生化讲义1-1.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流生化讲义1-1.精品文档.生物化学教学大纲第一章 绪论 （学时：2） 教学内容：（一）生物化学的概念，研究对象和主要内容 （二）生物化学发展简史 （三）生物化学与其他学科的关系 （四）生物化学的应用与发展前景 教学重点：生物化学的概念，研究对象和主要内容第二章 蛋白质 （学时：8） 教学内容：（一）蛋白质的生物学意义和化学组成（二）氨基酸 1、氨基酸的基本结构和性质 2、根据R基团极性对20种蛋白质氨基酸的分类及三字符缩写 （三）蛋白质的结构与功能 1、肽的概念及理化性质 2、蛋白质的初级结构 3、蛋白质的高级结构4、蛋白质结构与功能的关系

2、（四）蛋白质的理化性质 1、蛋白质的相对分子量2、蛋白质的两性电离及等电点3、蛋白质的胶体性质4、蛋白质的紫外吸收特征5、蛋白质的变性及复性（五）蛋白质的分离与纯化 1、蛋白质的抽提原理及方法 2、蛋白质分离与纯化的主要方法：电泳、层析和离心 3、蛋白质的定量测定（六）蛋白质的分类教学重点：（一）氨基酸的基本结构和性质（二）根据R基团极性对20种蛋白质氨基酸的分类及三字符缩写（三）蛋白质的结构与性质（四）蛋白质结构与功能关系（五）蛋白质纯化的一般原则与方法第三章 酶 （学时：7） 教学内容：（一）酶的基本概念和作用特点。 （二）酶的国际分类及命名。 （三）酶的作用机理。 1、酶的活性中心 2、

3、酶的专一性和高效性机制（四）影响酶促反映速度的主要因素。 （五）调节酶 1、别构酶和同工酶（六）酶工程的概念与应用（七）维生素和辅酶教学重点：（一）酶的概念与酶的活性中心（二）影响酶促反映速度的主要因素和米氏方程第四章 核酸化学 （学时：5） 教学内容：（一）核酸的种类、组成单位和生物学功能。 （二）核酸的分子结构。 1、DNA的分子结构 2、RNA的分子结构 （三）核酸的理化性质。 1、核酸的一般性质 2、核酸的紫外吸收特征 3、核酸的变性、复性及分子杂交教学重点：（一）DNA双螺旋结构、tRNA和mRNA结构特点（二）核酸的紫外吸收特征及变性、复性及分子杂交第一章 绪论一、生物化学的含义

4、（）研究组成生物体物质的结构、性质、功能以及在生命现象中的化学变化的科学，即研究生命现象的化学本质的科学。二、生物化学的研究对象（）生物大分子（biomacromolecule:）: 具有一定生物功能的、分子量在 10000 Dalton（道尔顿）以上的分子，如核酸、蛋白质、糖类、脂类等。三、生物化学的研究内容（）1 研究构成生物有机体的物质基础，即静态生物化学。2 研究生物物质在体内的运动规律，即动态生物化学或新陈代谢的规律。3 研究生物物质的结构、功能、代谢与整个生命现象的关系，即机能生物化学。4 研究生物遗传信息的传递、表达及其调控。四、生物化学的发展过程1 早期生物化学的发展：二十世纪

5、前，主要是静态生物化学的成果。1) 早期生物化学的发展动力来自于医药实践和发酵工业的兴起。2) 欧洲十七十八世纪工业的飞速发展也对生物化学这门学科的发展起了巨大的推动作用。3) 十九世纪初，随着物理学、化学、生物学的巨大发展，影响和促进了生物化学理论体系的形成与发展。（19世纪末20世纪初生化领域的三大发现：维生素、酶、激素。2 动态生物化学的发展：二十世纪初到二十世纪五十年代，主要是物质在体内代谢规律的认识飞速发展时期。（葡萄糖体内的氧化分解细胞质底物水平磷酸化线粒体氧化磷酸化 能量逐步释放）3 分子生物学的兴起：二十世纪中叶开始，生物化学进入分子水平。4 生物技术与生物工程的兴起：以生物化

6、学等学科为基础。5 现代生物化学的发展：人类基因组计划(HGP)、后基因组计划。五、生物化学与其它学科的关系六、生物化学与工农业生产的关系、生物化学的应用第二章 蛋白质化学第一部分 氨基酸结构与性质2.1 蛋白质通论一、蛋白质 (Protein) 的生物学意义（为什么说没有蛋白质就没有生命）(一) 蛋白质是生命活动的物质基础除水外，蛋白质是生物体内的含量最多的组分，占人体干重的45%，占细菌干重的5070%。(二) 蛋白质的生物学功能1. 作为生物催化剂：在体内催化各种物质代谢反应的酶几乎都是蛋白质。2. 调节代谢反应：一些激素是蛋白质或肽，如胰岛素、生长素。3. 运输载体：如红细胞中运输O2

7、、CO2要靠Hb (Hemoglobin血红蛋白)、运输脂类物质的是载脂蛋白、运铁蛋白等转运蛋白或叫载体蛋白。4. 参与机体的运动：如心跳、胃肠蠕动等，依靠与肌肉收缩有关的蛋白质来实现，如肌球蛋白、肌动蛋白。5. 参与机体的防御： 机体抵抗外来侵害的防御机能，靠抗体，抗体也称免疫球蛋白，是蛋白质。6. 接受传递信息：如口腔中的味觉蛋白、视网膜中的视觉蛋白。7. 调节或控制细胞的生长、分化、遗传信息的表达。8. 其它：如鸡蛋清蛋白、牛奶中的酪蛋白是营养和储存蛋白；胶原蛋白、纤维蛋白等属于结构蛋白。还有甜味蛋白、毒素蛋白等都具有特异的生物学功能。二、蛋白质的分类1. 根据分子形状分：球状蛋白质、纤

8、维状蛋白质2. 根据功能分：活性蛋白质、结构蛋白质。3. 根据组成分：（1）简单蛋白质：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶谷蛋白、组蛋白、精蛋白、硬蛋白。（2）结合蛋白质：色素蛋白、金属蛋白、磷蛋白、核蛋白、脂蛋白、糖蛋白。4. 根据营养价值分：完全蛋白质、不完全蛋白质。三、蛋白质的水解作用1. 酸水解条件：510倍的20%的盐酸煮沸回流1624小时，或加压于120水解2小时。优点：可蒸发除去盐酸，水解彻底，终产物为L-氨 缺点：色氨酸破坏，并产生一种黑色的物质：腐黑质，水解液呈黑色。2. 碱水解条件：4 mol/L Ba(OH)2或6 mol/L NaOH煮沸6小时。优点：水解彻底，色氨酸不被破坏

9、，水解液清亮。缺点：产生消旋产物，破坏的氨基酸多，一般很少使用。3. 蛋白酶水解条件：蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶，常温3740，优点：氨基酸不被破坏，不发生消旋现象。缺点：水解不完全，中间产物多。 pH值58 。蛋白质酸碱水解常用于蛋白质的组成分析，而酶水解用于制备蛋白质水解产物。2.2 蛋白质的分子组成氨基酸一、蛋白质的元素组成蛋白质是有机化合物，主要由C、N、 H、O 四种元素，还含有P、S、金属元素等。 C: 50-55%，O: 20-23%，H: 6-8%，N: 15-18%，其他元素：低于1%，其他微量元素有：P、Fe、Cu、Mn、Zn、Co、Mo、I 等。蛋白质中N是特征元素，且含

10、量为16%左右 ，即16克氮/100克蛋白质，故可以用定氮法测量蛋白质含量（凯氏定氮法），即：每100克蛋白质含氮16克，也即6.25克蛋白质含氮1克。所以，每克样品含氮量6.25100 就相当于100克样品蛋白质含量（%）（）。二、蛋白质分子的基本组成单位氨基酸（一）氨基酸（amino acid，aa）的结构通式1、 其碳原子既有氨基又连有羧基的分子，称为氨基酸。2、 构成蛋白质的氨基酸除甘氨酸均为L-氨基酸（）。3、 除甘氨酸 (R基为H) 外，其余氨基酸均具有旋光性 （）。4、 各种氨基酸的区别在于侧链R基上。（二）氨基酸的构型构成蛋白质的氨基酸除甘氨酸外，-碳原子均为手性分子（），在空

11、间各原子有两种排列方式：L-构型与D-构型，它们的关系就像左右手的关系，互为镜像关系。（三）氨基酸的结构组成蛋白质的氨基酸共有22中，包括新近发现的硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸。常见二十种氨基酸的结构特点：1. 支链氨基酸：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸2. 含羟基的氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸（）3. 含苯环的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸（）4. 含硫的氨基酸：半胱氨酸（含巯基）、甲硫氨酸（含硫甲基）（）5. 含咪唑基的氨基酸：组氨酸6. 含吲哚基的氨基酸：色氨酸7. 含酰胺的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺8. 含羧基的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸（）9. 含胍基的氨基酸： 精氨酸10. 含-氨基的氨基

12、酸：赖氨酸11. 侧链最简单的氨基酸：丙氨酸12. 不含侧链的氨基酸：甘氨酸13. 含亚氨基的氨基酸：脯氨酸（四）氨基酸的分类1、按酸碱性（1） 酸性氨基酸：一氨基二羧基氨基酸，有：天冬氨酸、谷氨酸、（2） 碱性氨基酸：二氨基一羧基氨基酸 ，有：赖氨酸、精氨酸、组氨酸（3） 中性氨基酸：一氨基一羧基氨基酸，有：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸。2、按侧基R基的结构特点： （1） 脂肪族氨基酸: 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨

13、酸、赖氨酸、精氨酸（2） 芳香族氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸（3） 杂环氨基酸：脯氨酸、组氨酸3、按侧基R基与水的关系（）： （1） 非极性氨基酸：有丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸 (8种)。（2） 极性不带电氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸 (7种)。（3） 极性带电氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸 (5种)。4、按氨基酸是否能在人体内合成分：（1） 必需氨基酸（）：指人体内不能合成必须从食物中摄取的氨基酸：赖氨酸、色氨酸、甲硫（蛋）氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸。(苏缬亮异亮，苯

14、丙色赖蛋)（2） 非必需氨基酸：指人体内可以合成的氨基酸。有十余种。（3） 半必需氨基酸：指人体内可以合成但合成量不能满足人体需要（特别是婴幼儿时期）的氨基酸，有两种：组氨酸、精氨酸。 （五）蛋白质中不常见的氨基酸 羟-脯氨酸 (4-HyP)、羟-赖氨酸(5-HyL)、r-羧基谷氨酸、6-氮-甲基赖氨酸。（六）非蛋白氨基酸 鸟氨酸、胍氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、-丙氨酸、-氨基丁酸等。三、氨基酸的理化性质（一）物理性质1. 形态：均为白色结晶或粉末，不同氨基酸的晶型结构不同。2. 溶解性：一般都溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于丙酮，在稀酸和稀碱中溶解性好。3. 熔点：氨基酸的熔点一般都比较高，一

15、般都大于200，超过熔点以上氨基酸分解产生胺和二氧化碳。 4. 旋光性：除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性（）。5. 光吸收：氨基酸在可见光范围内无光吸收，只有Trp、Tyr、Phe含有功轭双键，所以能够吸收紫外光。它们的吸收峰分别在280、275、257 (nm)。因为蛋白质一般含有Trp、Tyr、Phe，其紫外吸收峰大多数在280 nm左右（）。（二）化学性质1. 氨基酸的两性解离及等电点（）氨基酸既含有氨基，可接受H+，又含有羧基，可电离出H+，通常情况下，氨基酸以两性离子的形式存在。氨基酸在酸性环境中，主要以阳离子的形式存在，在碱性环境中，主要以阴离子的形式存在。这种可以在不同的pH环境下发

16、生不同的电离方式，形成带相反电性的离子，称为两性解离，这种离子称为两性（兼性、偶极）离子。 氨基酸的等电点：氨基酸分子的净电荷为零（所带正负电荷相等)时的溶液pH，以pI表示。 氨基酸具有两性电离的性质，因而其水溶液既可被酸滴定，又可被碱滴定。下面是甘氨酸为例来说明氨基酸两性电离的特点。甘氨酸的电离酸碱滴定曲线从左向右是用NaOH滴定的曲线，溶液的pH由小到大逐渐升高；从右向左是用盐酸滴定的曲线，溶液的pH由大到小逐渐降低。曲线中从左向右第一个拐点是氨基酸羧基解离50%的状态，第二个拐点是氨基酸的等电点，第三个拐点是氨基酸氨基解离50%的状态2. -氨基与-羧基共同参加的反应茚三酮的反应：除脯

17、氨酸与羟脯氨酸外，可与其它氨基酸生成蓝紫色化合物。脯氨酸与羟脯氨酸为黄色化合物。3. -氨基参加的反应(1) 2, 4-二硝基氟苯 (2, 4-DNFB) 的反应 (Sanger反应) ：生成黄色的二硝基苯-氨基酸衍生物（）。(2) 苯异硫氰酸酯 (PITC) 反应 (Edman反应) ：生成苯乙内酰硫脲-氨基酸。蛋白质自动测序仪即基于此原理（）。(3) 丹磺酰氯 (DNS-Cl) 反应：生成荧光物质DNS-氨基酸 (1) 、(2)、(3)反应用于蛋白质的N-末端的测定（）。(4) 与甲醛的反应：用过量的中性甲醛与氨基酸反应，可游离出氢离子，然后用NaOH滴定，从消耗的碱量可以计算出氨基酸的含

18、量。此法称为间接滴定法。4.-羧基参加的反应：(1) 与碱反应成盐(2) 与醇反应成酯(合成氨基酸酰基衍生物的重要中间体)（3）与酰化试剂反应成酰氯 (活化氨基酸羧基)5. 侧链反应（颜色反应）：（1）Millon反应：检测Tyr或含Tyr的蛋白质的反应。 Millon试剂：汞的硝酸盐与亚硝酸盐溶液。产物：红色的化合物。（2）Folin反应：检测Tyr或含Tyr的蛋白质的反应。 Folin试剂：磷钼酸、磷钨酸混合溶液。产物：蓝色的钼蓝、钨蓝。（3）坂口反应：检测Arg或含Arg的蛋白质的反应。坂口试剂：-萘酚的碱性次溴酸钠溶液。产物：砖红色的沉淀（4）Pauly反应：检测His、Tyr及含Hi

19、s、Tyr蛋白质。试剂：对氨基苯磺酸盐酸溶液、亚硝酸钠、碳酸钠 混合溶液产物：橘红色的化合物。（5）乙醛酸的反应：检测Trp或含Trp蛋白质的反应。当Trp与乙醛酸和浓硫酸在试管中叠加时，产生分层现象，界面出现紫色环。 （6）Cys的反应：Cys或含Cys蛋白质与亚硝基亚铁氰酸钠在稀氨的溶液中，产生一种红色的化合物。第二部分蛋白质的结构与性质2.3 蛋白质的结构蛋白质的结构具有多种结构层次，包括一级结构和空间结构。空间结构又称为构象，包括二级结构、三级结构和四级结构。在二级与三级之间还存在超二级结构和结构域这两个结构层次。一、蛋白质的一级结构（）蛋白质的一级结构（Primary structu

20、re）又称为共价结构或化学结构。它是蛋白质分子中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的定位。特点：（1）分子呈链状结构。（2）主要的化学键：肽键和二硫键（一）肽键与肽链1、肽键：一个氨基酸的-COOH 和相邻的另一个氨基酸的-NH2脱水形成共价键（）。肽键的特点：（1）稳定性高。（2）具有部分双键的性质，不能自由旋转。（3）构成肽键的四个原子处于肽平面上。2、氨基酸以肽键连接起来叫肽，肽是一大类物质。（1）两个氨基酸组成的肽叫二肽；（2）三个氨基酸组成的肽叫三肽；（3）多个氨基酸组成的肽叫多肽；（4）氨基酸借肽键连成长链，称为肽链（peptide）（）。1) 肽链两端有自由-NH2和-COOH，自由-

21、NH2端称为N-末端（氨基末端），自由-COOH端称为C-末端（羧基末端）；2) 构成肽链的氨基酸已残缺不全，称为氨基酸残基；3) 肽链中的氨基酸的排列顺序，一般-NH2端开始，由N指向C，即多肽链有方向性，N端为头，C端为尾。N端/氨基末端C端/羧基末端肽键和肽的结构肽键和肽的结构N端/氨基末端 C端/羧基末端(5) 肽链空间构象的基本结构单位为肽平面或肽单位。所谓的肽平面是指肽链中从一个C原子到另一个C原子之间的结构，共包含6个原子（C、C、O、N、H、C），它们在空间共处于同一个平面（）。(二) 生物体内几种常见的多肽1、肌肽（二肽）和脑啡肽（五肽）：缓冲剂和镇痛。2、谷胱甘肽（GSH）

22、：由Glu，Cys，Gly组成（）功能：(1) 参与生物体内的氧化还原反应。 (2) 保护硫基酶的作用 (3) 防止过氧化物积累的作用二、蛋白质的二级结构 (一) 构型和构象构型：手性碳原子所连接的四个不同的原子或原子团在空间的两种不同的排布方式：即D型和L型。构型的改变涉及共价键的破坏和形成，与氢键无关。构象：由几个碳原子组成的分子,因一些单键的旋转而形成的不同碳原子上各取代基团或原子的空间排列。构象的改变不涉及共价键的破坏，仅是单键的旋转,但与氢键及其它次级键的破坏形成有关。(二) 蛋白质的构象变化的分子基础(1) 维持蛋白质三维结构的作用力次级键、氢键、疏水作用、离子键、范德华力、配位键

23、（）(2) 构象变化还与肽平面有关(三) 蛋白质的二级结构定义：蛋白质主链的某些肽段，借助氢键沿着某个轴盘绕折叠，形成有周期性的构象（）。 主要有：-螺旋 (-helix ) 、-折叠 (-pleatecl sheet) 、-转角 (-turn) ，无规则卷曲 (n-转角 (-turn) ，无规则卷曲 (nonregular coil) 。1、-螺旋 (-helix) （）：由每个AA的-NH和位于其前面第四个aa残基的C=O通过氢键形成的螺旋状结构。结构要点为：1) 每个AA的-NH和位于其前面第四个aa残基的C=O形成氢键2) 绕中心轴螺旋，每圈周期3.6 aa，0.54 nm。3) 10

24、0/aa，0.15 nm/aa；4）残基侧链向外做辐射状排列 5) 大多位右手，也有左手 (极少) 5) 遇到Pro时，自然中断形成的一个结节 (kink)。2、-折叠 (-pleated sheet) （）: 若干条肽链或一条肽链的若干肽段通过氢键结合形成的平行或反平行锯齿状片层结构。结构特征为：1) 主链平行或反平行的方式排列在一起，依赖-C=O和-NH形成氢键2) 构象呈锯齿状排列3) 氢键垂直于中心轴4) R基团交替位于片层的上，下方。侧链向外，形成疏水环境。3、超二级结构 (super secondary structure) （）蛋白质中几个相邻的（不一定是一级结构上邻近的）二级结

25、构单位组合在一起，形成有规则的在空间上能辨认的二级结构组合体。1) ：两个-helix彼此缠绕形成的，主要存在-角蛋白中。2) X：X可以是-helix或无规则卷曲 (nonregular coil），主要存在与一些酶当中。3) ：三条或更多反平行式-转角或其他肽段连接而成主要存在一些酶和抗体中。5、 结构域（structural domain）（）指在二级结构基础上，多肽链进一步卷曲折叠形成点一个相对独立，近似球形的组装体。结构域特点：1) 对某些较小分子来说，结构域就是三级结构（只有一个结构域）。2) 往往是活性中心，如酶与抗体。三、蛋白质的三级结构（）一条多肽链在二级.超二级.结构域基础

26、上，整条肽链进一步盘绕，折叠形成的特定构象。特征为：1、三级结构是针对整条肽链而言。2、对某些较小的分子来说。三级结构就只包含一个结构域。 四、蛋白质的四级结构（）概念：由两条或两条以上具有三级结构的多肽聚合而成有特定三维的蛋白质构象，如血红蛋白。每一条多肽链称为一个亚基（subunit）五、蛋白质各结构层次之间的关系1. 一级结构描述的是一条肽链的氨基酸的排列情况。2. 二级结构和超二级结构属于局部的概念，描述的是肽链上某个局部区域肽链的折叠情况。3. 结构域介于局部与整体之间，对于某些短小的只有一个结构域的肽链而言是整体的；而对于大多数较大的有多个结构域的肽链来说，每一个结构域只是一个局部

27、。多个局部构成一个整体的肽链。4. 三级结构是就一条肽链的整体而言的。5. 四级结构是多条肽链结合形成的构象，并不是每一个蛋白质都有四级结构，只有一条肽链的蛋白质没有四级结构(如肌红蛋白就是一个没有四级结构的单肽链蛋白质)。六、蛋白质结构与功能的关系 (一) 一级结构与功能的关系 1. 同种功能的蛋白质具有相似的一级结构1） 同源蛋白：不同种属行使同一功能的蛋白质。如细胞色素C，胰岛素2） 分子进化：不同种属具有同一功能的同源蛋白质，在进化上来自相同的祖先，在一级结构上相对应的氨基酸组成不同，差别越大，其亲缘关系愈远，反之，其亲缘关系愈近。这种以特定分子的之间差异表示物种的进化过程中亲缘远近，

28、叫做分子进化。2. 对于特定的蛋白质，一级结构的改变可能会引起功能的巨大变化(二) 空间结构与功能的关系2. 相同功能、组成相似的蛋白质，空间结构很相似。2. 空间结构决定生物功能，功能与结构相适应。(三) 一级结构与空间结构的关系1. 一级结构决定空间结构，并通过空间结构行使生物功能（）RNase是由124氨基酸残基组成的单肽链，分子中 8 个Cys的-SH构成4对二硫键，形成具有一定空间构象的蛋白质分子。在蛋白质变性剂（如8mol/L的尿素）和一些还原剂（如巯基乙醇）存在下，酶分子中的二硫键全部被还原，酶的空间结构破坏，肽链完全伸展，酶的催化活性完全丧失。当用透析的方法除去变性剂和巯基乙醇

29、后，发现酶大部分活性恢复，所有的二硫键准确无误地恢复原来状态。这表明，蛋白质的一级结构决定它的空间结构，特定的空间结构是蛋白质具有生物活性的保证。2. 蛋白质经激活之后才能形成正确的高级结构，形成有功能的活性蛋白由108个氨基酸残基构成的前胰岛素原(pre-proinsulin），在合成的时候完全没有活性，当切去N-端的24个氨基酸信号肽，形成84个氨基酸的胰岛素原（proinsulin），胰岛素原也没活性，在包装分泌时，A、B链之间的33个氨基酸残基被切除，才形成具有活性的胰岛素。 2.4 蛋白质的理化性质一、蛋白质的两性电离和等电点（）1. 蛋白质与氨基酸相似，也具有两性电离的性质。蛋白质

30、的多肽链含有末端氨基和羧基，一些侧链上含有可解离的基团，有的可以接受氢离子，有的可以电离出氢离子，因此蛋白质具有酸碱两性电离的性质。它的两性电离比氨基酸复杂。2. 对某一蛋白质而言，在某一pH下，当它所带正负电荷相等的时候，该溶液的pH就称为该蛋白质的等电点。实验中时常利用这一性质来分离纯化蛋白。蛋白质的等电点的大小与蛋白质的氨基酸组成有关。3. 电泳，带电蛋白质分子在电场中泳动的现象。二、胶体性质直径在1-100 nm范围内的质点所构成的分散体系为胶体，胶体形成的条件：1. 直径在1100 nm 之间，适合布朗运动2. 带有同种电荷，不易聚集形成大颗粒沉淀3. 质点能与溶剂形成溶剂化层三、蛋

31、白质的沉淀作用（） 对于蛋白质：直径在2 20 nm；分子表面为亲水，内部为疏水。适当pH下带同种电荷，使蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀。方法有：1. 盐析：在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸胺、氯化钠、硫酸钠等，使蛋白质从溶液中析出，称为蛋白质的盐析。而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。盐析的机理：破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。2. 有机溶剂沉淀法：在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。有机溶剂沉淀法的机理：破坏蛋白质的水化膜。有机

32、溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。3. 弱酸或弱碱沉淀法：用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电点处，使蛋白质沉淀。弱酸或弱碱沉淀法的机理：破坏蛋白质表面净电荷。4. 重金属盐沉淀（条件：pH 稍大于pI为宜）：在蛋白质溶液中加入重金属盐溶液，会使蛋白质沉淀。重金属沉淀法的机理：重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。重金属沉淀蛋白质会使蛋白质产生变性，长期从事重金属作业的人应多吃高蛋白食品，以防止重金属离子被机体吸收后造成对机体的损害。5. 生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI）生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。能

33、够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。生物碱试剂沉淀蛋白质的机理：在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。 “柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石”。四、蛋白质的变性作用（）1. 蛋白质变性的概念：天然蛋白质受物理或化学因素的影响后，使其失去原有的生物活性，并伴随着物理化学性质的改变，这种作用称为蛋白质的变性。2. 使蛋白质变性的因素1）物理因素：高温、高压、射线等。2）化学因素：强酸、强碱、重金属盐等3. 变性的本质蛋白质在物理化学

34、等因素作用下，蛋白分子中各种次级键遇到破坏，其空间构象从紧密有序的状态变成松散无序的状态，生物活性丧失，一级结构不破坏。4. 特征1） 生物活性丧失（功能上） 2） R基团暴露（结构上）1. 物化性质改变：溶解度增加，紫外吸收增加，粘度增加。4） 生化性质改变：结构松散易被酸解熟食易消化。5. 蛋白质复性: 变性的蛋白质在一定条件下，恢复或部分恢复其原有的生物活性的过程 ()。五、蛋白质的颜色反应（）蛋白质的颜色反应主要与其定性、定量测定有关 1. 茚三酮反应：反应生成蓝色化合物。2. 双缩脲反应：随着肽键的数目越多，颜色依次为粉红、紫红、紫、蓝。3. 酚试剂反应：生成蓝色的化合物。4. 考马

35、斯亮兰反应：生成蓝色的化合物。另外，蛋白质同样具有前面提到的氨基酸颜色反应六、蛋白质的紫外吸收特征（）蛋白质溶液能在近紫外区（280 nm有光吸收，主要是由带芳香环的氨基酸决定的。其对紫外光吸收能力的强弱顺序为：Trp Tyr Phe。 2.5 蛋白质的分离纯化一、蛋白质的分离纯的总的目标：增加蛋白制品的纯度（purifity）和比活性（specific activity），即增加单位蛋白质质量中所要的蛋白质的产量或生物活性。二、分离提纯的一般原则 （）分为前处理、粗分级和细分级三步，最终结晶获得纯品蛋白质1前处理。目的是破碎细胞，提取出蛋白质。方法有：1） 植物组织：砂研磨，纤维酶消化细胞壁

36、2） 动物组强：匀浆器破碎或超声波处理3） 细菌：超声破碎仪、砂研磨、高压挤压或溶菌酶2粗分级。目的是使目标蛋白与其它杂质蛋白初步分离，方法有：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离3细分级。目的是使目标蛋白进一步纯化。方法有：1） 层析法：凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析2） 电泳法：区带电泳、等电聚焦电泳、SDS-PAGE电泳。4结晶。三、蛋白质混合物分离方法（）根据蛋白质在溶液中的不同性质来分离：（1）分子的大小、（2）溶解度、（3）电荷、（4）吸附性质、（4）对其他分子的生物学亲和力。（一）根据分子的大小1透析只用于除盐类和小分子杂质2超滤除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质3凝胶层

37、析，又叫分子筛层析。分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的和人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。1） 具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。2） 常用分子筛： 葡聚糖凝胶（Sephadex） 型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐 琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA） 孔径大，用于分离大分子物质 聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）4密度梯度离心（二）根据溶解度差别1. 等电点沉淀和pH控制2. 蛋白质的盐溶和盐析3. 有机溶剂分级法4. 温度对蛋白质溶解度的影响（三）根据电荷不同1电泳法

38、1) 区带电泳2) 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。3) 凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。4) 聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。5) 自由界面电泳：支持物为溶液，很少用。2离子交换层析1) 吸附本质：非共价连接2) 常用吸附剂：结晶磷酸钙、硅胶3) 脱附方式：a. 改变蛋白质带电状态；b. 改变环境溶液的pH、离子强度等。四、蛋白质含量的测定和纯度鉴定 （）（一）含量的测定1. 凯氏定氮法2. Folin-酚试剂反应3. 紫外吸收法4. 考马斯亮蓝法5. 双缩脲反应二、纯度鉴定1各种细分级的方法

39、都可以用于纯度鉴定 常用各种电泳法，比较权威的有：等速电泳、梯度电泳、等电聚焦电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。2沉降分析和扩散分析 测定沉降系数和扩散系数。3溶解度恒定法 加入样品量为横坐标，样品溶解量为纵坐标，作图。如只有一个拐点则说明样品纯。第三章酶3.1 酶的一般概念一、 酶的概念及化学本质1、酶的概念 （） 酶是生物体活细胞产生的具有特殊催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质及核酸，又称为生物催化剂。2、酶的化学本质：绝大多数酶是蛋白质，少数是核酸RNA，后者称为核酶（）。3、酶的催化特性（）1） 催化效率高，是非催化反应108-1020；是非生物催化剂107-10132） 高度专一

40、性，指一种酶选择性作用于某一种或某一类底物3） 酶易失活4） 催化活性可以被调节控制二、酶的组成与分类根据酶的组成成分，酶可分为：1. 单成分酶（单纯酶）:其活性仅决定于它的蛋白质结构2. 结合酶（复合酶）：酶蛋白与辅助因子结合后形成复合物，才能发挥功能。 结合酶酶蛋白 (脱辅酶)辅助因子(辅因子)全酶全酶：结合蛋白质，包括酶蛋白（蛋白质部分）和辅助因子（非蛋白质部分）三、辅助因子的种类1、按结合程度（1）辅酶：与酶蛋白松弛结合，能透析（2）辅基：与酶蛋白共价结合，不能透析2、按化学成分分类（1）金属离子：常见酶含有的金属离子有K+、Na+、 Mg2+、Cu2+、(或Cu+)、Zn2+和Fe2

41、+(或Fe3+)等。 （2）小分子有机化合物：有机化合物：铁卟啉小分子有机化合物：维生素 其主要作用是在反应中传递电子、质子或一些基团四、维生素概念：维持生命机体正常生命过程所必需的一类微量小分子有机化合物。1、分类：脂溶性：VA、VD、VE、VK 水溶性：VB族、VC等2、维生素类的辅酶、辅基大多数维生素(特别是B族维生素)是组成许多酶的辅酶或辅基的成分。化学名称辅酶化学符号酶蛋白生化作用硫胺素 (VB1)焦磷酸硫胺素TPP脱羧酶转移羧基核黄素 (VB2)黄素单核苷酸FMN脱氢酶传递H黄素腺嘌呤二核苷酸FAD /FADH2吡哆醛 (VB6)磷酸吡哆醛/转氨酶转移氨基烟酰胺 (VB5)烟酰胺嘌

42、呤二核苷酸NAD/NADH/传递H烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸NADP/NADPH/传递H泛酸 (VB3)辅酶ACoA硫激酶或脱氢酶传递乙酰基叶酸 (VB11)四氢叶酸THFA或FHA /传递1个碳单位生物素 (VB7)生物素羧基蛋白BCCP脱羧酶转移羧基硫辛酸/脱氢酶传递H抗坏血酸 (VC)/VC羟化酶作为还原剂钴氨素 (VB12)5-脱氧腺苷钴胺素 / 变位酶 / 3.2 酶命名、分类及专一性 一、酶的命名与分类 (一)习惯命名法1. 底物命名法： 如淀粉酶，蛋白酶。2. 以反应性质命名： 如转氨酶，脱氢酶。3. 结合以上两个原则：如琥珀酸脱氢酶，-酮戊二酸脱氢酶。4. 加上酶的来源，特点：如胃

43、蛋白酶，木瓜蛋白酶(二)、系统命名法（） 1961年后，国际生化学会酶学委员会（Enzyme Commission，EC）制定。1、文字式：酶的名称包括两部分： 底物名称反应类型 如果反应中有多个底物，每个底物均需列出（水解反应中的水可省略），底物名称之间用“ ：”隔开。若底物有构型，也需标出。（1）乙醇脱氢酶 (习惯名) 乙醇：NAD + 氧化还原酶 (系统名) 乙醇 + NAD + 乙醛 + NADH + H+ (反应)（2）谷丙转氨酶 (习惯名) 丙氨酸：- 酮戊二酸氨基转移酶 (系统名) 丙氨酸 + - 酮戊二酸丙酮酸 + 谷氨酸 (反应)2、数字式（）(1) 根据酶所催化反应的性质，

44、由酶学委员会规定，将酶分为六大类：1) 氧化还原酶类：催化氧化还原反应 通式：AH2+BBH2+A 其中：A为质子供体，B为质子受体 如：乳酸脱氢酶催化的反应： 乳酸NAD+丙酮酸NADH + H+ 2) 转移酶类：催化底物之间基团的转移反应. 通式：AR+BBR+A 其中：R为转移基团，R不为H2如：己糖激酶、转氨酶、脂酰转移酶、糖基转移酶3) 水解酶类：催化底物的水解反应 通式：AB+H2OAH+BOH主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等例如：脂肪酶 (lipase) 催化脂的水解反应：4) 裂合酶类：催化底物裂解或缩合反应 通式： ABA+B主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等例如：延胡索酸水合酶催化的反应 5) 异构酶类 催化同分异构体的底物之间相互转换。 通式：AB 其中：A、B为同分异构 如磷酸甘油酸变位酶、6-磷酸葡萄糖异构酶。pp6) 合成酶类 也称连接酶类，催化两种或两种以上化合物合成一种化合物的反应。反应需吸收能量，通常与ATP的分解相偶联，ATP分解产生能量用于合成反应。 通