生物化学实验-2教案.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流生物化学实验-2教案.精品文档.酵母核糖核酸的分离及组分鉴定时间安排： 3 学时目的类型： 验证目的要求：1、了解核酸的组分2、掌握鉴定核酸组分的方法 实验原理： 酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。仪器： 研钵 锥形瓶 量筒 滴管 试管及试管架 烧杯 玻璃棒 表面皿 电子天平 离心机 恒温水浴锅 重要实验步骤与教学设计：1. 将2.5g酵母悬浮于5ml

2、 0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀,至少15分钟。将悬浮液转移至150ml锥形瓶中，再用15ml0.04mol/L氢氧化钠溶液两次洗涤乳钵。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。离心（3000r/min）15分钟，将上清液缓缓倾入15ml酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待RNA沉淀完全后，离心（3000r/min）3分钟。弃去清液，转移到表面皿中，沉淀在沸水浴上干燥，即为酵母RNA的粗制品。2. 将沉淀转移至小烧杯中，加入3当量/升硫酸6ml，在沸水浴中加热10分钟制成水解液并进行组分的鉴定。嘌呤碱：取水解液1ml加入约1ml 0.1mol/L硝酸银溶液，然后加入过量

3、浓氨水，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。核糖：取一支试管加入水解液1ml、三氯化铁浓盐酸溶液1ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。磷酸：取一支试管，加水解液1ml和定磷试剂1ml。在水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。实验注意事项 ：苔黑酚显色的特异性较差，凡戊糖都有此反应。准微量DNA无影响，较多DNA存在有干扰，在试剂中加入适量的CuCl2可减少DNA的干扰。小麦萌发前后淀粉酶活力的比较时间安排： 3 学时目的类型： 综合目的要求：1、学习分光光度计的原理和使用方法。2.学习测定淀粉酶活力的方法。3.了解小麦萌发前后淀粉酶

4、活力的变化。 实验原理： 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。麦芽糖有还原性，能使3，5-二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基5-硝基水杨酸。后者可用分光光度计法测定。休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌发后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增长而增加。本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。仪器 ：25ML刻度试管 吸管 研钵 离心管 分光光度计 离心机 重要实验步骤与教学设计：1.种子发芽 小麦种子浸泡2.5小时后，放入25恒温箱内发芽。2.酶液提取 取发芽第三天的幼苗5株，放入予冷的乳钵内，加海砂少许，加1%氯化钠溶液10mL,用力磨碎。在室温下放置20分钟

5、，搅拌几次。然后将提取液离心6分钟，3000r/min。将上清液倒入量筒，测定酶提取液的总体积。取1ml酶液，用缓冲液稀释10倍。取干燥种子5粒作为对照，（提取步骤同上）。3.酶活力测定（1）取试管4支，编号。按下表要求加入各试剂（各试剂须在25预热10分钟）。将各管混匀，放在25水浴中，保温3分钟后，立即向各管中加入1%3，5-二硝基水杨酸溶液2mL。（2）取出各试管，放入沸水浴中加热5分钟。冷至室温，加3.5mL蒸馏水稀释一倍，混匀。（3）用空白管作对照：在A500nm处测定各管的光吸收值，将读数填入下表。4.计算本实验规定：25时3分钟内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位

6、。根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，A标准=c标准总活力单位=c酶n酶V酶实验注意事项 ：酶液提取时，要使用-20预冷的乳钵酶的特性时间安排： 3 学时目的类型： 综合目的要求： 加深对酶的性质的认识内容：本实验由温度对酶的活力的影响；pH对酶活力的影响；酶的激活剂及抑制剂三组实验组成。(一)温度对酶活力的影响 实验原理：酶的催化作用受温度的影响，在最适温度下，酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适温度为3740，植物酶的最适温度为5060。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到100，其活性并无明显改变，但在I100的溶液中却很快地完全失去活性。低温能降低或抑制酶的活

7、性，但不能使酶失活。仪器 ：试管及试管架 恒温水浴 冰浴 沸水浴重要实验步骤与教学设计：取3支试管，编号后按下表加入试剂：摇匀后，将1号、3号两试管放人37恒温水浴中，2号试管放人冰水中。10分钟后取出，(将2号管内液体分为两半)用碘化钾碘溶液来检验1、2、3管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果，将二号管剩下的一半镕液放人37水浴中继续保温10分钟后，再用碘液实验，结果如何？(二) pH对酶活性的影响实验原理：酶的活力受环境pH的影响极为显著；不同酶的最适pH值不同。本实验观察pH对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适pH约为68。仪器 ：试管及试管架 吸管 滴管 50毫升锥形瓶

8、恒温水浴重要实验步骤与教学设计：从四个试剂瓶中各取缓冲液3毫升，分别注入4支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加0.5淀粉溶液2毫升和稀释50倍的唾液2毫升。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为1分钟。将各试管内容物混匀，井依次置于37恒温水浴中保温。第四管加入唾液2分钟后，每隔I分钟由第3管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化钾碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时，向所有试管依次添加12滴碘化钾碘溶液。添加碘化钾碘溶液的时间间隔，从第一管起，亦均为1分钟。观察各试管内容物呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。(三) 唾液淀粉酶的活化和抑制实验原理：酶的活性受活化剂或

9、抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。仪器 ：恒温水浴 试管及试管架重要实验步骤与教学设计：解释结果，说明本实验第3管的意义。实验注意事项 ：碘化钾-碘溶液只需加两滴，否则看不到明显的颜色变化。实验后记 ：SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳时间安排： 3 学时目的类型： 演示目的要求： 1、学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理2、掌握用SDS-PAGE凝胶电泳法测定蛋白质分子量的操作技术 实验原理： SDS是十二烷基磺酸钠的简称，它是一种阴离子表面活化剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其

10、数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质原有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所做的标准曲线，可求得未知物的分子量。仪器与基本操作 ： 电泳仪 垂直板电泳槽 移液管 100ML烧杯 细长头的吸管 微量注射器 重要实验步骤与教学设计：1准备步骤：将凝胶板依次用水、SDS、水、无水乙醇、水洗涤干净，然后使其自然风干或烘干。梳子临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。灭菌枪头、离心管2制备凝胶：安装玻璃板、板条、并将玻璃板固定在电泳槽中，以5%琼脂封底。配制10%的分离胶：依次将8ML蒸馏水，6.7ML30%丙烯酰胺储存液

11、，5ML1.5MOL/LTRIS溶液，0.2ML10%SDS溶液，0.2ML10%过硫酸铵，0.008MLTEMED混合，充分混匀2MIN，立即灌胶。混合后的凝胶溶液，用细长头的吸管加至玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘1CM。用吸管在凝胶表面沿玻璃边缘加一层蒸馏水，用于隔绝空气，使胶面平整。分离胶凝固后，可看到水与胶面有折射率不同的界限。倒掉蒸馏水，用吸水纸吸去多余的水。在分离胶聚合的过程中，配制5%的积层胶：依次混合5.5ML蒸馏水，1.3ML30%丙烯酰胺贮存液，1.0ML1.0MOL/LTRIS溶液，0.08ML10%SDS溶液，0.08ML10%过硫酸铵，0.008TEME

12、D。TEMED应在灌胶前加入。分离胶聚合完全后，倒去正丁醇，用蒸馏水冲洗胶面数次，用滤纸吸干胶面上的残余水。灌注积层胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。积层胶聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次，除去未聚合的丙烯酰胺。在上下电泳槽中加入足够的电泳缓冲液。 3、样品的制备在蛋白溶液中加入等体积德2倍样品缓冲液，使蛋白的终浓度为3-4MG/ML，混合液在沸水浴中加热3分钟，冷却后即可上样。4、上样用微量进样器上样，每加入一种样品，应在下槽中洗涤加样器数次，最后在空白加样孔中加入等体积德SDS样品溶解液。5、电泳装好冷凝水系统，打开电源，初始电压为100-120V，当染料

13、进入分离胶后，将电压提高到200-220V，继续电泳直到染料到达离胶底部1CM处。6、后处理固定：从电泳装置上卸下玻璃板，用镊子小心撬开玻璃板，除去积层胶部分，将分离胶移入固定液中固定，直至染料由蓝绿色变为黄色。染色：除去固定液，加入染色液，室温染色8小时。脱色：回收染色液，将凝胶浸泡于脱色液中，直至背景脱至无色，其间更换脱色液3-4次。实验注意事项 ：N，N-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用时应避免其直接接触皮肤，必要时应戴手套，但其凝固后就变成无毒物质。实验后记 ： 酶的专一性时间安排： 3 学时目的类型： 验证目的要求： 加深对酶的性质的认识实验原理：酶具有高度的专一

14、性。本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。淀粉和蔗糖无还原性，唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解，蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解，用Benedict 试剂检查糖的还原性。仪器 ：恒温水浴 沸水浴 试管及试管架重要实验步骤与教学设计：(1)淀粉酶的专一性： 解释实验结果(提示：唾液除含淀粉酶外近合有少旦麦芽糖酶)。 (2)蔗糖酶的专一性：解释实验结果。实验注意事项 ：蔗糖酶从酵母粉中提取，需保存冰箱中备用实验后记 ：维生素C的定量测定时间安排： 3 学时目的类型： 验证目的要求： 1.学习维生素C定量测定法

15、的原理和方法2. 进一步熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技能 实验原理： 还原型抗坏血酸能还原染料2，6二氯酚靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏血酸。在酸性溶液中，2，6二氯酚靛酚呈红色，被还原后变为无色。因此，可用2，6二氯酚滴定样品中还原型抗坏血酸。当抗坏血酸全部被氧化后，稍多加一些染料，使墒定液呈谈红色，即为终点。如无其他杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所合的还原型抗坏血酸量成正比。仪器 ：乳钵 吸量管 酸式滴定管 锥型瓶 容量瓶 纱布 重要实验步骤与教学设计：制备含维生素C的样品提取液称取30g绿豆芽在乳钵中研磨，放置10分钟，用2层纱布过滤，将滤液滤入50ML容量瓶中。最后，

16、用酸化的蒸馏水定容，混匀，备用。量取样品提取液10ml于锥形瓶中，以2，6二氯酚靛酚溶液滴定样品提取液，呈微弱的玫瑰色，持续5秒钟不褪为终点，记录所用2，6二氯酚靛酚的ml数，整个滴定过程不要超过2分钟。另取10ml用10%盐酸酸化的蒸馏水做空白对照滴定。样品提取液和空白对照各做三份。计算：V滴定时所用去染料m1数。T=1m1染料能氧化抗坏血酸mg数。W10 m1样液相当于含样品之g数。实验注意事项 ：1 整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过2分钟。2 提取得浆状物如不易过滤，亦可离心，留取上清液进行滴定。实验后记 ：凝胶过滤法测定蛋白质的相对分子量时间安排： 3

17、学时目的类型： 演示目的要求： 1.学习凝胶过滤法的操作方法2. 学习使用凝胶过滤法测定蛋白质的相对分子量 实验原理： 葡聚糖凝胶过滤法测定蛋白质分子量的原理，主要是依据这种凝胶具有分子筛作用，一定型号的凝胶具有大体上一定大小的孔径。在一定的凝胶柱内，凝胶孔隙所占的体积称为内水容积vi,凝胶颗粒间的自由空间所占的体积称为外水容积v0。当样品流经凝胶柱时，大于孔隙的大分子完全不渗入到凝胶内部，只需v0体积的洗脱液便可将其由一端洗脱到另一端，相反，如果样品体积小于孔隙，则需要v0+vi体积的洗脱液，才能将它们由一端洗脱到另一端。中等分子所需洗脱液体积介于两者之间。如果假定蛋白质分子近于球形，同时没

18、有显著的水合作用，则不同大小分子量的蛋白质，进入凝胶筛孔的程度不同，其洗脱体积决定于分子大小。当蛋白质分子量在10000-15000时，蛋白质在葡聚糖凝胶柱上层析的洗脱体积和分子量的对数呈直线关系。若用已知分子量的标准蛋白质在一定型号葡聚糖凝胶柱上层析，精确测其洗脱体积，并以洗脱体积ve对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知分子量的蛋白质在相同条件下层析，根据其洗脱体积即可在标准曲线上求得分子量。试剂准备 ：牛血清白蛋白(MR67000)，胃蛋白酶(MR未知)，溶菌酶（MR 14300），细胞色素C（MR12800）重要实验步骤与教学设计：一 溶胀凝胶取葡聚糖凝胶G-1003克，加200

19、ml蒸馏水，沸水浴中溶胀5小时。待溶胀平衡后，倾去上层清液，包括细颗粒，然后再放些蒸馏水搅乱，静置使凝胶下沉，再倾去上层清液，至无细颗粒为止。溶胀平衡和漂洗净的凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。二 装柱层析柱必须粗细均匀，柱管大小可根据试剂需要选择。一般柱直径为1厘米，如果样品量较多，最好用直径2-3厘米的柱。通常柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长而且样品稀释度大，易扩散，反而分离效果不好。当用作脱盐时，柱高度为50厘米比较合适，在进行分级分离时，100厘米高度就够了。装柱时，将柱垂直于铁架上。在柱中加约1/3柱体积的洗脱液，并赶净滤板下方气泡，然后将柱的出口关闭。把已经溶胀好的凝

20、胶调成薄浆，倾入柱内，胶粒逐渐扩散下沉。当沉积的胶床至2-3厘米高时，打开柱的出口，并注意控制操作压以均匀不变的流速直到胶装完为止。柱装好后，在床的上面盖上一张大小小于柱内径的滤纸片。再以洗脱液平衡柱层，直至层析的胶床高不变为止。三 上样称取2毫克蓝色葡聚糖2000四份，分别放在称量瓶中，再称取标准蛋白牛血清白蛋白，胃蛋白酶，溶菌酶，细胞色素c各40毫克，分别放在各称量瓶中，各瓶加入n-乙酰酪氨酸乙酯饱和溶液2ml，使混合物溶解后分别上柱。上柱时尽量保持床面的稳定。先打开柱的出口，待柱中洗脱液流至距床表面1-2毫米时，关闭出口，用滴管将样品缓缓加至柱床表面，打开出口并开始计算流出体积，当样品渗

21、入床中接近床表面1毫米时关闭出口，小心的加入少量洗脱液，再打开柱的出口，使床表面的样品也全部渗入柱内。在床的表面再小心的加洗脱液，使高出床表面3-5厘米。四 收集和鉴定层析开始，在柱的出口处以试管分管收集流出液，流速为0.4ml/min,4ml/管，收集液在280nm处测od值。最高的一个od值时的体积为吸收峰的洗脱液体积VE，当n-乙酰酪氨酸乙酯洗脱峰出现后，按同样的方法进行第二个标准蛋白质样品的上柱，操作方法和步骤同前。将各标准蛋白质测得的洗脱液体积对它们的分子量对数作图，则应获得一线性的标准曲线。实验注意事项 ：1 根据层析柱的容积和所选用的凝胶溶胀后容积，计算所需凝胶干粉的重量，以将用

22、作洗脱剂的溶液使其充分溶胀。2 装柱要均匀，不要过松也不要过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不易过快，但也不要过慢，使柱装得过松，使层析过程中，凝胶床高度下降。3始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。实验后记 ：微机模拟蛋白质纯化实验时间安排： 3 学时目的类型： 设计目的要求： 1. 通过微机模拟蛋白质纯化实验，使学生对几种常用的生物大分子分离纯化技术有一个更全面的认识。2. 建立起对生物大分子分离纯化的比较严谨的思考方法。 实验原理：“Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋白。任务要求利用软件提供的几种实验技术，提纯每一个目的蛋白，最终达到单向电泳一条带

23、，双向电泳一个点，而且使用的人时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过一个特定值。在每个任务开始时，软件给出目的蛋白的一些性质，如热稳定的温度范围和pH稳定范围等，利用这些信息，可以使实验少走弯路。 “Protein”提供的分离纯化方法有七种：热变性；硫铵沉淀；排阻层析(凝胶色谱)；离子交换层析；吸附层析；聚焦层析；制备电泳。 例如，在使用层析方法时，可在Chromatography菜单下点选上述四种层析方法，弹出相应的参数对话框，此时要求输入柱长、内径、柱填料类型、缓冲液组分及pH值和洗脱速度等。如果采用梯度洗脱，还要求输入梯度洗脱的初始和终末浓度及洗脱体积，在输入参数之后，计算机模拟洗脱过

24、程，并且画出A280洗脱曲线和酶活曲线，此时，可以根据分离的情况和酶活的峰位来收集组份，在收集之前还可以用电泳查看洗脱曲线上某一部位的分离效果。在确认收集之后，“Protein”软件记录该步操作的条件，计算回收率、纯化倍数以及消耗的人时和经费等。 经过反复多次的模拟实验，初步纯化了目的蛋白，在双向电泳图上能够确定该蛋白质的分子量和等电点之后，还需要重新对其各步骤的实验条件，尤其是离子交换层析、排阻层析和制备电泳等实验步骤的实验条件进行修改，以找到适合该蛋白质的最佳分离纯化实验方案和实验条件。 在“Protein”所提供的各种分离纯化方法中，热变性法和盐析法是比较好的粗提方法，在提纯的早期使用效

25、果较好。层析是各种方法中最强有力的方法，制备电泳虽然纯化倍数高，但是回收率低。在各种层析方法中，又以离子交换层析最为有效和易于使用，并且耗费的人时和经费也较少。排层层析和聚焦层析耗费较大，但在某些特定情况下，这两种方法是不可替代的。 “Protein”提供了四种电泳方法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。这些电泳方法不但可以用以检测样品的纯度，而且也给出了样品的一些信息，如分子量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以用于制备。仪器 ：电脑 重要实验步骤与教学设计 ：以酸性条件下稳定的蛋白（Windows 10号酶）为例：10号酶在5

26、6以下稳定，稳定pH范围26.7（酸性条件）。（1）分离纯化步骤：A) 硫铵沉淀：初始百分饱和度0，终末百分饱和度40(质量分数)，收集溶液组分B) 热变性：水浴温度55，水浴时间60minC) 离子交换层析：填料DEAESephadex A-50，柱长：10cm，柱内径：2.0cm，缓冲体系：磷酸氢二钠-Citrate（2.28.0），pH 6.5，流速：0.3ml/min，离子强度梯度洗脱：0.01mol/L-0.15mol/L，洗脱体积：300ml管100ml管，做如下检验。（2）检测纯化结果：A)二维电泳，pH 310，分离胶浓度10(体积分数)，浓缩胶浓度3(体积分数)。B)PAGE

27、：分离胶浓度10(体积分数)，浓缩胶浓度3(体积分数)，缓冲体系：磷酸二氢钾-NaOH，pH 8.0（3）各步分离纯化列表：(4)实验结果分析：10号酶Mr约为50 000，pI6.5，稳定pH 26.7，稳定温度56。(5)总结对5号酶这种稳定温度较高，硫铵沉淀效果较好的样品，宜先进行这两种操作，以除去大量杂蛋白。当然并不是非用不可。实验注意事项：在保证纯化效果的前提下，找到一条消耗人时和经费较少的优化方案，需要经过多次试验。 实验后记 ：实验十 蛋白质含量定量测定紫外吸收法时间安排： 3学时。 目的类型：设计目的要求：学习紫外分光光度计的使用方法；掌握紫外吸收法测定蛋白质含量的原理和方法实

28、验原理：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处有最大吸收，使蛋白质在280nm波长处有最大吸收值。在一定浓度范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量成正比关系，可用作定量测定。 试剂 器材1. 试剂：牛血清蛋白标准液：以0.9%NaCl作溶剂，蛋白质浓度为1mg/ml；未知浓度蛋白质溶液：12.5mg/ml。2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管 实验操作1. 标准曲线的绘制：取四支试管，按下表编号并加入试剂：试 剂管 号12341mg/ml标准蛋白溶液（ml）01.02.04.0蒸馏水（ml）43.02.00蛋白质浓度（mg/ml）00.250.501.00OD280 加毕，混匀，用紫外分光光度计测OD280，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图，回归出线性方程，显示R2。 2. 取未知浓度蛋白质1.0ml，加蒸馏水3.0ml，混匀，测OD280，利用回归方程计算蛋白质浓度。