培养基的制作__1.docx

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1、培养基的制作_第3单元Unit第3周Week6学时(Periods)单元标题(Title)：培养基的制作教学地点(Place)：育贤阁教学目的(TeachingTarget)：1.熟悉培养基的成分及作用2.把握母液和培养基的配制教学方法(TeachingApproaches)：讲授法、项目教学法、提问教学材料及工具(TeachingMaterials&Aids)：教案、教材、ppt、组培苗考核与评价方式(Testing&EvaluatingMode)：考勤、提问、作业任务一培养基的配制培养基culturemedium是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求

2、，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不一样，只要知足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因而，没有一种培养基能够合适一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一适宜的培养基，培养才有可能成功。在植物组织培养历史进程中，事实上也严密地伴随着培养基的研制史。对植物的营养要求的不断认识，对已有培养基的改良，或者将新发现的植物激素、新的有益成分应用于培养基之中，都大大促进了组织培养研究的迅速发展，获得越来越多的成功。一、培养基的成分培养基的成分主要能够分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。1水水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢经过的介质和

3、溶媒。它是生命活动经过中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的准确性，防止贮藏经过发霉变质大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。2无机元素(inorganicelement)大量元素，指浓度大于05mmolL的元素，有N，P，K，Ca，Mg，S等。其作用是：(1)N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以N03-N和NH4-N两种形式供给。大多数培养基既含有NO，-N又含NH4-N。NH4-N对植物生长较为有利。供给的物质有KN03、NH4NO3等。有时，也添加氨

4、基酸来补充氮素。(2)P是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、ADP等的组成成分。在植物组织培养经过中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。(3)K对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大，一般为1-3mgL为好。制备培养基时，常以KCl、KNO，等盐类提供。(4)Mg、S和Ca、Mg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgS

5、047H20提供。用量为13mgL较为适宜；Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受毁坏有显著作用，常以CaCl22H20提供。(5)微量元素指小于0.5mmolL的元素，Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素构成的必要条件。培养基中的铁对胚的构成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制做培养基时不用Fe2(S04)3和FeCl3(因其在pH值5.2以上，易构成Fe(OH)，的不溶性沉淀)，而用物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，发育异常现象。总之，植物必需营养元素可组成构造物质，可以是具有生理

6、活性的物质，如酶、辅酶以及作为酶的活化剂，介入活跃的新陈代谢。此外，在维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面起着重要作用。当某些营养元素供给缺乏时，愈伤组织表现出一定的缺素症状。如缺氮，会表现出一种花色素苷的颜色，不能构成导管；缺铁，细胞停止分裂；缺硫，表现出非常明显的褪绿；缺锰或钼，则影响细胞的伸长。3有机化合物(organiccompound)培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基。为不同的培养目的往往要参加一些有机物以利于快速生长。常参加的有机成分主要有下面几类：(1)碳水化合物：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持很多组织很好的生长。麦芽糖、半

7、乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在23，常用3，即配制1L培养基称取30g蔗糖，有时可用2.5，但在胚培养时采用415的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。高压灭菌时一部分糖发生分解、制定配方时要给予考虑。在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。(2)维生素(vitamin)这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式介入多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。固然大多数的植物细胞在

8、培养中都能合成所必需的维生素，但在数量上还明显缺乏，通常需参加一至数种维生素，以便获得最良好的生长。主要有Vsl(盐酸硫胺素)、VD6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、VC(抗坏血酸)、有时还使用生物素、叶酸、VB2等。一般用量为0.11.0mgL。有时用量较高。Vm对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc有防止组织变褐的作用。(3)肌醇(myo-inosit0l)又叫环己六醇，在糖类的互相转化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成果胶物质，用于构建细胞壁。肌醇与6分子磷酸残基相结合构成植酸，植酸与钙、镁等阳离子结合成

9、植酸钙镁，植酸可进一步构成磷脂，介入细胞膜的构建。使用浓度一般为l00mgL，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的构成。对组织和细胞的繁衍、分化有促进作用，对细胞壁的构成也有作用。(4)氨基酸(aminoacide)是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它们是牛乳用酶法等加工的水解产物，是含有约20种氨基酸的混合物，用量在101000mgL之间。由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无十分需要，以不用为宜。(5)天然复合物其成分比拟复杂，大多含

10、氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。用浓度在1020，与其果实成熟度及产地关系也很大。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用，但茎尖组织的大小若超过1mm时，椰乳就不发生作用。2)香蕉用量为150200ml/l。用黄熟的小香蕉，参加培养基后变为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。3)马铃薯(potato)去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤，取其滤液使用。用量为150200gL。对pH值缓

11、冲作用也大。添加后可得到强健的植株。4)水解酪蛋白为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为100200mgL。受酸和酶的作用易分解，使用时要注意。5)其他酵母提取液(YE)(0.010.05)，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液(0.01-0.5)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。4植物激素(hormone)是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许很多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物激素是培养基的关键物质

12、，对植物组织培养起着决定性作用。(1)生长素类(auxin)在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织构成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，(10-510-8mgL)就可促进生长，其次是茎和芽。天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被毁坏。在植物体内也易遭到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。IAA(indoaceticacid，吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官构成的副作用小，高温高压易被毁坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。IBA(indoleb

13、utyricacid，吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。NAA(naphthaleneaceticacid，萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出34倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解毁坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，十分在促进愈伤组织的构成上活力最高，但它强烈抑制芽的构成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。生长素配制时可先用少量95酒精助溶。2，4-D可用0.1molL的NaOH或KOH助溶。生长平素配成1mgdml的溶液贮于冰

14、箱中备用。(2)GA(gibberellicacid，赤霉素)有20多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同、培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株；赤霉素和生长素协同作用，对构成层的分化有影响，当生长素赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化；此外，赤霉素还用于打破休眠，体的生长。赤霉素溶于酒精，配制时可用少量95酒精助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70100失效，应当采用过滤灭菌法参加。(3)细胞分裂素类(cytokinin)这类激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA(6-苄基氨基嘌呤)、Kt(kinetin冲动素)、Zt(zea

15、tin玉米素)等。其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA。在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长，细胞分裂素与生长素互相作用，当组织内细胞分裂素生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。因而，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、是长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。生长调节物质的使用甚微，一般用mgL表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部

16、位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.055mgL，细胞分裂素0.0510mgL。5培养材料的支持物(1)琼脂(agar)在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40即凝固为固体状凝胶。通常所讲的煮化培养基，就是使琼脂溶解于90以上的热水。琼脂的用量在610gL之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、干净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高

17、压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐步丧失凝固能力。参加琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究等，但它也有不少缺点，如培养物与培养基的接触(即吸收)面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用，同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收外表，对组织产生毒害作用。市售的各种琼脂几乎都含有杂质，十分是Ca、Mg及其他微量元素。因而在研究植物组织或细胞的营养问题时，则应避免使用琼脂。可在液体培养基外表安顿一个无菌滤纸制成的滤纸桥，然后在滤纸桥

18、上进行愈伤组织培养。(2)其他有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。6抗生物质(antibiotic)抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在520mgL之间。添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其是快速繁衍中，常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物，采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间。尤其对大量通气长期生素各有其抑菌谱，要加以选择试用，可以两种抗生素混用。但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用，可能某些植物适宜用青霉素，而另一些植物却不大适应。值得提醒的是，在工作中不能以为有了抗菌素，而放松灭菌措施。此外，在停止抗生素使

19、用后，往往污染率显著上升，这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成的。7抗氧化物(antioxide)植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以致黑色，这就是酚污染。这些物质渗出细胞外就造成本身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。在木本，尤其是热带木本及少数草本植物中较为严重。目前还没有彻底完善的办法，只能按不同的实际情况，加用一些药物，并适当降低培养温度、及时转移到新鲜培养基上等办法，使之有不同程度的缓解，当然像严格选择外植体部位、加大接种数量等也应一并考虑。抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及Vc，可用

20、50200mgL的浓度洗涤刚切割的外植体伤口外表，或过滤灭菌后参加固体培养基的表层。其他抗氧化剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯等。8.活性炭(activecarbon)活性炭为木炭粉碎经加工构成的粉沫构造，它构造疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至解吸附。通常使用浓度为0.50.8L。它能够吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糖醛及激素等。茎尖初代培养，参加适量活性炭，能够吸附外植体产生的致死性褐

21、化物；其效力优于Vc和半胱氨酸；在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的构成和伸长，但其作用有一个阀值，一般为0.10.2，不能超过0.2。活性炭在生根时有明显的促进作用，其机理一般以为与活性碳减弱光照有关，可能是由于根顶端产生促进根生长的IAA，但IAA易受可见光的光氧化而毁坏，因而活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了IAA，进而间接促进了根的生长，由于根的生长加快，吸收能力加强，反过来又促进了茎、叶的生长。此外，在培养基中参加0.3活性炭，还可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用。活性炭在胚胎培养中也有一定作用，如在葡萄胚珠培养时向培养基参加0.1的活性炭，可减少组织变褐和培

22、养基变色，产生较少的愈伤组织。但是，活性炭具有副作用，研究表示，每毫克的活性炭能吸附100ng左右的生长调节物质，这讲明只需要极少量的活性炭就能够完全吸附培养基中的调节物质。大量的活性炭参加会削弱琼脂的凝固能力，因而要多加一些琼脂。很细的活性炭也易沉淀，通常在琼脂凝固之前，要轻轻摇动培养瓶。总之，那种随意抓一撮活性碳放入培养基，会带来不良的后果。因而，在使用时要有其量的意识,使活性炭发挥其积极作用。二、常用培养基的种类、配方及其特点一培养基的种类养基。培养基的产生最早是Sacks(1680)和Knop(1681)，他们对绿色植物的成分进行了分析研究，根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了

23、由无机盐组成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。以后根据不同目的进行改进产生了多种培养基，White培养基在40年代用得较多，如今还常用。而到60和70年代则大多采用MS等高浓度培养基，能够保证培养材料对营养的需要，并能生长快、分化快，且由于浓度高，在配制、消毒经过中某些成分有些出入，也不致影响培养基的离子平衡。培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)，也有对某些成分进行改进称作改进培养基。二几种常用培养基的配方三几种常用培养基的特点目前国际上流行的培养基有几十种，

24、常用的培养基及特点如下：1MS培养基它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较适宜，可知足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。2White培养基是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改进，称作White改进培养基，提高了MgSO4：的浓度和增加了硼素。其特点是无机盐数量较低，适于生根培养。3N6培养基是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简

25、单，KN03和(NH4)：S042-含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。4B5培养基是1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物十分是木本植物。5KM-8P培养基它是1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。三、培养基的配制一母液的配制和保存在植物组织培养工作中，配制培养基是日常必备的工作。为简便起见，通常先配制一系列母液，即储备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液，

26、这样不但能够保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高10100倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如Ca2+和S042-，Ca2+，Mg2+和PO43-一起溶解后，会产生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。药品的称量及定容都要准确。各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液，其用时再按比例稀释。下面以MS培养基制备为例，概述其制备方法1大量元素母液可配成浓度10倍母液。

27、用分析天平按表2-3称取药品，分别加100ml左右蒸馏水溶解后，再用磁力搅拌器搅拌，促进溶解。注意Ca2+和阳Po43-易发生沉淀。然后倒人1000ml定容瓶中，再加水定容至刻度，成为10倍母液。2微量元素母液可配成浓度配成比100倍的母液。用分析天平按表准确称取药品后，分别溶解，混合后加水定容至1000ml。3铁盐母液可配成100倍的母液，按表称取药品，可加热溶解，混合后加水定容至1000ml。4有机物母液可配成500倍的母液。按表分别称取药品，溶解，混合后加水定容至500ml。5激素母液的配制每种激素必须单独配成母液，浓度一般配成1mgml。用时根据需要取用。由于激素用量较少，一次可配成5

28、0ml或100ml。另外，多数激素难溶于水，要先溶于可溶物质，然后才能加水定容。它们的的配法如下：将IAA、IBA、GA等先溶于少量的95的酒精中。再加水定容-定浓度。NAA可先溶于热水或少量95的酒精中，再加水定容到一定浓度。2，4-D可用少量1molNaOH溶解后，再加水定容到一定浓度。将Kt和BA先溶于少量1mol的HCI中再加水定容。将玉米素先溶于少量95的酒精中，再加热水到一定浓度。配制好的母液瓶上应分别贴上标签，注明母液名称、配制倍数、日期及配1L培养基时应取的量。二培养基的配制及其灭菌1.培养基的配制按表用量筒移取大量元素母液100ml，用专一对应的移液管分别汲取微量元素母液10

29、mi、铁盐母液10ml、有机物母液10ml，均置人1000ml定容瓶中，若不加任何激素，则为MSo培养基；若需加激素按配方移取激素母液即可。将已装母液的定容瓶用蒸馏水或自来水定容到1000ml，取13左右倒人小铝锅中加热。同时，称好30g蔗糖，称琼脂丝7g(或琼脂粉)，也倾人小铝锅中，边加热边搅拌，防止糊底。旺火煮开，再用文火加热，直至琼脂全部融化即清澈见底为度。(若用琼脂粉，应参加100ml左右的液体培养基，并搅拌均匀)。然后再倾入定容瓶内余下的液体培养基，摇摆均匀即可。培养基配好后，要调整pH值。用0.1M的NaOH或HCl液调成5.8pH值左右。在培养基配方不大变动的情况下可用经历法。能

30、够将连续三次测定所参加的酸或碱液的平均值作为以后调整的用量值。调后注意一定要摇动均匀，还要注意酸或碱液不要放置时间太久。2培养基的分装与灭菌培养基合成后要趁热分装，100ml的容器约装入3040ml培养基，即1L培养基约装35瓶左右。过多则浪费培养基，太少不易接种和影响生长。但要根据培养对象来决定。假如培养时间较长时，应适当多装培养基，生根等短期培养时，可适当少加培养基。写上培养基种类，准备灭菌。注意不能放置时间过长，以免产生污染。培养基用高压灭菌。打开锅盖，加水至水位线。把已装好培养基的三角瓶，连同蒸馏水及接种用具等放人锅筒内，装时不要过分倾斜培养基，以免弄到瓶口上或流出。然后盖上锅盖，对角旋紧螺丝，接通电源加热，当升至0.05MPa时，打开放气阀放气，回“0，后关闭放气阀。当气压上升到0.10MPa时，保压灭菌20min，到时停止加热。当气压回“0后打开锅盖，取出培养基，放于平台上冷凝。灭好的培养基不要放置时间太长，最多不能超过1周。作业：1、培养基包括哪些成分？各有何作用？2、扼要讲明MS培养基的基本组成3、配制母液的目的是什么？各有何特点？4、如何利用母液配制培养基？