生物技术引论与实践教材.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流生物技术引论与实践教材.精品文档.生物技术引论与实践新疆农业大学农学院生物技术系2011年8月前 言现代生物技术是以生命科学为基础，利用生物（或生物组织、细胞及其他组成部分）的特性和功能，设计、构建具有预期性能的新物质或新品系，以及与工程原理相结合，加工生产产品或提供服务的综合性技术。包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术、发酵工程等。这门技术内涵十分丰富它涉及到：对生物的遗传基因进行改造或重组，并使重组基因在细胞内表达，产生人类需要的新物质的基因操作技术（如“克隆技术”）；从简单普通的原料出发，设计最佳路线，选择适当的酶，合成所需功能产

2、品的生物分子工程技术：利用生物细胞大量加工、制造产品的生物生产技术等等。从生物技术的发展来看现在已经深入到我们社会生产和生活的很多领域里，这是生物学发展的必然趋势。现代生物技术日益应用到社会生产的各行业中，农业生产中的繁殖控制技术、动、植物育种、农作物病虫害的综合防治、动物疫病的控制、绿色食品的生产；工业生产中生物催化制造、生物技术药物和疫苗生产等都广泛的采用了现代生物技术。所以，现代生物技术的范围已经覆盖了生物类专业的各个领域，对于生命科学类专业的学生，掌握现代生物技术的原理和实践，具有现代生物技术应用必备的专业理论知识和较熟练的综合技能，才能成为适应生物技术生产、技术服务及相关专业第一线需

3、要的高技能人才。本教材正是在上述背景下编写的，旨在提高生命科学类专业学生的生物技术理论知识和实践技能。本教材以现代生物技术的核心“基因工程技术”为主要内容；以试验设计的整体性，连贯性为主要出发点；各试验之间即独立又相互联系，前一个实验的结果又是后一个实验的材料，使学生在掌握基础理论和技术的同时，树立全面、整体的试验观念。其中实验一到实验十二是核心实验内容，包括了以大肠杆菌为代表的微生物实验技术、基因克隆技术、基因表达技术和蛋白质研究技术，且各实验相互连续，构成一个整体。后续的实验是现代生物技术的相关技术，包括动、植物转基因技术，分子标记技术、分子检测技术以及生物信息学研究方法，可根据专业不同选

4、择开设。本教材是由新疆农业大学多年从事植物生物技术、动物生物技术的教师共同编写而成，所有参与教材编写的老师都认真负责的编写各自的章节，为教材保质保量的完成做出了重要贡献，在此深表感谢。由于现代生物技术的发展十分迅速，编者虽尽力吸收各方面的研究材料，但限于作者水平，纰漏之处在所难免，希望读者不吝惠予指正。目 录（实验教材编写分工）实验一：大肠杆菌液体培养基和固体筛选培养基制备 顾爱星实验二：大肠杆菌工程菌平板培养 顾爱星实验三：PCR扩增目的基因片段 葛 杰实验四：回收目的基因片段与载体连接 张 桦实验五：大肠杆菌液体培养 罗 明实验六：大肠杆菌感受态细胞制备及转化 罗 明实验七：筛选重组转化菌

5、落 张 桦实验八：菌液PCR分析 葛 杰实验九：提取大肠杆菌重组质粒DNA和酶切分析 张 桦实验十：培养工程菌诱导外源基因表达 王希东实验十一：蛋白质分离纯化技术 王希东实验十二：SDS-PAGE检测外源基因的表达 王希东实验一 大肠杆菌液体培养基和固体筛选培养基制备一、实验目的1了解培养基制备的基本原理，掌握培养基制备的方法和步骤。2了解灭菌的基本原理，学习并掌握实验室常用的灭菌方法。二、实验原理1培养基按物理状态分为：液体、固体、半固体三种。（1）液体培养基：不含任何凝固剂。（2）固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂，通常1.52.0琼脂，从海藻（石花菜）中提取得到的多糖，融化温度95，凝

6、固温度45。（3）半固体培养基：0.20.7琼脂，一般观察细菌运动。2培养基按成分分为：（1）复合（天然）培养基：以天然有机物质为主要成分的培养基。采用动植物组织或微生物细胞或它们的提取物或粗消化产物配制而成。如牛肉膏蛋白胨培养基、LB培养基。（2）合成培养基：用化学纯的营养物质配制而成。确切知道其中所含营养成分的化学性质和数量。如高氏1号培养基、察氏培养基。（3）半合成培养基：用纯化学试剂和天然有机物质配制而成。如马铃薯蔗糖培养基，马丁氏培养基。3灭菌（sterilization）：采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称之为灭菌。4高压蒸汽灭菌：在密闭的高

7、压蒸汽灭菌器（锅）中进行。其原理是将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内。把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气驱尽后将锅密闭，再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100以上。为达到良好的灭菌效果，一般要求温度应达到121（压力为0.1MPa），时间维持在1530min。此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构和发酵工厂中对培养基及多种器材、物品的灭菌。5火焰灭菌：微生物接种工具如接种环、接种针或其他金属用具等，可直接在酒精灯火焰上灼烧灭菌。此外，接种过程中，试管或三角瓶口等，也可通过火焰灼烧灭菌。6干热灭菌：用干燥热空气杀死微生物的方法。通常将灭菌物品置于

8、鼓风干燥箱内，在160170加热12h。玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等凡不适合用其他方法灭菌而又能耐高温的物品都可用此法灭菌。但是，培养基、橡胶制品、塑料制品等不能使用干热灭菌。三、实验内容1配制LB液体培养基、LB固体培养基、氨苄青霉素(ampicillin)溶液。2准备无菌培养皿、注射器、针头。3培养基及器皿的高压蒸汽灭菌。四、实验试剂、耗材和用具双蒸馏水、胰蛋白胨、NaCl 、酵母提取物（bacto-yeast extract）、琼脂粉、氨苄青霉素钠盐。试管、三角瓶、培养皿、刻度搪瓷杯、量筒、pH试纸、天平、记号笔、牛皮纸、硅胶塞、注射器、针头、不锈钢饭盒、纱布、线绳等。托盘天

9、平、不锈钢锅、电磁炉、煤气灶、铁架、分液漏斗、高压蒸汽灭菌锅。五、操作步骤（一）培养基配制培养基配制的大体流程如下：药品称量加水溶解定容调pH值分装塞棉塞包扎灭菌LB（Luria-Bertani）培养基的配方：双蒸馏水1000mL，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母提取物（bacto-yeast extract）5g，调pH值7.0。固体培养基需加入琼脂粉1520g。原料称量根据培养基配方，按实际用量计算后，称取各种试剂放入容器（常用烧杯或不锈钢锅）中。1加热溶解：在容器中加入所需要的水量，然后加热，同时用玻璃棒搅拌至沸腾，将火调小，至药品完全溶解。在加热过程中应不断搅拌，以防琼脂粉沉淀糊

10、底烧焦，并应控制火力，以免培养基起泡而溢出容器。待琼脂粉完全融化后，再用热水补足因蒸发而损失的水分。2调节pH：检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加 1mol/L NaCl（约1mL），边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。3过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布过滤。4分装：将配制的固体培养基分装入三角瓶中，每瓶100mL，将液体培养基分装入试管（液体培养基）中，每管5mL。分装时用三角漏斗连接软橡皮管和玻璃管，以免培养基沾在瓶口或管口上而造成污染。5加棉塞：三角瓶口塞上用普通棉花（非）脱脂棉制作的棉塞，试管口塞上硅胶塞，起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。6包

11、扎：加塞后，管装培养基可若干支扎成一捆，将管口或三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。在制备培养基的过程中，应注意以下事项：1注意培养基分装时避免其沾污三角瓶口、试管口。2严格按照高压蒸汽灭菌的灭菌指标（温度、压力、时间）对培养基、器皿灭菌，确保灭菌彻底。（二）准备无菌培养皿、注射器、针头将每6个培养皿同一方向，摞成一叠，用报纸包扎。灭菌后即成无菌培养皿。用不锈钢饭盒装注射器和针头。（三）灭菌：将上述培养基和培养皿、注射器、针头于121高压蒸汽灭菌20min。如延误时间，则可能因杂菌繁殖孳生，导致培养基变质而不能使用。若确实不能立即灭菌，可将培养基暂放在4冰箱或冰柜中

12、，但时间也不宜过久。（四）氨苄青霉素溶液制备溶1g的氨苄青霉素钠盐于足量的双蒸馏水中，最后定容至10mL。分装成小份于-20贮存。常以25g/mL50g/mL的终浓度添加于生长培养基。灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长1/2。无菌检查：将灭菌的培养基放入37温箱培养2448h，无菌生长即可使用。保存时放在低温、低湿、阴暗而洁净的地方。六、思考题1培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？2在配置培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？实验二 大肠杆菌工程菌平板培养一、实验目的1.学习掌握微生物培养的原理和方法

13、。2.建立纯培养技术中的“无菌”概念，学习掌握无菌接种技术。二、实验原理消毒（disinfection）：是用较温和的物理或化学方法杀死物体上绝大多数微生物，主要是病原微生物和有害微生物的营养细胞。微生物接种技术：是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。包括斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种等操作，目的是获得生长良好的纯种微生物。无菌操作：是微生物接种技术的关键。常使用超净工作台（紫外线杀菌、过滤除菌）、酒精灯（火焰灼烧灭菌）、75%酒精（化学药剂消毒）。三、实验内容1.观察、比较、识别大肠杆菌在液体培养基中的特征。2.每小组制备LB琼脂培养基平板1个（无抗生素）、LB琼脂培养基平板（含

14、氨苄青霉素）2个、LB液体培养基5mL/支试管（无抗生素）、LB液体培养基5mL/支试管（含氨苄青霉素）。3.每人采用平板划线法，培养大肠杆菌单菌落。四、实验材料和用具大肠杆菌液体培养物DH5a菌种、LB固体培养基、无菌培养皿、超净工作台、75%消毒酒精、无菌注射器、无菌针头、0.2m微孔滤膜、冰箱、接种环、记号笔、打火机、酒精灯、恒温培养箱五、操作步骤（一）大肠杆菌液体培养物观察观察大肠杆菌液体培养物的颜色、液体表面、透明度、是否沉淀等。（二）大肠杆菌平板培养1.制备平板：蘸取75%酒精的棉球仔细擦手，待干后，将已灭菌、熔化的瓶装LB固体培养基冷却至55左右，右手握瓶，在靠近火焰处用左手拔下

15、瓶塞，瓶口通过火焰23次（以烧去可能附着于瓶口的微生物）后稍微离开火焰，但保持在火焰上方的无菌区域内。左手将瓶塞夹在右手小指与无名指间（塞进瓶口的一端朝外）。然后左手取平皿，无名指和小指托住皿底，大拇指和中指夹住皿盖，在火焰上方无菌区内启开皿盖，迅速注入培养基15mL左右，立即合上皿盖并使皿底均匀铺满培养基。平皿静置于桌上，冷凝即成平板。室温下放置，使平板表面干燥无水膜，以利于形成单菌落。2.制备含氨苄青霉素的培养基：使用无菌注射器吸取氨苄青霉素溶液，将一张0.2m微孔滤膜装入无菌注射器，加上无菌针头，火焰旁打开无菌培养皿盖，加入皿底中央（使终浓度50g/mL），迅速注入培养基15mL左右，立

16、即合上皿盖并慢速转动使氨苄青霉素溶液和培养基混合均匀。平皿静置于桌上，冷凝即成平板。将氨苄青霉素溶液加入LB液体培养基试管，使终浓度50g/mL。3.画线：画线的方式很多，其目的都是使平板上菌体逐渐变稀，最终能形成单菌落。常见的有下列两种：（1）连续画线法：接种环或针头稍弯的接种针火焰灭菌并冷却后，取大肠杆菌菌液，在平板上作连续画线。（2）分区画线法：接种环（或针）取样品后，在靠近平皿边缘处的平板上，用接种环前缘或针尖的弯曲部位接触平板，接种棒与平板成3040角，画34条平行线。然后转动平皿约50角，灼烧接种环（针），冷却后，通过前一区划23条平行线，并继续画23条不通过前一区的平行线。再转动

17、平皿，如此画45区。4.培养：室温放置12h，待接种菌液被培养基吸收后，倒置于37恒温培养箱培养1620h。5.检验：观察微生物菌落，注意选择孤立的菌落，仔细观察菌落的形状、大小、颜色、光泽、湿润度、隆起度、透明度、边沿形状等特征，抓住微生物的主要特征进行识别。划线分离时，挑菌量要小，严格无菌操作，避免环境中的杂菌污染。六、思考题1比较各种灭菌、消毒方法的原理及适用范围。2使用分区画线法时，为何每次画线后要烧接种环（针）？实验三 PCR扩增目的基因片段一、实验目的1.掌握PCR扩增DNA的技术及原理。2.学习PCR扩增仪的使用。二、实验原理聚合酶链反应（polymerase chain rea

18、ction，PCR）是一种体外DNA扩增技术，1985年由Mullis等人创立。该技术能在几小时的实验操作中，将人为选定的一段DNA扩增几百万倍，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等优点，目前已成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段，另外在医学研究和医疗诊断中亦体现出极大的应用价值。PCR的工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环，使特定的DNA片断在数量上呈指数增加。PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增片段的特异性

19、和片段长度。反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。PCR反应循环的第一步为加热变性，使双链模板DNA变性为单链；第二步为复性，每个引物将与互补的DNA序列杂交；第三步为延伸，在耐高温的DNA聚合酶作用下，以变性的单链DNA为模板，从引物3端开始按53方向合成DNA链。这样经过一个周期的变性复性延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA，假设PCR的效率为100%,反复n周期后，理论上就能扩增2n倍。PCR反应一般30-40次循环，DNA片段可放大数百万倍。三、实验内容常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，变性温度为95，复性温度为375

20、5，延伸合成温度为72，DNA聚合酶为Taq酶（可耐受95左右的高温而不失活），反应循环数为30。四、实验材料1.实验器材PCR扩增仪，台式高速离心机，移液器，经高压灭菌后的Eppendorf管，电泳仪。2.实验试剂（1）模板DNA（0.1g/l）：用牙签挑取单菌落悬浮到50l的裂解液中（裂解液1%TritonX-100，20mmol/l Tris-HCl PH 8.2, 2mmol/l EDTA），95温浴10分钟，10000rpm离心5分钟，取2l上清液用于总体积50l的PCR反应。（2）TaqDNA聚合酶（5U/l），10扩增缓冲液，dNTP（1mmol/L）：购买（3）引物（100pm

21、ol/L）：设计并合成与目的DNA两侧互补的引物内。五、操作步骤1准备PCR反应溶液（1）按以下次序，将下列成分在0.2ml灭菌Eppendorf管内混合：10扩增缓冲液 5l4dNTPs(包括四种dNTP) 4l引物1 1l引物2 1l模板DNA 1l (10ng)Taq DNA聚合酶 1l (2.5U)加水至终体积 50l（2）用手指轻弹Eppendorf管底部，使溶液混匀。在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底。2PCR扩增反应将加好样品的Eppendorf管置于PCR扩增仪内，945分钟，使模板DNA完全变性。然后按94变性30秒，59退火30秒，72延伸45秒，重复循环35次，循环结

22、束后72延伸10分钟。反应完毕，将样品取出置-4待用。3.实验结果观察取出样品，进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳，溴化乙锭(EB)染色，观察DNA条带。注意事项：1.PCR体系所加成分的实际用量，应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的贮备液浓度进行核算。2.加样时要认真,吸头垂直进入试剂管，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。3.Taq聚合酶（置于冰盒上）应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可过深，酶量不能过多。六、讨论与作业1PCR结果若出现非特异性的扩增条带，有必要进一步优化反应条件，包括改变退火温度和时间，调整Mg2+浓度等。

23、2PCR反应特异性强，引物浓度、TaqDNA聚合酶和dNTP的量不宜过多。3引物设计要合理。一般引物长度为18个30个核苷酸；引物间的G + C含量应为40%60%，而且避免引物内部产生二级结构；引物3端不应该互补，避免在PCR反应过程中产生引物二聚体；避免引物3端出现3个连续的G或C；理想的情况下，成对引物的G、C含量应相似以便以相近的退火温度与互补的模板链相结合，此外，引物5端序列对于后续操作也是十分有用的，例如，对PCR产物进行克隆时，可以考虑在引物5端引入限制性酶切位点。思考题：影响PCR的因素有哪些？实验四 回收目的基因与载体连接第一部分 目的基因片段的回收一、实验目的1.了解回收D

24、NA片段的几种方法及其优缺点2.掌握胶回收和柱回收法回收目的基因片段二、实验原理DNA片段的分离和回收是一项重要的技术，可收集特定PCR产物片段或酶切片段用于克隆、制备探针等工作。在DNA片段回收实验中有两个最重要的技术指标：一是产物的纯度，未达标则严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；二是产物的回收率，回收率低增大前期的工作量。回收DNA片段的方法很多，理想回收方法应满足以下要求：（1）回收片段的纯度高，不可带有凝胶；回收过程中加入的物质也要除净；无DNA酶污染等。（2）可用于大小不同的DNA片段回收。（3）较高的回收效率。（4）操作技术方便、快捷，不需昂贵的试剂和特殊的仪器设备。目

25、前已有20余种原始或衍生的方法可供选择，纤维素膜电泳回收法、透析袋电洗脱法、冻融法、玻璃粉法、琼脂糖凝胶法等方法，但还是缺乏高效回收不同大小DNA的普遍实用方法。实验室一般根据回收片段的大小、现有的试剂与器材、以及后处理的难易等选择合适的回收方法。很多生物公司开发了不用DNA片段的回收试剂盒，现在大部分的实验室都采用试剂盒来进行回收。在这些试剂盒中多利用特殊硅基质材料，在一定高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA的原理，配备设计独特的离心吸附柱式结构，快速高效回收DNA片段。三、材料与方法（一）材料1、实验材料PCR产物或酶切DNA片段2、实验试剂试剂盒，TAE电泳缓冲液，琼脂糖，3、仪器设备电

26、泳仪，电泳槽，高速离心机，紫外分析仪，凝胶成像分析系统，微量移液器（二）方法1、凝胶回收法凝胶回收的产率在40%-80%之间, 如果目的片段较少, 则可能导致回收产物很少。（基本过程见图示）图：柱回收过程示意图PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，按TIANGEN普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行凝胶回收。使用前请仔细阅读说明书，以产品说明书为准。（1）向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500 L平衡液BL，12000 rpm离心1 min。倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（2）紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，放入干净的离心管中，称取重量。向胶块中加入3倍

27、体积的溶胶液PN，50水浴放置10 min。（3）将所得溶液加入吸附柱CA2中，室温放置2 min，12000 rpm离心45 s，倒掉废液。（4）向吸附柱CA2中加入700 L漂洗液PW（加入无水乙醇），12000 rpm离心45 s，倒掉废液。（5）向吸附柱CA2中加入500 L漂洗液PW，12000 rpm离心45 s，倒掉废液。12000 rpm离心2 min，除尽漂洗液PW。（6）室温放置2 min，晾干。（7）将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空加入适量洗脱缓冲液EB或无菌水，室温放置2 min，12000 rpm离心2 min收集DNA溶液。可重复一次。（8）

28、回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度和纯度。注意事项：（1）点样后最好等待1分钟，让样品在加样孔中均匀分散。（2）紫外灯下切下目的带。胶块要尽可能小，尽量控制在100uL，否则影响回收率！（3）将回收的凝胶切成尽可能小的块，放入EP管中，做好标记。（4）50水浴溶胶，其间偶尔摇动，至胶完全溶解，熔胶要充分。（5）洗脱时如用水洗脱，要保证其pH值在7.5-8.0之间。2、PCR产物直接回收法如果PCR产物只有一条带，可以不用凝胶回收，还直接从PCR反应液回收，这样可以避免跑胶过程中损失部分PCR产物。按TIANGEN普通型PCR产物回收试剂盒说明书进行凝胶回收。使用前请

29、仔细阅读说明书，以产品说明书为准。（1）柱平衡：向吸附柱（吸附柱放入收集管中）CB2中加入500L平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。（2）按PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀。（3）所有溶液加入平衡好的吸附柱CB2中，室温放置2分钟，12000rpm离心30-60秒。弃废液。（4）向吸附柱CB2中加入600L漂洗液PW（已加无水乙醇），12000rpm离心30-60秒，弃废液。（5）重复上述步骤一次。（6）将吸附柱CB2放回收集管中，12000rpm离心2分钟后，将吸附柱CB2置于室温放置数分钟后，彻底地晾干，

30、以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。（7）将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置滴加30-50L洗脱液EB，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟收集DNA溶液。可重复此步骤一次，每次体积不少于30L。（8）回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度和纯度。3、冻融法胶回收DNA片段此法是利用冻融这一过程破坏凝胶结构，使DNA被释放出来。再用无水乙醇沉淀DNA。（1）紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条（小于0.6g）捣碎，置于1.5ml离心管中；（2）加入等体积的Tris-HCl饱和酚（pH 7.6），振荡混匀；（3）-20放置5-10m

31、in；（4）12000rpm 离心5min，上层液转移置另一离心管中；（5）加入1/4体积H2O于含胶的离心管中，振荡混匀；（6）-20，放置5-10min；（7）12000rpm 离心5min，合并上清液；（8）用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清；（9）加入1/10体积3M NaAc（pH 5.2）、2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀；（10）-20，静置30min；（11）12000rpm，离心10min，弃上清，75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干；（12）加适量H2O或TE溶解沉淀。（13）回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度和纯度。第二部分 目的基因片段与载

32、体连接一、实验目的：1.学习T载体的特点和PCR产物的克隆方法。2.掌握利用T载体克隆PCR产物的方法；复习连接实验流程。二、实验原理：普通Taq酶会在3末端加一个A，这样所有PCR产物都会在双链DNA的3端均有一个单链状态的A；T载体是线状DNA片段，在DNA双链的3端均有一个单链状态的T；二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，从而达到克隆的目的。如图所示。图：pMD18T 载体的结构此种连接方法是根据普通Taq酶会在3末端加一个A的原理发明的；注意不同的酶的性能不同，保真性强的Taq酶会自动切除末端的A，所以，这种酶的扩增产物需要补加A后再连接。生物公司的T载体试剂盒里附有全套T载

33、体连接转化的说明，基本上按说明书要求进行即可。三、材料与方法（一）材料1、实验材料PCR产物或酶切DNA片段2、实验试剂TVector KIT试剂盒（TAKARA公司），无菌水3、仪器设备低温水浴或连接仪，离心机，（二）方法（1）在0.5mlEppendorf 管加入以下试剂： 目的片段（0.1ug/ul） 3l T载体DNA（0.1ug/ul） 1l 水 1l Solution(含连接酶和缓冲液) 5l 总体积10l（2）瞬时离心，混合均匀。16连接416 小时，-20储存或直接用于转化。实验五 大肠杆菌液体培养一、实验目的1、学习细菌液体培养的方法，了解大肠杆菌的生长特性。2、为制备大肠杆

34、菌感受态细胞作准备。二、实验内容 1、掌握无菌操作、接种技术的基本环节。2、培养获得处于对数生长期的大肠杆菌菌液。三、实验材料及用具1、仪器、用品高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、恒温培养箱、分光光度计、-70 冰箱、制冰机接种环、移液器及吸头、接种环、酒精灯、试管、培养皿、硅胶塞、封口膜等。2、菌种、试剂经活化的大肠杆菌（E. coil）DH5a单菌落（实验二）、已灭菌的LB液体培养基5mL/支试管（无抗生素）和LB液体培养基100mL（无抗生素）、75%酒精等。四、实验步骤1.操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。2.将长有活化的大肠杆菌（E. coil）DH5a单菌落的

35、培养皿平板握在左手，使有菌种的一面向上，并处于水平位置。3.左手拿接种环（如握钢笔一样），在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火焰灭菌，此过程重复2次。4.将灼烧过的接种环伸入培养皿内，接种环在内壁或未长菌落的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻挑取一个单菌落，再从培养皿内抽出接种环。5.迅速将沾有菌种的接种环伸入LB液体培养基（5mL/支试管）中，使接种环和管内壁磨擦几下以利洗下环上菌体。接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。6.将接种环烧红灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。7.将接种后的液体培养基试管置于恒温摇床上，120

36、r/min震荡培养过夜。8.取1mL培养液加到100mL LB液体培养基中，在37摇床上剧烈振荡培养（250r/min）至OD6000.50.6（约2.5-3小时）；立即取出冰浴10-15min。注意事项1、接种环节应严格进行无菌操作。2、实验中要注意细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞。一般通过检测OD600来控制。DH5a菌株OD600为0.5时细胞密度是5107/ml。OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同。密度过高或不足均会使转化率下降。菌体密度与震荡培养的转速密切相关，根据测定的菌液OD值调整培养时间。3、接种的试管、三角瓶等应做好标记，注明菌种、日期、组别、姓名

37、等。实验六 大肠杆菌感受态细胞制备及转化一、实验目的1.学习感受态细胞的基本原理和技术方法。2.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。二、实验内容1. 氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞。2. 将外源目的基因导入到大肠杆菌受体菌中。三、实验材料及用具1.仪器、用品超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温培养箱、恒温水浴锅、分光光度计、-70 冰箱、制冰机等。 移液器及吸头（ 50uL 、200uL 、1000 uL）、接种环、Ep离心管、涂布器、试管、培养皿、硅胶塞、封口膜等。2. 菌种、试剂大肠杆菌（E. coil）DH5a对数期

38、菌液（实验五）、外源基因（实验四）、氨苄青霉素溶液、0.1mol/L CaCl2溶液、甘油、LB液体培养基5mL/支试管（加氨苄青霉素）等。四、 实验步骤1.将大肠杆菌（E. coil）DH5a对数期菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作。2.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却15 min。3.4下3000g冷冻离心5分钟。4.弃去上清，加入100ml预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰上放置20 min。5.4下3000 g冷冻离心5分钟；弃去上清，加入100ml预冷0.1 mol/L的预冷CaCl2溶

39、液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮。6.将细胞悬液200mL分装到Ep管中，可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（70）。7.取目的DNA10mL加入以上感受态细胞中，轻轻混匀，置于冰上放置30min。对照组设置：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作相同。8.将感受态细胞于42水浴中热休克90S后迅速在冰上放置2min。9.加入800lLB液体培养基（含氨苄青霉素），37，100-150 r/min摇菌培养4060 min. 五、注意事项1.所有操作均应在无菌条件和冰上进行。2.所使用的器皿必须经过灭菌。并且要防止迹量的去污剂或其它

40、化学物质、杂菌、DNA酶或杂DNA所污染，否则会大大降低细菌的转化效率。3.注意转化的质粒 DNA 的质量和浓度。转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10100倍。4.实验所用的溶液最好用3次蒸馏水配制。六、实验报告1.试述制备感受态细胞的原

41、理和方法。2.本实验成功的关键是什么？实验七 筛选重组转化菌落一、实验目的：掌握蓝白斑筛选重组转化菌落的原理和方法。二、实验原理：阳性克隆的筛选和鉴定可以从DNA、RNA和蛋白质三个不同的层次水平进行。可以利用载体本身的一些特性，如抗生素抗性基因、插入失活，插入表达、显色法等对重组子进行初筛。显色法中常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)。具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译-半乳糖苷酶、透过酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙基-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段lacZ，则重组

42、DNA分子转化lacZ互补型菌株，则非重组质粒在含有x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而重组质粒得到的转化子是白色菌落。如图所示： 图：蓝白斑筛选也就是说质粒载体编码-半乳糖苷酶N端序列，细菌宿主编码-半乳糖苷酶C端序列。当将些质粒转化此细菌里，可发生-互补，在IPTG 存在下，表达出完整-半乳糖苷酶活性，从而使5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal）形成蓝色菌落，而当质粒载体的多克隆位点上插入外源基因片段，则不能表达-半乳糖苷酶N端序列，从而在转向细菌后不具有-半乳糖苷酶活性，就不能生成蓝色菌落，表现为大肠杆菌本身的菌落，称为白色菌落。三、材料与方法（一）材料1、实验材料

43、转化重组质粒的宿主菌: E.coli DH5，或JM系列等具有-互补能力的菌株。2、实验试剂X-gal储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20。IPTG储液(200mg/ml): 在800l蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22m滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20。含X-gal和IPTG的筛选培养基：在事先制备好的含50g/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal储液和4lIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37下放置3-4小时,使培养基表面的

44、液体完全被吸收。LB培养基或SOB培养基3、设备和仪器恒温培养箱、恒温摇床，低温冰箱，超净工作台（二）方法（1）每组连接反应转化原液取100l用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。 （2）倒置平板于37继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。（3）放于4数小时,使显色完全。（4）用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50g/ml的 5ml LB液体培养基中,37下振荡培养12小时。注意事项：（1）在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。不是一开始就4，是等菌长出来之后。一般菌长出来就会有蓝色的了，4之后会进一步显色。（2）当出现蓝斑较大，白斑很小附在周围，还有蓝白镶嵌的斑即卫星菌落的时候，大都是因为中间菌落的生长可能消耗了培养基周围的Amp，导致了卫星菌落的出现，可以小心挑取中间的那个菌落，有可能是阳性克隆。要注意培养时间不宜过长，