生物化学课件.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流生物化学课件.精品文档.窗体顶端窗体底端窗体顶端窗体底端%name% 普通生物化学第一章导论重点:生物化学的概念、研究内容；生物化学与其他学科的关系。第一节 生命、细胞和生物分子一、生物分子生物分子是含碳化合物碳能形成四个共价键与自身形成共价键与H、O、N形成共价键被键合碳原子周围四个共价键的四面体性质便于碳形成线性、有分支的或环状的化合物， H、O、N的参与更扩大其多样性。生物分子是分级的代谢物和大分子前体物：水、二氧化碳和三种无机氮化合物代谢物：简单有机物细胞能量转化和合成大分子的构件时的中间物构件：小分子化合物大分子：构件分子通过共价键

2、构成超分子复合物：一类或几类大分子中不同成员相互作用聚集形成具重要亚细胞功能的特殊装配体。细胞器膜二、细胞是生命的基本单位三、生物分子的特性方向性某些生物大分子是信息分子具特征性结构非共价作用力维持生物大分子的结构结构互补性影响生物分子的相互作用和生命状态生命活动限制在窄小环境范围内第三节 生物化学与其他学科的关系（一）生物化学的概念、研究内容概念：生物化学(Biochemistry)：研究生命现象化学基础的一门科学。研究内容： 静态生物化学：构成生物体的基本物质的结构、性质及结构与功能的关系。动态生物化学：生物体基本化学成分在生命活动过程中的化学变化规律。信息生物化学：核酸生物合成，蛋白质生

3、物合成，物质代谢与基因表达的调控等。 现代生物化学与分子生物学研究的重点和热点：功能基因组学（functional genomics）；蛋白质组学（proteomics）；细胞信号转导（signal transduction）等。（二）生物化学的研究发展简史准备和酝酿阶段（18c中期-20c初）：研究生物体的化学组成建立与发展阶段(20c初-20c中叶)：重要分子的发现和物质代谢途径的确定深入发展阶段(20c中叶-20c末)：分子生物学时期黄金时期（本世纪初）：后基因组时期我国科学家的贡献：1965年，结晶牛胰岛素：1981年，酵母丙氨酰tRNA：人类基因组计划（1%）等等。（三）生物化学与其

4、他学科的关系化学是学习生物化学的基础课程。随着生物学研究深入，物理学、数学及信息学也渗透到生物化学中。生物化学是生物学各学科的最基础的学科，生物化学的进步极大地推动了生物学各学科的发展。分子生物学（Molecular Biology）：从分子水平认识和研究生命现象的科学，是生物化学学科的重要组成部分。生物化学是医学的一门重要基础课程，为其提供必要的理论基础生物化学是食品学的一门基础课程，为其提供必要的理论基础。（四）学习内容静态生物化学：蛋白质、酶、维生素、核酸动态生物化学：糖类、脂类、蛋白质、核酸代谢信息生物化学：核酸生物合成，蛋白质生物合成，物质代谢与基因表达调控 小结：生物化学的概念、研

5、究内容；生物化学与其他学科的关系。第二章、第三章蛋白质化学重点：蛋白质组成、结构、性质及蛋白质的结构与功能的关系；蛋白质的分离、纯化和鉴定。蛋白质重要性：是构成生物体的基本成分，生命活动的执行者,生命的物质基础。蛋白质的生物学功能：生物催化；代谢调节；免疫保护；物质转运和贮存等。蛋白质的分类：按组成分类：单纯蛋白质和结合蛋白质按肽链数目分类：单体蛋白质和寡聚或多体蛋白质按功能分类:非活性蛋白和活性蛋白按溶解度分类：可溶性蛋白质、醇溶性蛋白质和不溶性蛋白质按分子形状分类：纤维状蛋白质、球状蛋白质和膜蛋白。(一)蛋白质的结构一、蛋白质的元素组成：C（5055%）、H（68%）、O（2023%）、N

6、（1518%）、 S（04%）、P、I、Se等，特点：氮元素的含量平均约16%凯氏（Kjadehl）定氮法二、蛋白质的结构单位 氨基酸 (amino acid)蛋白质氨基酸：编码氨基酸（标准或基本氨基酸：20种）和非编码氨基酸1、氨基酸的结构通式：结构特点：（1）C结合（-NH3+）、（-COOH）、H原子和各种侧链（R）（Pro除外）；（2）C是不对称C，具有手性（Gly除外），蛋白质氨基酸都是L-型。2、氨基酸的分类：来源；营养学；侧链（R）。根据R的化学结构：（1）脂肪族氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser

7、、Thr；（2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr；（3）杂环氨基酸：Trp、His；（4）杂环亚氨基酸：Pro。根据R的极性：（1）非极性、疏水性氨基酸：R为烃基、苯甲基等；（2）极性、中性氨基酸：R为羟基、巯基、酰胺基等；（3）极性、酸性氨基酸；（4）极性、碱性氨基酸。胱氨酸和二硫键3.氨基酸的理化性质(1).一般物理性质：无色或白色结晶，熔点200，不同味道；均可溶于强酸、强碱和水，不溶于有机溶剂。(2).两性电离性质：氨基酸分子带有能解离出质子的NH3+正离子和能接受质子的COO-负离子。结合或释放质子取决于环境pH。等电点（pI：Isoelectric point)：在一定pH环境下，氨基

8、酸游离成阴、阳离子的程度及趋势相等或为兼性离子(Zwitterion)，氨基酸溶液的净电荷为零在电场中既不向阳极也不向阴极迁移时的pH值。 等电点的确定：酸碱滴定（滴定曲线）； 根据pK值（等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数）。侧链不含离解基团的中性氨基酸：pI = (pK1 + pK2 )/2 侧链含有可解离基团的氨基酸：酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2 (3).紫外吸收性质：20种氨基酸可见光区：都没有光吸收远紫外区(220nm)：均有光吸收近紫外区(220-300nm)： 酪氨酸、苯丙氨酸和色氨

9、酸有光吸收Trp、Tyr和Phe含共轭双键苯环，280nm处有最大吸收峰。分光光度法：测定蛋白质的含量，也可粗略估计核酸中蛋白质污染程度(A260/A280 pKa：共轭碱形式（-COO -，NH2），pHpI,蛋白质带负电,体内蛋白质的pI多5左右,生理条件下一般负离子；等电点pH时为两性离子。（2）各蛋白质的一级结构不同，pI不同，荷电种类和数量也不同。（3）应用：等电点沉淀、离子交换层析和电泳。电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）：是依据流动相中的组分离子与离子交换剂（固定相）上的平衡离子进行可逆交换时的结合

10、力大小的差别而进行分离的一种层析方法。阴离子交换层析基本分离过程：阴离子交换剂装柱平衡（RX+Y-）加样（待分离溶液：可能有正电基团、负电基团和中性基团）：负电基团（A-）与平衡离子（Y-）进行可逆置换，结合到离子交换剂上（RX+A-）。正电基团和中性基团不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。洗脱；洗脱液中的离子与结合在离子交换剂上的各种负电基团（A-）进行置换，各种负电基团（A-）按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来，随洗脱液流出。2、蛋白质的亲水特性（1）、球状的水溶性蛋白亲水基团分布于分子表面，疏水基团由疏水作用聚合在分子内部。（2）、分子表面的亲水基团与周围水分子结

11、合形成水化层(水膜)。（3）、分子表面的亲水基团可结合或释放H+,带一定电荷，水溶液中蛋白质颗粒带相同电荷。3、蛋白质的胶体性质：蛋白质水溶液是稳定的胶体溶液，具有胶体溶液的特点。蛋白质胶体溶液稳定的原因：1）胶体颗粒直径；2）表面形成水膜（水化层）；3）带相同电荷。4、蛋白质的沉淀反应：破坏胶体溶液稳定的因素。（1）、中性盐沉淀反应：高盐破坏水膜、中和电荷,蛋白质聚集沉淀盐析，蛋白质不变性。盐溶作用：稀盐使蛋白质表面同性电荷增加，增加蛋白质分子间的排斥,同时与水分子间的作用增强,而增加溶解性。分级（段）盐析：不同蛋白质盐析的盐浓度不同,用不同盐浓度分级沉淀蛋白质。（2）、有机溶剂沉淀反应：用

12、与水互溶的乙醇、丙酮等夺取水膜,等电点时加入更易沉淀,易引起变性（与有机溶剂浓度、作用时间和沉淀温度有关）。（3）、重金属盐沉淀反应：蛋白质在体内一般为负离子,可与Cu2+，Hg2+，Ag+和Pb2+等结合为不溶性蛋白盐而沉淀。（4）、生物碱试剂的沉淀反应：蛋白质在pHpI时带正电荷,可与苦味酸、磷钨酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水杨酸等结合沉淀。（5）、加热沉淀反应 ：蛋白质热变性沉淀，等电点时最易沉淀。凝固：变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象。5、蛋白质的变性与复性（1）、蛋白质变性:概念：在理化因素作用下,蛋白质分子内的二硫键和非共价键被破坏,分子内部原有的高度规律性的空间排列发生变化，天然构

13、象发生变化,引起蛋白质理化性质和活性的改变（原有性质发生部分或全部丧失）。变性本质:空间构象的改变或破坏。变性特征:1）生物活性丧失（主要标志）。2）理化性质改变：分子形状改变，肽链松散伸展，反应基团增加，易被水解,易被酶消化。蛋白质变性后亲水基团被掩埋,溶解度降低、失去水膜，易形成沉淀析出;但若溶液pH与蛋白质的pI差别较大,蛋白质仍不易沉淀。球状蛋白质的不对称性增加、粘度增加、扩散系数降低,某些蛋白质结晶能力丧失。（2）、蛋白质复性：有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。6、蛋白质的其它特性（1）、紫外吸收特性：Trp、Tyr、Phe等氨

14、基酸残基可特异地吸收紫外光:max=280nm（2）、颜色反应双缩脲反应：肽键与碱性铜溶液产生兰色络合物，肽键越多颜色越深。用于蛋白质定性定量和检测蛋白质水解程度。酚试剂反应：碱性条件下,Tyr和Trp可与含磷钨酸-磷钼酸的酚试剂化合物生成兰色物,兰色强度与蛋白质量成正比,测定蛋白质常用方法。米伦反应、黄色反应、乙醛酸反应(Hopking-Cole反应、坂口反应(Sakaguchi反应)、茚三酮反应等。二、蛋白质的分离纯化蛋白质研究基本步骤：一般温和物理方法（盐析、透析、电泳、层析和超速离心等）提取和纯化蛋白质；测定氨基酸组成，分析氨基酸顺序；确定空间结构（X射线衍射法、NMR或生物学软件推测

15、）并进行生物学活性的鉴定。1、生物大分子的制备（1）、生物大分子制备的特点(与化学产品的分离制备比较)1）许多生物大分子含量微，耗用生物材料多；2）分离纯化的步骤多，流程长；3）分离纯化方法差别大，没有标准方法；4）生物大分子极易失活，分离纯化时要选用最适宜的环境和条件防止失活；5）制备中各种参数的综合影响，很难准确估计和判断，实验的重复性较差；6）制备过程复杂困难，更需百折不挠的钻研精神。（2）、生物大分子制备的基本步骤1）确定制备目的和要求；2）掌握目的产物的物理化学性质；3）建立相应的可靠的分析测定方法；4）生物材料的破碎和预处理；5）选择和探索分离纯化方案；6）纯度鉴定；7）产物的浓缩

16、，干燥和保存。2、蛋白质的制备（1）、前处理：1）选择适当的生物材料（适合制备的目的和要求；尽可能保持新鲜）。2）加工处理：动物组织除结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎；植物去壳、除脂；微生物材料及时将菌体与发酵液分开3）破碎细胞机械法：研磨；组织捣碎器物理法：反复冻融法；超声波；压榨法；冷热交替法化学与生物化学方法：自溶法；溶胀法；酶解法；有机溶剂处理法。4）提取蛋白质：目的蛋白保持天然状态充分释放到溶剂中。水溶液：稀盐溶液和缓冲液。通常05使用0.02mol/L0.05mol/L缓冲液或0.09mol/L0.15mol/LNaCl溶液pH=68(偏离等电点的两侧)提取蛋白质和酶。加入抑制剂或

17、调节提取液的pH、离子强度或极性使蛋白酶或核酸酶失活；加入少量巯基乙醇或半胱氨酸防止巯基氧化。有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等（2）、分离纯化：依据目的蛋白与杂质之间的物理化学和生物学性质上的差异，选择正确的分离纯化方法（分离纯化方案）1）分离纯化方法以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。以溶解度的差异为依据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等 2）早期和晚期的分离纯化方法早期分离纯化（粗分级）：除去大部分与目的产物

18、物理化学性质差异大的杂质。方法：吸附；萃取；沉淀法（热变性、盐析、有机溶剂沉淀等）；离子交换；亲和层析等快速、粗放；能较大地缩小体积；分辨力不太高；负荷能力大。晚期分离纯化（细分级）：除去与目的产物物理化学性质差异小的杂质。方法：吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦制备电泳、制备HPLC等。3）蛋白质含量测定与纯度鉴定：含量测定：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法，标准测定方法）、紫外吸收法、染料（考马斯亮蓝）结合法、胶体金法。均一性的鉴定：电泳、离心沉降、HPLC和溶解度分析等（同时采用23种不同的纯度鉴定法确定）。（3）、样品浓缩、干燥和保存：浓缩：减压加温蒸发浓缩；空气流动蒸发浓缩；冷冻干燥法；吸收法；超滤法；透析法等。干燥：冷冻或真空干燥，然后分装并写明标签。保存：2070保存（液态样品不能太稀，一般需加入防腐剂和稳定剂。）小结：蛋白质组成、结构、性质及蛋白质的结构与功能的关系；蛋白质的分离、纯化和鉴定。