生物制药工艺学.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流生物制药工艺学.精品文档.1、生物药物是以生物体、生物组织或其成份、代谢产物为原料（包括组织、细胞、细胞器、细胞成分、代谢、排泄物）综合应用生物学、物理化学与现代药学的原理与方法加工制成的药物。2、现代生物药物分四大类：（1）重组DNA药物（又称基因工程药物）（2）基因药物：以遗传物质DNA、RNA为物质基础制造的药物一般把采用DNA重组技术或单克隆抗体技术或其他生物技术制造的蛋白质、抗体或核酸类药物统称为生物技术药物，在我国又统称为生物制品。（3）天然生物药物（4）合成或半合成生物药物3、生化药物分离纯化原理：总的原则：A根据分配率不同将其

2、分配到两个或几个物相中，再用机械法分离。B在某一相中，外加一定力（电泳、离心、超滤）使混合组分分离。具体：（1）根据分子形状和大小不同进行分离。如差速离心与超离心、膜分离（透析，电渗析）与超滤，凝胶过滤法。（2）根据分子电离性质的差异性进行分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。（3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提取法，逆流分配法，分配层析法，盐析法，等电点沉淀法，及有机溶剂分级沉淀法。（4）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附法与吸附层析法。（5）根据配体特异性进行分离亲和层析法。4、分离纯化早期和精制阶段使用方法的选择原则分离纯化早期使用方法的选择：大处理量，相对低

3、分辨率；精制阶段分离方法：高分辨率第三章 生物材料的预处理、细胞破碎和液-固分离5.细胞培养液的预处理方法。1）细胞及蛋白质的处理：（1）加入凝聚剂（2）加入絮凝剂（3）变性作用（4）吸附（5）等电沉淀 （6）加各种沉淀剂沉淀2）多糖的去除可用酶解转化为单糖、黏多糖可与一些阳离子表面活性剂如十六烷基溴化铵（CTAB）和十六烷基氯化吡啶（CPC)生成季铵盐络合物沉淀去除。3）高价金属离子的去除A离子交换法 通过阳离子交换树脂。B沉淀法6、常用的细胞破碎方法有哪些？1）机械法：匀浆法、珠磨法、超声波2）物理法：干燥、冻融、渗透压冲击3）化学法：化学试剂处理、制成丙酮粉4）生物法：酶解法、自溶7、固

4、液分离方法有哪些？1）、细胞及蛋白质的处理：（1）加入凝聚剂：Al2(SO4)318H2O、AlCl36H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3；（2）加入絮凝剂 絮凝剂：有机高分子，易溶，链长，活性功能基团多。 影响因素：分子量、用量、pH、操作条件（搅拌）；（3）变性作用；（4）吸附 加入吸附剂：活性碳除热原加入反应剂：相互作用形成沉淀吸附蛋白质；（5）加各种沉淀剂沉淀。2）过滤：常规和错流3）离心：过滤式离心和沉降式离心8掌握萃取与反萃取，分配系数与分配比的概念。（1）萃取：料液与萃取剂接触后，料液中的溶质向萃取剂转移的过程（2）反萃取：将萃取液与反萃取剂（含无机酸或碱的水溶液或水）相

5、接触，使某种被萃入有机相的溶质转入水相的过程。（3）能斯特分配定律：一定温度、一定压力下，某一溶质在互不相溶的两种溶剂间分配时，达到平衡后；在两相中的活度之比为一常数，如果是稀溶液，可以用浓度代替活度，即：萃取相浓度/萃余相浓度=K ，称为分配系数。9、萃取的步骤有哪些？（1）、混合；（2）、液液两相分离；（3）、离心萃取 ；（4）、溶剂回收10、固相析出分离1）.固相析出法主要包括盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、结晶法及其它多种沉淀方法等。2）.按照一般的习惯，析出物为晶体时称为结晶法，析出物为无定形固体则称为沉淀法。3). 结晶包括三个过程：(1) 形成飽和溶液 ；(2) 晶核形成

6、；(3) 晶体生长 。4).晶体的质量主要是指晶体的大小、形状和纯度等3个方面。11、几道选择题1）、 在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作 (A )AKS盐析法 B盐析法 C重复盐析法 D分部盐析法2）、盐析法与有机溶剂沉淀法比较，其优点是（ B ）A. 分辨率高 B.变性作用小 C.杂质易除 D.沉淀易分离3）、 将配基与可溶性的载体偶联后形成载体-配基复合物，该复合物可选择性地与蛋白质结合，在一定条件下沉淀出来，此方法称为（ A ）A亲和沉淀 B聚合物沉淀 C金属离子沉淀 D盐析沉淀4）、影响晶体大小的主要因素与下列哪些因素无关 ( D )A过饱和度 B温度 C搅拌速

7、度 D饱和度12、沉淀与结晶有何不同？常用的沉淀方法包括哪些？结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程。沉淀是溶液中难溶解的固体物质从溶液中析出的过程。结晶法：析出物为晶体。沉淀法：析出物为无定形固体。沉淀方法：（1）有机溶剂沉淀法 （2）等电点沉淀 （3）成盐沉淀法（4）亲和沉淀 （5）高分子聚合物沉淀法 （6）表面活性剂沉淀法13、何谓盐析？其原理是什么？常用的盐析方法有哪些？影响盐析的主要因素有哪些？盐析操作时常用的盐是什么？（1）盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。（2）原理：盐溶

8、现象和盐析作用破坏双电层：在高盐溶液中，带大量电荷的盐离子能中和蛋白质表面的电荷，使蛋白质分子之间电排斥作用相互减弱而能相互聚集起来。破坏水化层：中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。14. 什么是结晶？结晶过程包括哪些？在何种条件下，溶液中才有晶体析出？（1）溶液中的溶质在一定条件下因分子有规则的排列而结合成晶体。结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程。（2）过程：形成过饱和溶液； 晶核形成； 晶体生长（3）条件：溶质只有在过饱和溶液中才能析出推动力：形成新相（固体）需要一定的表面自由能。因此，溶液

9、浓度达到饱和溶解度时，晶体尚不能析出，只有当溶质浓度超过饱和溶解度后，才可能有晶体析出。晶核：最先析出的微小颗粒是以后晶体的中心，称为晶核。首先形成晶核，由Kelvin公式，微小的晶核具有较大的溶解度。实质上，在饱和溶液中，晶核是处于一种形成溶解再形成的动态平衡之中，只有达到一定的过饱和度以后，晶核才能够稳定存在。15、 吸附分离法1）、吸附剂按其化学结构可分为两大类：一类是有机吸附剂，如活性炭、淀粉、大孔吸附树脂等；另一类是无机吸附剂，如白陶土、氧化铝、硅胶、硅藻土等。2）、常用的吸附剂有活性炭、硅胶和白陶土等。3）、大孔网状聚合物吸附剂按骨架的极性强弱，可分为非极性、中等极性、极性和强极性

10、吸附剂四类。16选择1）用大网格高聚物吸附剂吸附的弱酸性物质，一般用下列哪种溶液洗脱 （ D ）A. 水 B.高盐 C.低pH D. 高pH2）“类似物容易吸附类似物”的原则,一般极性吸附剂适宜于从何种溶剂中吸附极性物质（ B ）A. 极性溶剂 B.非极性溶剂 C.水 D.溶剂3）、活性炭在下列哪种溶剂中吸附能力最强？ （A）A. 水 B.甲醇 C.乙醇 D.三氯甲烷4）、 关于大孔树脂洗脱条件的说法，错误的是：（A）A .最常用的是以高级醇、酮或其水溶液解吸。B. 对弱酸性物质可用碱来解吸。C. 对弱碱性物质可用酸来解吸。D. 如吸附系在高浓度盐类溶液中进行时，则常常仅用水洗就能解吸下来。第

11、八章 离子交换法17、离子交换剂由载体、功能基团和平衡离子组成。平衡离子带正电荷为阳离子交换树脂，平衡离子带负电荷称阴离子交换树脂。18、写出下列离子交换剂类型：732 强酸001x7树脂（强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂 ），724 弱酸101x4树脂（阳离子型） ，717强碱201x7树脂（强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂） ，CM-C 羧甲基纤维素（弱酸性阳离子交换纤维素） ,DEAE-C 二乙基氨基乙基纤维素 （强碱型阴离子交换纤维素），PBE94 多缓冲交换剂 （碱性阴离子交换剂） 。19.离子交换层析的原理利用溶液中带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离。20.离子交换树脂的分类

12、分类：平衡离子带正电荷为阳离子交换树脂，分类：强酸型树脂、中酸性树脂、弱酸性树脂平衡离子带负电荷为阴离子交换树脂，分类：强碱型阴离子交换树脂、弱碱型阴离子交换树脂、中强碱性阴离子交换树脂21、多糖基离子交换剂主要分为哪两类离子交换纤维素和葡聚糖凝胶离子交换剂22、CM-sephadex C-25（羧甲基纤维素）；C阳离子功能基团是：羧甲基；载体是：葡聚糖凝胶；型号是：G-25；类型：弱酸型阳离子交换剂DEAE-sephadex A-25（二乙胺基乙基纤维素）；A阴离子功能基团是：二乙基氨基乙基纤维素；载体是：葡聚糖凝胶；型号：G-25 ；类型：强碱型阴离子交换剂23、K值为离子交换常数，K1说

13、明树脂对交换离子吸引力较大第七章 凝胶层析24、葡聚糖凝胶的孔径大小取决于交联度，其越小，凝胶孔径越大；而琼脂糖凝胶的孔径却依赖于琼脂糖浓度。25、琼脂糖凝胶的一个特征是分离的分子量范围非常大，其分离范围随着凝胶浓度上升而 下降，颗粒强度随浓度上升而提高。26选择：1）、凝胶层析中，有时溶质的Kd1，其原因是 （ B ）A. 凝胶排斥 B.凝胶吸附 C.柱床过长 D.流速过低2）、凝胶层析中，有时小分子溶质的Kd细胞破碎-固液分离-初步纯化-精制胞外产物-初步纯化-精制72其他微生物药物一、微生物产生的酶抑制剂（一）-内酰胺酶抑制剂 克拉维酸 舒巴坦克拉维酸(CVA)，又名棒酸1976年从棒状

14、链霉菌的代谢产物中分离得到了克拉维酸，本身抗菌活性很弱，但与羟氨苄青霉素组成的复合剂奥格门汀、与羧噻吩青霉素组成的复合剂timentin都具有很好的协同作用，并应用于临床。克拉维酸提取纯化工艺工艺要点：萃取与浓缩沉淀：与碱性有机胺成盐而沉淀析出；10，搅拌加入5%（2（二甲氨基）乙基）醚的乙醇溶液 转型（二）降血脂作用的酶抑制剂：洛伐他汀-胆固醇的生物合成途径洛伐他汀为第一个上市的HMG-CoA还原酶抑制剂，它具有显著的降血脂效果，一般可使血浆总胆固醇下降30%40%，低密度脂蛋白下降35%40%，甘油三脂中等程度下降，还有升高高密度脂蛋白的作用。洛伐他汀生产工艺1. 发酵液的预处理发酵生成的

15、洛伐他汀以游离酸为主，由于游离酸在水中的溶解性很小，因而大部分存在于菌丝体中。为将洛伐他汀溶出，可将发酵液调节至碱性，再过滤2. 醋酸乙酯萃取3. 硅胶柱层析二、微生物产生的免疫调节剂免疫抑制剂 环胞菌素A免疫增强剂 乌苯美司103、试叙述基因工程药物的一般制备过程。104、简述疫苗的一般制备方法。105、病毒类疫苗制备过程中，病毒的扩增方法有哪些？106、生物制品可分为哪些类别，请举例说明之。第一节 生物制品基本概念一、定义及概述生物制品（biological product）是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生

16、物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。二、分类1、疫苗(Vaccine)2、抗毒素及免疫血清(Antitoxin and Antisera)由特定抗原免疫动物所得由血浆或血清制成；称抗毒素或免疫血清。如破伤风抗毒素、抗狂犬病血清等，用于治疗或被动免疫预防。3、血液制品(Blood Products)由健康人的血浆或特异免疫人血浆分离、提纯或由重组技术制成的血浆蛋白组分或血细胞组分制品,如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子(天然或重组的)、红细胞浓缩物等,用于诊断、治疗或被动免疫预防。4、细胞因子(Cytokines)及重组产品(Recombinant DNA Products)由健

17、康人血细胞增殖、分离、提纯或重组技术制成的多肽类或蛋白质类制剂, 如干扰素()、白细胞介素()、集落刺激因子()、红细胞生成素()等,用于治疗。5、诊断制品(Diagnostic Reagents)（1）体外诊断制品:由特定抗原、抗体或有关生物物质制成的免疫诊断试剂或诊断试剂盒,如伤寒、副伤寒、变形杆菌诊断菌液,沙门氏菌属诊断血清,酶联免疫诊断试剂盒等,用于体外免疫诊断;（2）体内诊断制品:由变态反应原或有关抗原材料制成的免疫诊断试剂,用于皮内接种等。如卡介菌纯蛋白衍生物(-)、布氏菌纯蛋白衍生物(-)、锡克实验毒素、单克隆抗体等,用于体内免疫诊断。6、其它制品由有关生物材料或特定方法制成,不

18、属于上述5类的其他生物制剂,用于治疗或预防疾病。如治疗用型肉毒素制剂、微生态制剂和卡介菌多糖、核酸制剂等。二、疫苗的种类和发展1、常规疫苗：活疫苗：用人工定向变异方法或从自然界筛选出的毒力高度减弱或基本无毒的活的微生物制成的预防制剂死疫苗：收获经增殖的标准微生物株，用物理或化学方法将其杀死或灭活制成的预防制剂死疫苗与活疫苗的比较2、亚单位疫苗：设法去除病原体中对激发保护性免疫无用的甚至有害的成分，保留有效的免疫成分所制成的疫苗3、合成肽疫苗：用化学合成的能够诱发机体产生免疫保护的多肽制成的疫苗。4、基因工程疫苗（gene engineered vaccines）利用重组DNA技术克隆并表达保护

19、性抗原基因，利用表达的抗原产物，或重组体本身制成的疫苗。主要有以下五种：1）基因工程亚单位疫苗将基因工程表达的蛋白抗原纯化后制成的疫苗，安全性高，但免疫效果一般较差。2）载体疫苗 （vector vaccine）指利用微生物载体，将保护性抗原基因重组到微生物中，使用这种能表达保护性抗原基因的重组微生物制成的疫苗（多为活疫苗）3）核酸疫苗（DNA 疫苗，基因疫苗）指使用能够表达抗原的基因本身即核酸制成的疫苗。4）基因缺失活疫苗就是使用通过分子生物学技术去除与毒力有关基因获得的缺失突变毒株制成的疫苗5）蛋白质工程疫苗（proteinengineering vaccine）将抗原基因加以改造，以达到

20、增强产物的免疫原性，扩大反应谱，去除有害作用或副反应的一类疫苗核酸疫苗具体的说，DNA Vaccine是指含有编码抗原基因的真核表达质粒DNA经直接接种体内后，可被细胞摄取、并转录、翻译、表达出相应的抗原，然后通过不同的途径刺激机体产生针对此种抗原的免疫应答。DNA疫苗的构建DNA疫苗的制备：细菌的扩增、质粒的大量提取体外哺育动物细胞短暂转染试验动物免疫试验三、病毒类疫苗的一般制造方法（一）毒种的选择和减毒要求：有抗原性；有典型形态和感染特定组织的特性；易培养繁殖；不产生其他毒素；稳定，无恢复致病力现象；未被污染常用的细胞培养如甲型肝炎的病原体是甲型肝炎病毒（hepatitis A virus

21、, HAV）国外使用细胞培养来源的病毒材料研制了纯化的灭活甲肝疫苗，如史克必成的贺福立适（Havrix）和默沙东的Vaqta。四、细菌类疫苗及类毒素的一般制备方法细菌类疫苗（一）菌种的选择（二）培养基（三）培养条件（四）杀菌（五）稀释、分装和冻干如卡介苗卡介苗（bacille calmetteguerin）是对牛型结核杆菌(M. bovis), 通过体外连续传代230次以上，历时13年获得的无致病性分支杆菌制备的。是最早的细菌性减毒活疫苗。Modification of Toxin to Toxoid107、基因工程技术中，目的基因的获得有哪些方法？108、基因治疗中常用的载体有哪些？109、

22、应用基因药物来治疗癌症可用哪些抑癌方法？110、表达载体的一般要求是什么？111、常用的基因工程宿主有哪些，各有什么特点？112、PCR反应体系中，主要有哪些物质？113、术语：基因重组，疫苗，菌苗，重组药物，基因药物，合成肽疫苗，生物制品，DNA疫苗，亚单位疫苗，载体疫苗，细胞因子，IFN，EPO，包涵体，多克隆位点重组DNA药物一、重组DNA技术与基因工程的基本定义优点：1、可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽；去除内源性物质的不足之处2、提供足够数量的生理活性物质，以进行生理生化、结构的研究3、利用基因工程技术可发现、挖掘更多内源性生理活性物质4、获得新型化合物DNA重组药物制造的

23、主要步骤二、基本过程上游阶段： 实验室获得目的基因、酶切和酶连、插入适当载体、转入宿主细胞、复制、目的基因分析确证、表达、筛选合适表达系统等下游阶段：将实验室成果产业化发酵参数确定、新型生物反应器研制、高效分离介质及装置开发、生物传感器设计制造、电子计算机优化控制、产品质量控制注意：上游DNA重组的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想；而下游过程则是上游基因重组蓝图的体现和保证，这是基因工程产业化的基本原则。2）、表达载体要求：a、能独立复制b、有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记c、具有有效运载外源基因的能力，能携带大小不同的外源基因d、容易控制，在细胞内稳定性高，安全可靠。如大肠杆菌的

24、pBV220系统，为温度诱导表达载体，已成功用于IL-2，IL-3，IFN等pET系统，最有潜力的系统，可用乳糖代替IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖），产物可达细胞总蛋白2030%，表达量可达总蛋白50%。pET载体五、重要的重组DNA药物（一）利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽代表产品：重组人胰岛素、重组人生长激素、重组人干扰素、重组人白细胞介素、重组人集落刺激因子、重组抗体及其片断等。1）、干扰素（IFN-、）1957年Isaccs等发现病毒干扰现象，即病毒感染的细胞能产生一种因子，作用于其他细胞干扰病毒复制，因而命名为干扰素。根据产生干扰素细胞的来源、理化性质和生物活性等差异，可分为、等

25、3种，其中IFN-为多基因产物，有23种以上的亚型。1986年，FDA批准Roch公司的重组IFN-2a和Schering公司的重组IFN-2b，重组IFN-、分别在1990年和1993年上市。我国中国预防医学科学院病毒学研究所侯云德等发现中国人受病毒攻击产生的干扰素主要为IFN-1b型，1992年我国第一个基因工程药物IFN-1b获得国家一类新药证书。2）胰岛素(Insulin, Ins)1921年，Banting FG等从胰脏中分离1955年，Sanger F测序1965年，我国完成结晶牛胰岛素全合成1979年，Rutter W等克隆了胰岛素基因1982年，第一个重组人胰岛素批准上市胰岛素

26、的结构及生物合成胰岛素原与胰岛素人胰岛素的生产方法产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略(a) AB链分别表达法 体外折叠成功率低，通常只有1020(b) 人胰岛素原表达法 由于C肽的存在，胰岛素原在复性条件下能形成天然的空间构象，为三对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得体外折叠率高达80以上 目前Ely Lily用这种工艺路线年产几十吨的重组人胰岛素，其经济效益相当可观。(c) AB链同时表达法3）生长激素1944年，李卓浩等从牛垂体中分离出牛生长激素1956年，从人垂体中分离出hGH1969年，hGH序列报道临床上用于垂体性侏儒症。19561985年，只能从人尸体垂体中分离纯化。但至198

27、5年，共发现50多例克-雅氏症，5人病亡，研究结果证实由垂体来源的生长激素污染有朊病毒。1985年，垂体来源的被禁用，同年，rhGH上市。1985年，美国FDA批准由大肠杆菌发酵生产的重组人生长激素上市，随后各种途径生产的重组人生长激素迅速充斥市场。1997年，仅美国Genentech和Ely Lily两家公司的重组人生长激素年产量已达20kg，年销售额超过3.5亿美元。人生长激素的结构与性质重组人生长激素工程菌的构建（二）利用重组酵母生产医用蛋白优势：1. 最简单的真核生物，基因表达调控机理较清楚，并且遗传操作相对较为简单；2. 具有原核无法比拟的真核生物蛋白翻译后修饰加工系统3. 不含有特

28、异性的病毒，不产生毒素，有些酵母菌在食品工业当中有着几百年的应用历史，属于安全型基因工程受体系统；4. 大规模发酵工艺简单，成本低廉5. 能将外源基因表达产物分泌至培养基中劣势：虽然拥有完整的蛋白质糖基化修饰系统，但其修饰方式不同于高等真核生物。举例：重组乙肝疫苗 重组人血清白蛋白重组HAS的制备人血清白蛋白HAS是血浆中的主要成分 载体蛋白。成熟的人血清白蛋白为一非糖基化的单一多肽链，由585个氨基酸组成，含有17对二硫键，由此维系的空间构象是血清白蛋白的生物功能所必需的。巴斯德毕赤酵母是迄今为止最为优良的重组人血清白蛋白的表达分泌系统。产率可高达15g/L（三）利用转基因动物或细胞生产生物

29、大分子1. 利用动物乳腺组织生产蛋白药物酪蛋白 、 tPA 、 IL22. 利用哺乳动物细胞大规模培养技术生产复杂的人体蛋白例如 EPO促红细胞生成素（EPO）由肾脏分泌的一种唾液酸蛋白，它能促进红细胞系的增值、分化和成熟 .由166个氨基酸残基组成的高度糖基化蛋白，其糖基对其生物活性至关重要目前用哺乳动物细胞表达系统如CHO细胞生产。临床为治疗肾衰导致贫血的首选药物，全世界销售额超过10亿美元。1957年Jacobson等证实，肾脏是血清EPO的主要来源，含量极微小，无法分离纯化获得纯品。直到1985年，Jacobs等才先后成功克隆出人、猴、小鼠的EPO基因，随后重组人EPO在CHO细胞中获

30、得表达，并通过层析纯化技术制备出rHuEPO纯品，于1989年获得美国FDA批准后首次投放市场。EPO制备工艺根据已知天然EPO的氨基酸序列，合成相应的寡聚核苷酸探针，筛选出人EPO基因，引入真核生物质粒表达载体PD11,用磷酸钙微量沉淀法转染CHO细胞，克隆培养后，检测培养上清中EPO的生物学活性，筛选出高效表达EPO的细胞株，按照中国生物制品规程要求建立种子库，检定合格后用于生产。CHO工程细胞在条件培养基中培养时，表达的EPO分泌到培养上清中，上清液中除了EPO外，还含有培养基成分和其他杂蛋白，利用EPO 本身的物理化学性质，将培养上清液加热至80，或用6mol/L盐酸胍、8mol/L尿素沉