细胞生物学实验讲义.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流细胞生物学实验讲义.精品文档.细胞生物学实验一 细胞分裂相的观察（综合性，3学时，生技、生工专业必修）一、实验目的 1.掌握减数分裂标本的制备方法；2.掌握生殖细胞减数分裂发生过程及各个时期的染色体和细胞变化特点；3.了解植物生殖细胞的形成过程。二、实验原理 减数分裂是生殖细胞发生的一种特殊细胞分裂方式，特点是染色体复制一次，细胞分裂两次，形成4个子细胞，每个子细胞染色体数目减半。经过受精作用后，染色体数目恢复，这样在物种延续过程中保证了遗传的相对稳定性和基因的多样性。三、实验仪器、材料和试剂 1.仪器、用具：眼科镊子、解剖针、刀片、吸水纸、

2、显微镜、载玻片、盖玻片；2.材料：普通小麦(Triticum aestivum， 2n=2x=42)或黑麦（Secale cereale， 2n=2x=14）、大麦(Hordeum sativum， 2n=2x=14)的幼穗（旗叶叶枕与幼穗顶部距离35cm，穗长约68cm）；或大葱（Allium fistolosum， 2n=2x=16）花序（外包绿色总苞者，长23cm）；或玉米(Zea mays， 2n=2x=20)幼穗（雄穗）。3.试剂：苯酚品红、醋酸洋红。注：以下染色剂的配制 1醋酸洋红（aceto carmine）： 酸性染料，适用于压碎涂抹制片，能使染色体染成深红色，细胞质成浅红色。

3、配方：洋红1g ； 45醋酸100ml。煮沸2h左右，并随时注意补充加入蒸馏水到原含量，然后冷却过滤，加入4铁明矾溶液12滴（不能多加，否则会发生沉淀），放入棕色瓶中备用。 改良苯芬品红染色液（Carbol fuchsine）核染色剂。配制步骤： 先配成三种原液，再配成染色液。 原液A：3g碱性品红溶于100ml 70酒精中。 原液B：取原A液10ml加入到90ml 5石炭酸水溶液中。原液C：取原B液 55ml，加入6ml冰醋酸和6ml福尔马林（38的甲醛）。 （原液A和原液C可长期保存，原液B限两周内使用） 染色液：取C液1020ml，加45冰醋酸8090ml，再加山梨醇11.8g，配成10

4、20浓度的石炭酸品红液，放置两周后使用，效果显著（若立即用，则着色能力差）。 适用范围：适用于植物组织压片法和涂片法，染色体着色深，保存性好，使用23年不变质。山梨醇为助渗剂，兼有稳定染色液的作用，假如没有山梨醇也能染色，但效果较差。四、实验方法与步骤 1. 取材：当麦类作物（小麦、大麦、黑麦等）处于孕穗后期时，选取旗叶叶枕距幼穗顶部约35cm的幼穗，取材时间在上午911时为好。2. 固定：新鲜幼穗可直接观察，也可剥去外部叶鞘，剪下幼穗，投入Carnoy固定液中固定424h后，倒掉固定液，用95%、85%酒精换洗2次，每次1h，然后转入70%酒精中保存备用。3. 涂片与染色：取出一段幼穗，置于

5、盛有蒸馏水的培养皿中，剥下一个小穗，取其中一朵小花，夹取其中一个花药置于清洁的载玻片上，用刀片切去花药的两端，加一滴苯酚品红染液（或1醋酸洋红），边染色边用镊子、解剖针用力涂抹挤压花药，挤出花粉母细胞，去掉花药等杂物，盖上盖玻片，用吸水纸吸取四周多余染液，即可观察。如果染色过深，可加上一滴70%酒精分色，然后用吸水纸吸去多余染液再观察。4. 减数分裂时相的观察：先在低倍镜找到细胞，然后用高倍镜观察分裂相，绘图。5. 对于好的压片，可永久制片保留：5.1揭片：将玻片置于-20冰箱冷冻30min结冰，或放入液氮处理4560s，用镊子或解剖刀直接揭开盖片，将有材料面朝上，37干燥，晾干载片及对应的盖

6、片。5.2脱水与透明：用由低浓度到高浓度（708090100）的梯度酒精冲洗12min，或在染缸中脱水25min，晾干。注意：整个脱水透明过程中，必须保持载玻片和盖玻片原来相对的方向和位置，同时注意操作轻巧，以免造成玻片上材料漂失。5.3封片：在中性树胶中加入1/51/4的二甲苯进行稀释，滴一小滴稀释胶在脱水透明后的载玻片中央，将盖玻片盖回原来位置封片。注意：覆盖盖玻片时，按原定位位置水平盖下，使之随着树胶的扩展自然下沉，切不可施加压力或移动盖玻片。如发现封片中树胶有气泡，应让其自然逸出或用针尖烧热后烫一下，使气泡逸出。如树胶滴得过多而逸出盖玻片四周，待树胶凝固后，用脱脂棉蘸二甲苯轻轻擦净逸出

7、的树胶。封片后平放晾干，镜检，物象清晰符合要求的保存，并贴上标签，注明标本名称、作者姓名和制片日期。五、实验结果小麦“宁春42号”PMC中期染色体配对六、作业 1.绘出你观察的细胞减数分裂相图。注意：构图和布局、勾画轮廓、点点映衬、标注（右侧，引线平直，下方写图题，加括号表面放大倍数）。2.简述减数分裂各时期的特征。七、附录减数分裂过程的分期及特征1.前期I细线期：染色体呈细长的染色线，螺旋卷曲分散在细胞核内，沿着整条染色线分布着许多染色粒，形似念珠。在细胞核内，核仁清晰可见。偶线期：同源染色体彼此接近，发生联会。在细线期末，偶线期初，染色体或染色丝在细胞中的部位发生变化。在植物细胞中，染色丝

8、凝集成块，偏于细胞核的一边，称为凝线期，在这一时期，还出现染色质(丝)穿壁转移运动。在动物细胞中，染色丝的一端聚集到核的一侧，而另一端呈放射状扩散，呈花束状，特称花束期。凝线期或花束期一直延续到偶线期结束粗线期开始为止。粗线期：同源染色体完成配对，成为二价染色体(或成对的同源染色体)，染色体由于螺旋卷曲的结果而缩得很短，每一粗线期的染色体具有两条并列的染色单体，成对的同源染色体含有四条染色单体，称为四分体，核仁附着于特定的染色体上。双线期：同源染色体之间彼此开始分离，但是在一个或多个点上互相交叉而又保持在一起，形似麻花。在该期，同源染色体的两个染色单体之间发生交换。终变期：染色体缩得更短，交叉

9、移向染色体的中间或末端，呈现V型、8型、O型或X型。染色体常移到核的周围靠近核膜的地方，是统计染色体的最好时期。该期结束时，伴随着核膜的破裂和核仁的消失。2.中期I核膜和核仁已消失，染色体排列在赤道面上，两极出现纺锤体并与染色体的看丝点相连。此时所有四分体都排列在纺锤体的中部。3.后期I每个四分体中的两各同源染色体，由于着丝粒的作用而彼此分离，逐渐向两极移动，形成两组染色体。4.末期I当两组染色体移动到两极后又聚集起来，核膜重新出现。在第一次核分裂之后，有些物种紧接着就进行胞质分裂，如百合、洋葱等，但有些物种则不接着进行胞质分裂，而是在第二次核分裂后才进行胞质分裂，如蚕豆、聚合草等。5.间期当

10、减数第一次分裂后，两个子细胞(或核)经过一个很短的间期(即中间期)，便进入减数第二次分裂。随着物种的不同，间期的长短不一，有些物种的细胞完全没有间期。6.前期II-末期II 分裂情况与有丝分裂相同。在减数第二次分裂后，紧接着进行胞质分裂。至此，一个母细胞分裂成染色体数目减半的四个子细胞。在植物中，减数分裂后，每个小孢子(花粉)母细胞成为四分孢子，每个小孢子脱离母细胞壁成为游离的小孢子，以后继续发育成为成熟花粉(二核或三核花粉)。在动物中，减数分裂结束时，一个精母细胞成为四个精子，每个精子细胞经过一系列的分化，转变成为精子。在雌性方面，个大孢子母细胞(植物)或卵母细胞(动物)经减数分裂产生卵及三

11、个极体。实验二 细胞中DNA化学的检测方法Feulgen反应（验证性，4学时，生科、生技、生工专业必修）一、 实验目的了解Feulgen反应的原理，掌握Feulgen染色的方法。二、 实验原理DNA经弱酸（1M HCl）水解，其上的嘌呤碱基和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂反应，形成紫红色化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。对照组不经过酸水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专性。三、实验仪器、材

12、料和试剂 1. 仪器、用具：显微镜、恒温水浴箱、温度计、解剖针、酒精灯、试管、烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸。2. 材料：洋葱鳞茎或普通小麦根尖。3. 试剂3.1 1 M盐酸的配制：取82.5ml密度1.19gm1的浓盐酸加蒸馏水至1000m1。3.2 Schiff试剂的配制及保存：称取0.5g碱性品红加入到100m1煮沸的蒸馏水中(用三角烧瓶)，时时振荡，继续煮5min(勿使之沸腾)，使之充分溶解。然后冷却至50时用滤纸过滤到磨口棕色试剂瓶中，滤液中加入10ml l M HCl，冷却至25时，加入0.5g K2S2O5(偏重亚硫酸钾)，充分振荡后，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24h(有时需23

13、d)，使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，剧烈振荡lmin，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应为无色也无沉淀。贮于4冰箱中备用。如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钾，使之再转变为无色时，仍可再用。3.3 10%偏重亚硫酸钾。3.4 亚硫酸水：取200ml自来水，加10 ml 10偏重亚硫酸钾水溶液和10m1 lM HCl ，三者于使用前混匀。3.5 5%三氯醋酸。四、实验方法与步骤1将实验材料（小麦、大麦、黑麦等）的根尖或洋葱鳞茎内表皮放在l M HCl中，加热到60水解810min。2蒸馏水水洗。3Schiff试剂遮光染色30 min。4

14、用配制的新鲜亚硫酸水溶液洗3次，每次1min。5. 水洗5min。6. 将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片（洋葱内表皮不用压片）。7. 显微镜检查，细胞中凡有DNA的部位应呈现紫红色的阳性反应。对照片的制作：方法一：CK1: 先将材料放在5三氯乙酸中90水浴15min，主要把DNA抽提掉，然后按步骤2-7制片观察。方法二：CK2: 材料不经l M HCl 水解，直接放在Schiff试剂中染色，然后按步骤3-7制片观察。方法三：CK3: 材料经l M HCl 水解30 min，直接放在Schiff试剂中染色，然后按步骤3-7制片观察。五、实验结果六、作业 1. 绘图示细胞DNA的分布

15、部位；2. 说明设立对照的必要性。实验三 细胞膜的渗透性（验证性，3学时，生科、生技、生工专业必修）一、实验目的 1了解细胞膜的选择渗透性（即半透膜）的特性；2了解不同性质溶液对细胞膜透性的影响。二、实验原理将红细胞放入等渗溶液或高渗溶液中，由于红细胞细胞膜对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的溶质不能渗入，渗入的溶质能提高红细胞内渗透压，促使水分子进入红细胞，引起溶血，由于溶质透入的机制和速度不同，因此溶血时间也不同。溶血现象可作为测量物质进入红血细胞速度的一种指标。溶血现象发生的快慢与加入细胞的溶质脂溶性大小、极性与非极性、分子量大小有关，具有以下规律：1、相对分子量大的进入细胞慢，

16、发生溶血所需时间也长。2. 脂溶性物质、非极性物质比水溶性物质、极性物质穿膜快；3. 分子量大、分配系数大的非极性、脂溶性物质穿膜比分子量小、分配系数小的慢；4. 疏水的小分子O2、CO2、N2、苯和小的不带电荷的极性分子如尿素、甘油、H2O可自由穿膜；5. 其他大的不带电荷的极性分子和带电无机离子，如葡萄糖、蔗糖、氨基酸、核苷酸、Na+、K+、Cl-等则要通过简单扩散、协助扩散（载体蛋白、通道蛋白）、主动运输等多种方式完成穿膜，穿膜的机制不同，溶血速度差异较大，情况复杂。非极性化合物易溶于脂溶剂，但在水中溶解度很小。分子量越大，碳链越长，脂溶性越大。一种化合物在脂溶剂中的溶解度与其在水中溶解

17、度之比，称为分配系数。分配系数 = 脂溶剂中的溶解度水中溶解度电解质溶液（如NaCl）与非电解质（如葡萄糖）分子数相等时，电解质产生的渗透压要大的多。具有相同渗透压的某非电解溶液与某电解质溶液浓度之比，称为等渗系数。用i来表示：i（葡萄糖的等渗物质的量浓度NaCl的等渗物质的量浓度）。发生溶血者为低渗液，所以把发生溶血的前一管溶液的浓度近似视为红细胞等渗。三、实验仪器、材料和试剂1仪器、用具：小烧杯、试管、试管架、2材料：含适量肝素钠（20mg140U/mg 1mlH2O=2800U/ml，用量15U/1ml血液，0.5ml肝素水溶液/50ml血）的兔血。3试剂：1 M乙二醇水溶液（MW:62

18、，密度：1.11，11.7ml/200ml）1M 丙三醇水溶液 (MW:92，密度：1.26，14.6ml/200ml)1 M葡萄糖水溶液 (MW:180，36g/200ml)3 M甲醇 (MW:32，密度：0.79，24.3ml/200ml)3 M乙醇 (MW:46.1，密度：0.79，35ml/200ml)3 M正丙醇 (MW:60.1，密度：0.8，45.1ml/200ml)1/8 M 、1/9 M、1/10 M、1/12 M、1/14 M葡萄糖溶液1/12 M、1/13 M、1/14 M、1/16 M、1/18 M NaCl溶液1M NaCl溶液 (MW:58.4，5.84g/100m

19、l)。四、实验方法与步骤1. 相对分子质量大小对膜通透性的影响（见表1）1.1在编号的3支试管中，分别用吸管吸入2ml 1M乙二醇水溶液、1M 丙三醇水溶液、1M葡萄糖高渗液。1.2先后分别用注射器滴加两滴血液，用手指按住管口，倒置一次。1.3观察溶血时间，最长延至30min。1.4将实验结果列入如下所示的表格中。2. 脂溶性大小对细胞膜透性的影响（见表2）2.1编号的3支试管分别加入2m1 3 M的甲酵、乙醇、丙醇溶液。2.2分别先后加入两滴血液，按住管口倒置一次。2.3观察溶血时间。2.4将实验结果记入如下所水的表格中。3. 电解质和非电解质溶液对细胞膜透性的影响（表3）3.1将试管编号，

20、注明溶质名称及物质的量浓度。3.2按编号分别加入不同浓度的葡萄糖及氯化钠溶液2ml。3.3分别先后加入两滴血液，按住管口倒置一次。3.4室温放置15min，观察发生溶血的浓度，确定等渗浓度。3.5按下表记录实验结果。3.6计算等渗摩尔系数。五、实验结果 表1 相对分子质量大小对膜通透性的影响溶液相对分子量溶血时间1M乙二醇621M 丙三醇921M葡萄糖180表2 脂溶性大小对细胞膜透性的影响溶液相对分量分配系数溶血时间3 M 甲醇32.040.00973 M 乙醇46.070.0357 3 M 正丙醇60.10.156表3 电解质和非电解质溶液对细胞膜透性的影响溶质物质的量（mol/L）1/8

21、1/91/101/121/131/141/161/18葡萄糖氯化钠计算：I = 六、作业 1. 填写实验数据表；2. 分析实验结果原因七、附录 1. 血浆渗透压1.1 渗透压的概念 渗透压（osmotic pressure）是溶液本身的一种特性，是溶液具有的吸引水分子透过半透膜的能力。溶液的渗透压与单位体积溶液中溶质颗粒的数量成正比，而与溶质的种类及颗粒的大小无关。1.2 血浆渗透压 血浆的渗透压在37约7.63个大气压（相当于770 kPa约5789.8 mmHg）。血浆渗透压由两部分组成：晶体渗透压（crystal osmotic pressure），由血浆中小分子物质形成，80%来自Na

22、+和Cl-。由于晶体物质分子量小，溶质颗粒数较多，晶体渗透压约占血浆总渗透压的99.6%。胶体渗透压（colloid osmotic pressure），由血浆蛋白分子颗粒形成。由于血浆蛋白中白蛋白的数量大于球蛋白，而白蛋白的分子量较小，因此白蛋白的分子数量远多于球蛋白，故血浆胶体渗透压主要由白蛋白形成。胶体渗透压仅占血浆总渗透压的0.4%，约3.3kPa (25 mmHg)。1.3 血浆渗透压相对稳定的生理意义1.3.1 血浆晶体渗透压 由于血浆与组织液中晶体物质的浓度几乎相等，所以它们的晶体渗透压也基本相等。水分子易通过细胞膜，而各种溶质不易通过。若血浆晶体渗透压与血细胞内液的渗透压不相等

23、，水就会顺渗透压梯度进出于细胞膜，影响细胞的形态和容积，进而影响其功能。因此血浆晶体渗透压对维持细胞内外的水平衡极为重要。1.3.2 血浆胶体渗透压 毛细血管壁通透性很高，允许除蛋白质以外的其它小分子物质自由进出。因此如果血浆或组织液中晶体渗透压发生改变时，两者会很快得到平衡。由于血浆蛋白一般不能通过毛细血管壁，血浆蛋白质的浓度大于组织液中蛋白质的浓度，所以血浆胶体渗透压虽小，但对于维持血管内外的水平衡极为重要。血浆胶体渗透压是一种吸引组织液中水回到血管，保持血管内水分的力量。各种原因导致血浆胶体渗透压下降，均可导致水在组织中潴留，而形成水肿。1.3.3 等渗溶液与等张溶液 渗透压与血浆渗透压

24、相等的溶液称为等渗溶液，高于或低于血浆渗透压的称为高渗或低渗溶液。临床上常用于静脉补液的0.85% NaCl溶液(称为生理盐水)和5%的葡萄糖溶液都是等渗溶液。 例如NaCl和葡萄糖都不易通过细胞膜，红细胞可在这些等渗溶液中维持正常的形态和容积，因而0.85%的NaCl溶液(0.15M)和5%的葡萄糖(0.28M)又称为等张溶液。等张溶液是指能使红细胞保持正常体积和形状的等渗溶液（也即溶液中的溶质颗粒不易通过红细胞膜）。1.9%尿素溶液虽然也是等渗溶液，但由于尿素易通过细胞膜，红细胞置于其中会立即出现红细胞肿胀、破裂、溶血，所以不是等张溶液。等渗溶液不一定是等张溶液，但等张溶液一定是等渗溶液。

25、2. 抗凝剂抗凝剂种类很多，性质各异，必须根据检验后的适当选择，才能获得预期的结果。现将实验常用抗凝剂及其使用方法简述如下：2.1乙二胺四乙酸（EDTA）盐：EDTA有二钠、二钾和三钾盐。均可与钙离子结合成螯合物，从而阻止血液凝固。EDTA盐经100烘干，抗凝作用不变，通常配成15g/L水溶液，每瓶0.4ml，干燥后可抗凝5ml血液。EDTA盐对红、白细胞形态影响很小，根据国际血液标准委员会（International committee standard of hematology，ICSH）1993年文件建议，血细胞计数用EDTA二钾作抗凝剂，用量为EDTA-K2.2H2O 1.52.2

26、mg （4.450.85mol）/ml血液。EDTA-NA与EDTA-K2对血细胞计数影响均较小，但二钠溶解度明显低于二钾，有时影响抗凝效果，其他抗凝剂不适合于血细胞计数。2.2枸椽酸钠（trisodium citrate）：枸椽酸盐可与血中钙离子形成可溶性螯合物，从而阻止血液凝固。别名柠檬酸钠，Na3C6H5O72H2O，通常，配成109 mmol/L (32g/L)水溶液（也有用106mmol/L浓度），与血液按1：9或1：4比例使用。枸椽钠对凝血V因子有较好的保护作用，使其活性减低缓，故常用于凝血象的检查，也用于红细胞沉降率的测定。因毒性小，是输积压保养中的成分之一。由于枸椽酸钠溶液是按

27、体积的比例加入血液内达到抗凝目的的，而抗凝剂主要是作用于积压浆成分，通常所谓的1：9比例抗凝的概念是指1份体积的抗凝剂作用9份红细胞比积正常血液内的血浆成分而言。所以对贫血或红细胞增多症患者的血液仍按1：9的比例加入抗凝剂时，就会发生抗凝剂足或相对过多，这将明显地影响凝象检查结果。为了避免这种现象，有文献报道应根据抗凝剂用量（ml）= 0.00185 血量 （100-病人红细胞比积%）这一公式，来计算抗凝剂的用量。2.3草酸钠（sodium oxalate）草酸盐可与血中钙离子生成草酸钙沉淀，从而阻止血液凝固。草酸钠通常用0.1mol/L浓度，与血液按1：9比例使用，过去主要用于凝象检查。实践

28、发现草酸盐对凝血V因子保护功能差，影响凝血酶原时间测定效果；另外由于草酸盐与钙结合形成的是沉淀物，影响自动凝血仪的使用，因此，多数学者认为凝积压象检查选用枸椽酸钠为抗凝剂更为适宜。2.4 肝素（heparin） 肝素广泛在于肺、肝、脾等几乎所有组织和血管周围肥大细胞和嗜碱性粒细胞的颗粒中。它是一种含硫酸基团的粘多糖，是分散物质，平均分子量为15000（200040000）。肝素可加强抗凝血酶（AT-）灭活丝氨酸蛋白酶，从而具有阻止凝血酶形成，对抗凝血酶和阻止血小板聚集等多种作用。每毫升血液抗凝需要肝素152.5Iu 。尽管肝素可以保持红细胞的自然形态，但由于其常可引起白细胞聚集可使用涂片在罗氏

29、（）染色时产生蓝色背景，因此肝素抗凝血不适全血液学一般检查。肝素是红细胞透渗脆性试验理想的抗凝剂。实验四细胞中化RNA的学检测方法Brachet反应（验证性 4学时，生科、生技、生工专业必修）一、实验目的 了解Brachet反应的原理，掌握有关的操作方法。二、实验原理甲基绿-派洛宁(methyl green-pyronin)为混合碱性染料，可能是混合染液中的两种染料有竞争作用，同时，两种核酸分子虽然都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易与染色质中聚合程度高的DNA选择结合呈现绿色或蓝色；而派洛宁则与核仁、细胞质中聚合程度较低的RNA选择结合呈现红色，但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色。

30、三、实验仪器、材料和试剂1. 仪器、用具：显微镜、镊子2. 材料：洋葱鳞茎内表皮3. 试剂3.1 1M乙酸缓冲液(pH4.8)配方：A液：冰醋酸6ml加蒸馏水至100ml B液：乙酸钠13.5g加蒸馏水至100ml取A液40ml + B液60ml混匀即为pH4.83.2 Unna试剂：甲基绿-派洛宁染色液甲液：5派洛宁水溶液 6m1 2甲基绿水溶液 6m1 蒸馏水 16ml乙液：1M乙酸缓冲液(pH4.8) 16m1甲、乙两液分别置4冰箱备用，用时甲乙两液混匀配制注意事项：派洛宁可加热助溶。甲基绿批号不同，染色效果差别很大。商品甲基绿常混有甲基紫，影响染色效果，应先把药品放在分液漏斗中，加入足

31、量的氯仿，用力振荡，然后静置，直到洗脱甲基紫为止，最后干燥备用。四、实验方法与步骤1. 用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块，置于载玻片上。2. 滴一滴Unna试剂，染色30min。3. 蒸馏水洗两次，吸水纸吸去多余的水分。4. 盖上盖玻片，镜检。对照片：撕取洋葱鳞茎内表皮，经5三氯乙酸90水浴处理15min，再经70乙醇洗片刻然后按步骤2-4制片观察。五、实验结果六、作业：绘图示细胞中RNA和DNA的分布。实验五 液泡系和线粒体的超活染色（验证性 3学时，生科、生技、生工专业必修）一、 实验目的掌握动、植物细胞活体染色的原理和相关的技术。二、 实验原理活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色，但

32、又无毒害的一种染色方法。目的在于显示活细胞内的某些天然结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡，活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞结构和生理、病理状态。根据所用染色剂的性质和印染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些持殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色。它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。液泡是细胞内浓缩产物的主要场所，有十分重要的功能。中性红（neutral red）是液泡的特殊染色

33、剂，在细胞处于生活状态时，只将液泡染成红色，细胞质和细胞核不被中性红染色。线粒体是细胞内的一个重要的细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。詹纳斯绿B（Janus green B）对线粒体有专一性染色，是毒性最小的碱性染料。詹纳斯绿B染色是由于线粒体中的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态，呈蓝绿色，而周围的细胞质被还原成无色的色基。三、实验仪器、材料和试剂1. 仪器、用具：显微镜、解剖刀、剪刀、镊子、吸管、载玻片、盖玻片、吸水纸、无菌牙签2. 材料：人口腔上皮细胞、小麦根尖。3. 试剂3.1 Ringer试剂氯化钠 0.85g (变温动物用0.65g) 氯化钾 0.25g 氯化钙 0.0

34、3g 蒸馏水 100ml 3.2 1%、1/3000中性红溶液：称取0.5g中性红溶于50ml Ringer液，稍加热 (3040)使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。3.3 1%、1/5000詹纳斯绿B溶液 称取0.5g詹纳斯绿B溶于50ml Ringer溶液中，稍加微热(3040)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。取1%原液l ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。 四、实验方法与

35、步骤1. 液泡系的活体染色与观察1.1 切取发芽的小麦根尖12cm长，切纵切面或用刀片压扁。1.2 放在载玻片上滴2滴1/ 3000中性红染液，染色510 min。1.3 用吸管吸取多余染液，滴一滴Ringer液，盖上盖玻片，用手指压盖玻片使根尖压扁。1.4 镜检。2. 线粒体的活体染色2.1 取清洁载玻片放在37恒温水浴锅的金属板上，滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液。2.2 用清水漱口数次，用消毒的牙签在原位刮取口腔粘膜表皮，第一次舍去，第二次、第三次放入滴液中染色1015min，不可使染液干燥。2.3 盖上盖玻片，吸去多余染液。2.4 镜检。五、实验结果六、作业：分别绘图，示口腔上皮细胞线

36、粒体和小麦根尖液泡系的形态和分布。实验六 叶绿体的分离与荧光观察（验证性 4学时，生科、生技、生工专业必修）一、实验目的 1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法；2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的原理。二、实验原理 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿

37、体(混有部分细胞核)。分离过程最好在05的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。 荧光显微术是利用荧光显微镜对可发出荧光的物质进行观察的一种技术。某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光。有些材料本身不发荧光，当它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发出桔红色荧光。利用荧光显微镜

38、对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。 三、实验仪器、材料和试剂1. 器材 1.1 主要设备：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜1.2 小型器材：烧杯、量筒、滴管、刻度离心管、试管架、纱布若干、无荧光载盖片1.3 材料：新鲜菠菜2. 试剂： 0.35mol/L氯化钠溶液，0.01% 吖啶橙四、实验方法与步骤1叶绿体的分离与观察1.1 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称15g于75ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。

39、1.2 利用组织捣碎机匀桨。1.3 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。1.4 取滤液30ml在1000r/min下离心5min，弃去沉淀。1.5 将上清液在3000r/min下离心8min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。1.6 将沉淀1ml用0.35mol/L NaCl溶液悬浮。1.7 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜、荧光显微镜下观察。1.7.1 在普通光镜下观察。1.7.2 叶绿体的直接荧光观察：以Olympus BX61荧光显微镜为例，用5号滤片（WIB）组合的条件下观察。1.7.3叶绿体的间接荧光观察：取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加

40、一滴0.01% 吖啶橙荧光染料，加盖片后，以Olympus BX61荧光显微镜为例，在用5号滤片（WIB）组合的条件下观察。2. 菠菜叶手切片观察 用刀片将新鲜的嫩菠菜叶切削出一斜面置于载玻片上，滴加12滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。2.1 在普通光镜下观察。2.2 叶绿体的直接荧光观察：以Olympus BX61荧光显微镜为例，用5号滤片（WIB）组合的条件下观察。2.3 叶绿体的间接荧光观察：向手切片上滴加12滴0.01%吖啶橙染液，染色1min，洗去余液，加盖片后，以Olympus BX61荧光显微镜为例，在用5号滤片（WIB）组合的条件下观察。五、实

41、验结果 5.1叶绿体的分离和观察 5.1.1 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。5.1.2 直接荧光观察：叶绿体发出火红色荧光。 5.1.3 间接荧光观察：叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。5.2 菠菜叶手切片观察5.2.1在普通光镜下可以看到三种细胞5.2.1.1表皮细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。5.2.1.2保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。5.2.1.3叶肉细胞：为排列成栅状的长形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。5.2.2直接荧光观察：叶绿体发出火红色荧光，但其

42、荧光强度要比游离叶绿体弱， 气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。5.2.3间接荧光观察：叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光，保卫细胞内也可见桔红色荧光。六、作业 1.写出各种情况下观察叶绿体结果；2.叶绿体分离时应注意什么问题？实验七 性染色质的检查（验证性 3学时，生科、生技、生工专业必修）一、实验目的 1掌握检查人类X染色体的制片方法；2了解巴氏小体在细胞中的位置及形态。二、实验原理在X、Y型性别决定的生物个体中，雌性个体细胞中两条X染色体中的一条要处于异固缩状态，称为Barr小体，以达到雌、雄个体X染色体数量和基

43、因产物的相等。目前X染色质的检查，在医学遗传的研究中，临床和法医诊断上仍具有一定的意义。三、实验仪器、材料和试剂仪器、用具：玻片、牙签、吸水纸、显微镜；材料：人类口腔粘膜上皮或毛囊细胞；试剂：1%醋酸地衣红、5M盐酸。四、实验方法与步骤4.1口腔粘膜细胞Barr氏小体的观察4.1.1女性口腔粘膜细胞涂片：用清水漱口数次，用消毒的牙签在原位刮取口腔粘膜表皮，第一次舍去，第二次、第三次涂在清洁的载玻片上，放在空气中干燥。4.1.2 固定染色：待涂片干后，滴2滴苯酚品红染液，加盖玻片在室温下静置1015min，倾斜载玻片，倒掉染液。用吸水纸轻轻擦拭干载玻片上的染液。放于显微镜下观察。4.1.3结果观

44、察：先用低倍镜找到具有核仁（不着色，空泡状）的间期粘膜细胞，后转高倍镜检查典型的巴氏小体为直径1的深色小体，常位于核膜附近，形状各样，微凸形、三角形、卵形、短棒形和双球形，但通常为半球形，被染成深红色。细胞核其它部分染成红色，细胞质不着色。选择细胞轮廓清楚、染色清晰，核大，核质呈均匀细网状的细胞100个，统计巴氏小体的频率，约15%左右，平均16.4%，不超过3035%，仅含1个X染色质。男性只有03%，平均0.7%，小体结构不规范、典型。4.2发根毛囊细胞Barr氏小体的观察取带有发根的头发，长23cm，围绕发根部的1圈长23mm的白色物体，即是毛囊细胞团，将其放置于载片上。在毛囊细胞处滴加

45、一滴5M HCl，约1520min以后，可使毛囊细胞得到充分软化。以清水冲洗23遍，将酸解液冲洗干净。拿起上述发根的梢部，将其上毛囊细胞轻轻蹭于另一干净载片上即可达到转移的目的。若用刀片或镊子将毛囊细胞刮下，可造成细胞的堆积，同样会出现多层细胞的现象。另外，l根发根的毛囊细胞可以转移到34张载片上，以达到充分利用实验材料的目的。观察时又可以看到清晰的单层涂布细胞，便于观察统计。此时，可滴加1滴染液于待测细胞上，注意染液不可过多，以免细胞流失。约10min后，加盖玻片即可进行观察。五、实验结果箭头所示为巴氏小体（女性细胞左中存在，男性细胞右中没有）六、作业：统计你所镜检的口腔粘膜1020个细胞中

46、的巴氏小体百分率，绘简图示巴氏小体的位置和形态。七、附录：在XY型性决定的生物个体中，雌性个体的细胞中有两条X染色体，而雄性个体的细胞中仅有一条X染色体。由于两种个体在X染色体的数量上是不相等的，因而雌、雄个体X染色体上的基因产物也可能是不相等的。针对这一现象，Muller于1932年提出剂量补偿效应，说明可以使具有两份基因的个体和具有一份基因的个体表现出相同表型的一种遗传机制的观点。1949年，MLBarr等人发现，在猫的雌性个体内，神经细胞核膜内缘有一染色很深的小体(后来定名为x小体或Barr氏小体)，而雄性个体细胞中则没有。以后在人类女性口腔上皮细胞中，也发现了类似的结构。经研究认为这是失活的异固缩状态的x染色质，并发现它属于延迟复制的染色体。X小体的数目在正常女性中是X染色体数目减去一。经观察，X小体一般11.5微米，呈三角形或卵圆形。20世纪60年代以来，不少学者曾提出了一些假说来解释这一现象。其中比较著名的假说是由MFLyon于1961年提出的Lyon假说（Lyon hypothesis）：1. 正常雌性哺乳动物的体细胞中，两条X染色体中只有一条在遗传上有活性，另一条在遗传上无活性。2. X染色体的失活