12基因工程的基本操作步骤.ppt

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1、目的基因的获取目的基因的获取1基因表达载体的基因表达载体的构建构建23将目的基因导入将目的基因导入受体细胞受体细胞4目的基因的检测目的基因的检测与鉴定与鉴定一、目的基因的获取1 1目的基因主要是目的基因主要是编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因：如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等基因、具调控作用的因子等。2 2获取目的基因的常用方法：获取目的基因的常用方法：1 1、从基因文库中获

2、取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成未知序列未知序列已知序列已知序列反转录法反转录法目的基因的信使目的基因的信使RNARNA目的基因目的基因化学合成法化学合成法蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因合成合成推测推测推测推测单链单链DNADNA合成合成（三） 人工合成法在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用以利用DNA合成仪人工合成合成仪人工合成（一） 从基因文库中获取目的基因将含有将含有某种生物某种生物不同基因

3、的许多不同基因的许多DNA片断，导入到片断，导入到受体菌受体菌的的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。基因组文库：基因组文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因， 如：如：cDNA文库文库为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因基因基因文库的构建方法 基因组文库的构建基因组文库的构建提取某种生物的提取某种生物的全部全部DNADNA用适当的限制酶酶切用适当的限制酶酶切一定大小的一定大小的

4、DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接重组载体重组载体基因组文库基因组文库导入受体菌中储存导入受体菌中储存 cDNA文库的构建文库的构建-逆转录法：逆转录法： 提取某种生物的某器官提取某种生物的某器官或或特定特定发育时期的发育时期的mRNAmRNA单链单链DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段重组载体重组载体与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶导入受体菌中储存导入受体菌中储存问题问题1 对于真核生物为什么用生对于真核生物为什么用生物发育某个时期的物发育某个时期的mRNA反转录得的反转录得的DNA只有这种

5、生物的部分基因？这个部分基因只有这种生物的部分基因？这个部分基因与原基因相同吗？与原基因相同吗？某个时期的发育是某个时期的发育是基因选择性表达基因选择性表达的结果，的结果，而且与原基因不同，而且与原基因不同，不含非编码区和内含不含非编码区和内含子子。 怎样从基因文库中获取我们怎样从基因文库中获取我们所需的目的基因呢所需的目的基因呢? ? 根据目的基因的相关信息根据目的基因的相关信息：如根据：如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物在染色体上的位置、基因的转录产物mRNAmRNA、基因的表达产物蛋白质等特性来、基因的表达产物蛋白质

6、等特性来获取目的基因。获取目的基因。问题问题2（二）利用PCR技术扩增目的基因1 1概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。 多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段3 3前提：前提：DNADNA复制复制模板模板DNADNA；引物一对；四种脱氧核苷；引物一对；四种脱氧核苷酸；热稳定酸；热稳定DNADNA聚合酶聚合酶2 2原理：原理：原料：原料：已知目的基因的一段核苷酸序列已知目的基因的一段核苷酸序列PCR技术的操作过程a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：）：双链双链DNADNA模板

7、在热作用下，模板在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性55-6555-65）：）：系统温度降低，系统温度降低，引物引物与与DNADNA模模板结合，形成局部板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶的作用下，合成与模的作用下，合成与模板互补的板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链d.重复重复a.b.ca.b.c步骤：每重复步骤：每重复一次，目的基因增加一次，目的基因增加_倍倍一一PCRPCR技术扩增过程技术扩增过程变性变性退火退火延伸延伸PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较PCR

8、技术技术DNA复制复制场所场所原理原理条件条件解旋方式解旋方式酶酶特点特点结果结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模四种脱氧核苷酸、模板、酶、板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模四种脱氧核苷酸、模板、酶、板、酶、ATP、引物引物DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋解旋酶催化解旋半保留复制、半保留复制、边解旋边复制边解旋边复制半保留复制、半保留复制、全解旋再复制全解旋再复制体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶、聚

9、合酶、解旋酶等解旋酶等二、基因表达载体的构建 基因工程的核心基因工程的核心1 1目的：目的：2 2基因表达载体基因表达载体的组成：的组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，并且可，并且可以以遗传遗传给下一代，同时使目的基因能够给下一代，同时使目的基因能够表达表达和发挥作用。和发挥作用。基因表达载体：位于基因的首端的一位于基因的首端的一段特殊的段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚聚合酶识别和结合的部位合酶识别和结合的部位，有了，有了它才能它才能驱动驱动基因

10、基因转录转录出出mRNAmRNA，最终获得蛋白质最终获得蛋白质：位于基因的尾端的一位于基因的尾端的一段特殊的段特殊的DNADNA片断，能片断，能终止终止mRNAmRNA的的转录转录：为了为了鉴别鉴别受体细胞受体细胞中是否含有目的基因，从而将中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞有目的基因的细胞筛选筛选出来出来基因表达载体的构建过程质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个两个切口切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个一个切口切口两个黏性末端两个黏性末端注意：载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都

11、有标记基因和复制的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体基础上增加了片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部分结构；三部分结构；用到的工具酶：用到的工具酶：既用到既用到限制酶限制酶切割载体，又用到切割载体，又用到DNADNA连接酶连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是学键都是磷酸二酯键磷酸二酯键；启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少；对于目的基因表达必不可少；目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体必需以表达载体

12、的方式携带进去。的方式携带进去。 三、将目的基因导入受体细胞1 1转化：转化：2 2常用的受体细胞：常用的受体细胞：3 3目的基因导入受体细胞的原理：目的基因导入受体细胞的原理：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。内维持稳定和表达的过程。大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。和动植物细胞等。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径（一）目的基因导入植物细胞1.1.农杆菌转化法农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点： 原理：原理：易感染易感染双子叶双子叶植物和植物和

13、裸子裸子植物（植物（酚类化合酚类化合物物），对大多数单子叶植物没有感染能力。），对大多数单子叶植物没有感染能力。TiTi质粒上的质粒上的TDNATDNA可以转移到受体细胞，可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞构建基因表达载体构建基因表达载体转入转入农杆菌农杆菌植物细胞植物细胞导入导入稳定维持和表达稳定维持和表达过程：过程：（一）目的基因导入植物细胞2.2.基因枪法：基因枪法：目的基因导入目的基因导入单子叶植物细胞单子叶植物细胞 操作方法：利用压缩气体产生的动力操作方法：利用压缩气体产生的动力 ，

14、将，将包裹在金属粒表面的表达载体包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。 钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um 。 适用：适用：单子叶植物单子叶植物（一）目的基因导入植物细胞3.3.花粉管通道法：花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞 操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通（含的基因）使目的基因

15、借助花粉管通道进入受体细胞道进入受体细胞 特点特点:十分简便经济。十分简便经济。 例：转基因抗虫棉例：转基因抗虫棉（二）将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法过程：过程：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物（三）将目的基因导入微生物细胞1.1.微生物作受体细胞原因微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少2.2.常用菌：大肠杆菌常用菌：大肠杆菌3.3.常用法：常用法：CaCa 处理处理获得感受态细胞获得感受态细胞4.4.过程：过程：小结：将目的

16、基因导入受体细胞生物种类生物种类植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞微生物细胞微生物细胞常用方法常用方法农杆菌转化法农杆菌转化法显微注射技术显微注射技术CaCa2+2+处理法处理法受体细胞受体细胞体细胞体细胞受精卵受精卵原核细胞原核细胞转化过程转化过程将目的基因插入到将目的基因插入到TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上农杆菌农杆菌导入植导入植物细胞物细胞整合到受整合到受体细胞的体细胞的DNADNA表表达达将含有目的基因将含有目的基因的表达载体提纯的表达载体提纯取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射受受精卵发育精卵发育获得获得具有新性状的动具有新性状的动物物CaCa2+2+处理细胞处理

17、细胞感受态细胞感受态细胞重组表达载重组表达载体与感受态细体与感受态细胞混合胞混合感受感受态细胞吸收态细胞吸收DNADNA分子分子 四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组入重组DNADNA分子吗？分子吗？1 12 2目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？维持和表达？ （一）鉴定分子水平的鉴定转基因生转基因生物的物的DNA探针探针15151414方法方法 DNA分子杂交技术分子杂交技术（一）鉴定分子水平的鉴定方法方法 分子杂交技术分子杂交技术探针探针1515转基因生物转基因生物的的mRNA1

18、414（一）鉴定分子水平的鉴定提取提取苏云金杆菌苏云金杆菌Bt毒素蛋白毒素蛋白将将Bt毒蛋白注毒蛋白注射小鼠体内射小鼠体内从小鼠血管抽出从小鼠血管抽出血液分离出抗血液分离出抗Bt毒素的抗体毒素的抗体抗体抗体蛋白质蛋白质 出现出现杂交带杂交带脱分化脱分化组织培养组织培养（二）鉴定个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验抗虫、抗病接种实验，活性比较实验例：用棉铃饲喂棉例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。抗虫基因并得到表达。思考？思考？非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子终止子终止子基因的结构基因的结构启动子启动子原核原核真核真核