。(从第九管吸出0.5m1弃去)(以上九管为倍比稀释)。(4)在每管中加入0.5m1经处理的布鲁氏菌菌悬液,作为抗原。第10-12管作为对照。第10试管为抗原对照,加抗原与生理盐水。第十一管加阳性血清(0.5ml)和抗原。第十二管加阴性血清和抗原。(5)摇
8、匀,并置37恒温箱内作用,次日再观察结果。观察结果时勿摇动试管六、观察管底是否有凝集现象。记录结果完全凝集,凝集块完全沉于管底,液体澄清,以“十十十十”记录;凝集块沉于管底,液体稍混,以“十十十”记录;部分凝集,液体混浊,以“十十”记录;极少凝集液体混浊以“十”记录。无变化记以“一”*取“十十”的稀释度作为免疫血清的效价。实验二 沉淀试验双向免疫扩散试验一、目的要求:1. 掌握双向免疫扩散试验的原理和用途;2. 熟悉双向免疫扩散试验的操作方法。二、实验原理:1. 沉淀反应:可溶性抗原(如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒、组织浸出液等)与相应的抗体结合后,在适量电解质存在下,形成肉眼可见的
9、白色沉淀,称为沉淀试验。2. 抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。3. 血清学反应条件下,抗原抗体均带负电荷,使极化的水分子在其周围形成水化层,成为亲水胶体。当抗原与抗体结合后,表面电荷减少,水化层变薄;而且由于抗原抗体复合物形成后,与水接触的表面积减少,由亲水胶体转化为疏水胶体。在电解质作用下,各疏水胶体之间靠拢,形成可见的抗原抗体复合物。4. 双向免疫扩散试验:将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板上相应的小孔中,使两者各自向四周扩散,若抗原与抗体相对应,两者相遇即发生特异性结合,并在比例合适处形成白色沉淀线。5. 抗原抗体反应的特点:1. 特异性 2. 比例性 3.可逆性
10、6. 带现象:Ag与Ab比例不适而不出现可见反应。前带(prozone) 抗体过量时;后带(postzone)抗原过量时。7. 沉淀反应的抗原可以是多糖、类脂、蛋白质或它们的结合物等。与相应的抗体相比,抗原的分子量小,单位体积内所含抗原量多,具有较大的反应面积。因此,在作定量沉淀试验时,为了不使抗原过剩而生成不可见的可溶性复合物,通常应稀释抗原。8. 每一对应抗原和抗体可出现一条沉淀线,出现沉淀带的抗体最大稀释倍数即为抗体效价。9. 参与沉淀试验的抗原称沉淀原,抗体称为沉淀素。三、实验用途:沉淀试验广泛应用于病原微生物的诊断(鸡马立克氏病、法氏囊病、炭疽杆菌抗原),各种免疫血清效价和毒素、抗毒
11、素的测定。四、材料:(1)耗材:平皿、试管、枪头;(2)试剂:琼脂粉、8.5% 高渗盐水、待检血清、法氏囊抗原;(3)仪器:高压锅、打孔器、移液器、湿盒、恒温箱。五、实验方法:1. 琼脂板的制备:1克琼脂粉溶于100ml 8.5% 高渗盐水,高压灭菌,待温度降至55oC左右时,无菌操作下倾注于平皿中,制成厚约2mm左右的琼脂板。2. 打孔:在琼脂板上打梅花孔,孔径为2mm,中间空和周围孔间的距离大约为3mm。3. 加样:将待检血清作倍比稀释,即1:2、1:4、1:8、1:16,分别加至周围孔中,中间加抗原(法氏囊抗原)。4. 作用:将琼脂板放置湿盒中,在37oC恒温箱中作用24h。5. 结果观
12、察:抗原抗体在凝胶为扩散,在两孔之间比例最适合的位置出现沉淀带,出现沉淀带的抗体最大稀释倍数即抗体效价。四、注意事项:打孔加样时,不要将琼脂划破,以免影响沉淀线的形成。孔间距要相等。实验三 实验动物接种方法一、试验目的:熟悉并掌握实验动物的疫苗接种途径与方法二、试验原理:接种疫苗的目的是激发保护性免疫应答并形成免疫记忆,从而使动物免遭感染的危害。疫苗种类:根据传统与习惯,疫苗可分为减毒活疫苗、灭活疫苗、抗毒素、亚单位疫苗、载体疫苗、核酸疫苗等。接种途径的确定应根据疫苗种类、畜禽日龄及免疫目的而定,主要有以下几种途径:气雾法、注射法(肌肉、皮下、皮内、静脉、腹腔内)、饮水法、点眼、滴鼻法、灌胃法
13、等。一般活苗采用饮水、喷雾、滴鼻、点眼、注射免疫,灭活苗则需肌肉或皮下注射。三、实验材料:1ml注射器、生理盐水、滴管、灌胃器、每两人一只小鼠四、实验方法:注射法(肌肉、皮下、皮内、静脉、腹腔内)、点眼、滴鼻法、灌胃法。1注射接种方法(1)皮下注射接种(多点注射法)皮下注射接种是将药液推入皮下结缔组织,经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环的过程。作皮下注射常选项背或大腿内侧的皮肤。操作时,常规消毒注射部位皮肤,然后将皮肤提起,注射针头取一钝角角度刺入皮下,把针头轻轻向左右摆动,易摆动则表示已刺入皮下,再轻轻抽吸,如无回血,可缓慢地将药物注入皮下。拔针时左手拇、食指捏住进针部位片刻,以防止药物外漏
14、。注射量约为0.1-0.3ml/10g体重。(2)皮内注射接种(多点注射法)是将药液注入皮肤的表皮和真皮之间,观察皮肤血管的通透性变化或皮内反应,接种、过敏实验等一般作皮内注射。先将注射部位的被毛剪掉,局部常规消毒,左手拇指和食指按住皮肤使之绷紧,在两指之间,用结核菌素注射器连接4.5针头穿刺,针头进入皮肤浅层,再向上挑起并梢刺入,将药液注入皮内。注射后皮肤出现一白色小皮丘,而皮肤上的毛孔极为明显。注射量为0.1ml/次。(3)肌肉注射接种(多点注射法)小鼠体积小,肌肉少,很少采用肌肉注射。当给小鼠注射不溶于水而混悬于油或其他溶剂中的药物时,采用肌肉注射。操作时1人保定小鼠,另一人用左手抓住小
15、鼠的1条后肢,右手拿注射器。将注射器与半腱肌呈90角迅速插入1/4,注入药液.用药量不超过0.1ml/10g体重.(4)静脉注射接种将小鼠放在金属笼或鼠夹中,通过金属笼或鼠夹的孔拉出尾巴,用左手抓住小鼠尾巴中部.小鼠的尾部有2条动脉和3条静脉,2条动脉分别在尾部的背侧面和腹侧面,3条静脉呈品字型分布,一般采用左右两恻的静脉.拔去沿尾部静脉走向的毛,置尾巴于45-50温水中浸泡几分钟或用75%酒精棉球反复擦拭尾部,以达到消毒和使尾部血管扩张及软化表皮角质的目的.行尾部静脉注射时,以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧,使静脉更为充盈,用中指从下面托起尾巴,以无名指夹住尾巴的末梢,右手持4号针头注射器,使针
16、头与静脉平行(小于30角),从尾巴的下1/4处进针,开始注入药物时应缓慢,仔细观察,如果无阻力,无白色皮丘出现,说明已刺入血管,可正式注入药物.有的实验需连日反复尾静脉注射接种,注射部位应尽可能从尾端开始,按次序向尾根部移动,更换血管位置注射接种。注射量为0.05-0.1ml/10g体重。拔出针头后,用拇指按住注射部位轻压1-2min,防止出血。应当注意,此途径因绕过淋巴结,故不利于细胞免疫的建立。(5)腹腔注射左手提起并固定小鼠,使鼠腹部朝上,鼠头略低于尾部,右手持注射器将针头在下腹部靠近腹白线的两恻进行穿刺,针头刺入皮肤后进针3nm左右,接着使注射针头与皮肤呈45角刺入腹肌,穿过腹肌进入腹
17、膜腔,当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后抵抗感消失。固定针头,保持针尖不动,回抽针栓,如无回血、肠液和尿液后即可注射药液。注射量为0.1-0.2ml/10g体重。2. 滴鼻接种左手保定住小鼠,右手用滴管吸取疫苗,对准鼻孔滴入1-2滴疫苗。待完全吸入后方能松手,吸入不准的要重滴。3. 点眼接种法左手保定住小鼠,右手用滴管吸取疫苗,对准眼睛滴入1-2滴疫苗。待完全吸入后方能松手,吸入不准的要重滴。4. 灌胃法小鼠专用灌胃针由注射器和喂管组成,喂管长约1nm,喂管尖端焊有一金属小圆球,金属球中空,用途是防止喂管插入时造成损伤。金属球弯成20度角,以适应口腔与食道之间弯曲。将喂管插头紧紧连接在注射器的接口上,
18、吸入定量的药液;左手捉住小鼠,右手拿起准备好的注射器。将喂管针头尖端放进小鼠口腔,压迫鼠头部,使口腔与食管成一直线。轻轻转动针头以刺激鼠的吞咽,将针头顺咽后壁轻轻插入食管下段,如遇阻力,可轻轻上下滑动,不能强行插入。一旦感觉阻力突然消失有落空感时,轻抽注射器,如无气泡抽出,则表明针头已进入胃。如此时动物安静,呼吸无异常,可将药液注入。若动物出现剧烈挣扎,进针阻力很大或动物呼吸困难,则可能是插入气管内,此时必须立即退出重插。操作时动作轻柔以防损伤食管及膈肌。一般灌胃针头插入长度小鼠为2.5cm-3.5 cm。用中指与拇指捏住针筒,食指按着针竿的头慢慢往下压,即可将注射器忠的药液灌入小鼠的胃中。五
19、、注意事项1. 注意安全,避免被动物咬伤。2. 注射器要避免重复使用,注射部位的消毒要彻底。实验四 免疫血清(多克隆抗体)的制备一、 目的要求: 加深对抗体基本知识的了解。 掌握多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。 熟练运用检测抗体效价的方法。二、 原理当将抗原注射入实验动物体内时,一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合,受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体,这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分抗原决定簇相结合。将抗原导入敏感动物体内后,可刺激网状内皮细胞系统,尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。如图所示,实验
20、动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。通常初次免疫应答往往比较弱,尤其是针对于易代谢,可溶性的抗原。首次注射后大约7天,在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平,在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同,和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类,但初次和再次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答和再次应答结果相似:抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变,这种改变被称为免疫应答的成熟,具有重要的实际意义。通常在抗
21、原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。三、 应用在临床上,多克隆抗体可用于紧急治疗。在实验室,多克隆抗体可用于蛋白质的分离与鉴定,还可用于病原体的蛋白质组学诊断。四、 材料 实验动物供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类,常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的选择常根据抗体的用途和量来决定,也与抗原的性质有关。如要获得大量的抗体,多采用大动物;如要是获得直接标记诊断的抗体,则直接采用本动物;如要获得间接的标记诊断用抗体,则必须用异源动物制备抗体;如果难以获得的抗原,且抗体的需要量少,则可以采用纯系小鼠制备;一般实验室采用的抗体,多用兔和绵羊制备。 免疫用的动物应选择适龄的健康雄性
22、动物,雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适,有时甚至不产生抗体。由于对免疫应答的个别差异,免疫时应同时选用数只动物进行免疫。本实验用成年健康远交系公兔。 实验器材家兔保定台;刀片;25G针头;1ml注射器;20 ml 血液收集管;药匙;离心机以及塑料离心管;加样器及加样管;烧杯。 实验试剂 抗原;乙醇;20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂: 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂的成分成分 完全佐剂 不完全佐剂 石蜡油 6 份 + + 无水羊毛脂 4 份 + +杀死的分枝杆菌 3-5 mg + -磷酸缓冲溶液 10 份 + +(福氏完全佐剂的制备:使用前在福氏不
23、完全佐剂中加入适量杀死的分枝杆菌)4. 乳化将抗原与佐剂混合的过程称为乳化。乳化的方法很多,可采用研钵乳化;可直接在旋涡振荡器上乳化;可用组织捣碎器乳化。少量时,特别是福氏佐剂与抗原乳化时,常采用注射器乳化,用两个注射器,一个吸入抗原液,一个吸入佐剂,两注射器头以胶管连接,注意一定扎紧,然后来回抽吸。当大量乳化时,可采用胶体磨进行。 五、 实验方法 抗原的制备抗原制备的主要目的在于使被免疫动物能够产生最强、最适当的抗体。由于纯化的抗原适合产生抗体,因此在注射前通常采用一些经典的方法,比如柱层析、分级萃取、凝胶电泳等进行抗原的分离和纯化。如果多肽抗原在SDS/PAGE中为清晰可见的单一条带,将该
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