03－蛋白质(3-4)1110.ppt

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1、第三节第三节 蛋白质分子的结构蛋白质分子的结构肽链在空间卷曲折叠成为特定的三维构象，使肽链在空间卷曲折叠成为特定的三维构象，使蛋白质分子具有极其复杂的空间结构。蛋白质分子具有极其复杂的空间结构。目前已确定蛋白质具有一级结构、二级结构，目前已确定蛋白质具有一级结构、二级结构，三级结构和四级结构等四个主要结构层次。三级结构和四级结构等四个主要结构层次。为了研究方便，在二、三级结构之间又划分出为了研究方便，在二、三级结构之间又划分出了超二级结构和结构域等两个层次。了超二级结构和结构域等两个层次。第三节第三节 蛋白质分子的结构蛋白质分子的结构一、蛋白质的构象和维持构象一、蛋白质的构象和维持构象的作用力

2、的作用力二、蛋白质的一级结构二、蛋白质的一级结构三、蛋白质的三维构象三、蛋白质的三维构象四、蛋白质结构与功能的关系四、蛋白质结构与功能的关系一、蛋白质的构象和维持构象的作用力一、蛋白质的构象和维持构象的作用力1. 构象与构型构象与构型2. 维持蛋白质构象的作用力维持蛋白质构象的作用力1. 构象与构型构象与构型构象构象:指分子中的取代基团当单键旋转时指分子中的取代基团当单键旋转时形成的不同立体结构；形成的不同立体结构；构型构型:是指立体异构分子中被取代的原子是指立体异构分子中被取代的原子或基团在空间的取向，是给定原子之间的或基团在空间的取向，是给定原子之间的几何关系，如几何异构体和光学异构体。几

3、何关系，如几何异构体和光学异构体。2. 维持蛋白质构象的作用力维持蛋白质构象的作用力疏水作用疏水作用氢键氢键盐键盐键范德华力范德华力二硫键二硫键2. 维持蛋白质构象的作用力维持蛋白质构象的作用力疏水作用疏水作用 蛋白质分子的非极蛋白质分子的非极性基团避开水相互性基团避开水相互聚集在一起而形成聚集在一起而形成的作用力称为疏水的作用力称为疏水作用，也称疏水键；作用，也称疏水键；2. 维持蛋白质构象的作用力维持蛋白质构象的作用力氢键氢键 氢键是由极性很强的氢键是由极性很强的X-H基上基上的氢原子与另一个电负性强的原子的氢原子与另一个电负性强的原子Y（如（如O、N、F等）相互作用形成的一等）相互作用形

4、成的一种吸引力；种吸引力；2. 维持蛋白质构象的作用力维持蛋白质构象的作用力盐键盐键 盐键是带相反电荷的基团之盐键是带相反电荷的基团之间的静电引力，也称为离子键；间的静电引力，也称为离子键；2. 维持蛋白质构象的作用力维持蛋白质构象的作用力范德华力范德华力 范德华力是一种非特异范德华力是一种非特异性引力，任何两个相距性引力，任何两个相距0.30.4 nm的的原子之间都存在范德华力，范德华力原子之间都存在范德华力，范德华力比离子键弱；比离子键弱；2. 维持蛋白质构象的作用力维持蛋白质构象的作用力二硫键二硫键 二硫键二硫键是很强的共价键，是很强的共价键，由多肽链内或链间由多肽链内或链间两个半胱氨酸

5、残基两个半胱氨酸残基的巯基氧化形成的巯基氧化形成 ；2. 维持蛋白质构象的作用力维持蛋白质构象的作用力疏水键疏水键氢键氢键盐键盐键范德华力范德华力二硫键二硫键二、蛋白质的一级结构二、蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构就是蛋白质多就是蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序，又肽链中氨基酸残基的排列顺序，又被称为被称为氨基酸序列；氨基酸序列；在有二硫键的蛋白质中，一级结在有二硫键的蛋白质中，一级结构也包括二硫键和其配对方式。构也包括二硫键和其配对方式。二、蛋白质的一级结构二、蛋白质的一级结构 19651965年，我国在世界上第一个用化学年，我国在世界上第一个用化学方法人工合成的蛋白质方法

6、人工合成的蛋白质-牛胰岛素。牛胰岛素。二、蛋白质的一级结构二、蛋白质的一级结构迄今已有约迄今已有约3030多万种蛋白质的一级结构多万种蛋白质的一级结构被研究确定。被研究确定。最大的肽链是肌肉中的肌巨蛋白（又称最大的肽链是肌肉中的肌巨蛋白（又称肌联蛋白），相对分子质量约肌联蛋白），相对分子质量约3 000 KD3 000 KD，相当于由相当于由27 00027 000个氨基酸残基构成；个氨基酸残基构成；最小的活性肽链是甜味二肽，即天冬酰最小的活性肽链是甜味二肽，即天冬酰苯丙氨酸甲酯。苯丙氨酸甲酯。三、蛋白质的三维构三、蛋白质的三维构象象1蛋白质分子的二级结构蛋白质分子的二级结构2蛋白质分子的三级

7、结构蛋白质分子的三级结构3蛋白质分子的四级结构蛋白质分子的四级结构1蛋白质分子的二级结构蛋白质分子的二级结构蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构:指多肽链中主链原子指多肽链中主链原子的局部空间排布即构象，不涉及侧链部分的局部空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象。的构象。二级结构中具有规则构象和不规则构象；二级结构中具有规则构象和不规则构象；规则构象规则构象:是一段连续肽单位中具有同一是一段连续肽单位中具有同一相对取向，可以用相同构象来表征，主要相对取向，可以用相同构象来表征，主要形式包括形式包括螺旋、螺旋、折叠和折叠和转角转角。不规则构象不规则构象:主要是无规则卷曲主要是无规则卷曲 。1蛋白质分子

8、的二级结构蛋白质分子的二级结构（1）螺旋螺旋（2）折叠折叠（3）转角转角（4）无规则卷曲）无规则卷曲（1）螺旋螺旋螺旋是首先被肯定的一种蛋白质空间结螺旋是首先被肯定的一种蛋白质空间结构基本组件。构基本组件。最初提出最初提出螺旋结构的是美国加州理工学螺旋结构的是美国加州理工学院的院的L. Pauling等人，他们在等人，他们在1951年研究动年研究动物毛发物毛发-角蛋白时提出此观点。角蛋白时提出此观点。（1）螺旋螺旋最常见的二级结构形式最常见的二级结构形式（1）螺旋螺旋天然蛋白质以右手型螺旋为主天然蛋白质以右手型螺旋为主（1）螺旋螺旋氢键是稳氢键是稳定定螺旋的螺旋的主要化学键主要化学键氢键是由每

9、氢键是由每个氨基酸残个氨基酸残基的基的N-H与与前面隔三个前面隔三个氨基酸残基氨基酸残基的的C=0形成形成的。的。（1）螺旋螺旋每个螺旋周期每个螺旋周期包含包含3.6个氨基酸残个氨基酸残基，螺距为基，螺距为0.54 nm，每个氨基酸，每个氨基酸沿螺旋轴的长度上沿螺旋轴的长度上升升0.15 nm。（1）螺旋螺旋沿主链计数，一个氢键闭合的环包括沿主链计数，一个氢键闭合的环包括13个原子个原子，故，故螺旋也称为螺旋也称为3.613螺旋。螺旋。 （1）螺旋螺旋肽链中氨基酸侧链肽链中氨基酸侧链R分布在螺旋外侧，其分布在螺旋外侧，其形状、大小及电荷影响形状、大小及电荷影响螺旋的形成。螺旋的形成。例如，链中

10、有脯氨酸，则螺旋被中断，产生例如，链中有脯氨酸，则螺旋被中断，产生一个一个“结节结节”。HNCOHO脯氨酸脯氨酸（1）螺旋螺旋甘氨酸由于没有侧链甘氨酸由于没有侧链的约束，难以形成的约束，难以形成-螺旋所需的二面角。螺旋所需的二面角。如肽链中连续存在带如肽链中连续存在带相同电荷的氨基酸相同电荷的氨基酸，由于同性电荷相斥也由于同性电荷相斥也会影响会影响-螺旋不稳定。螺旋不稳定。甘氨酸甘氨酸（1）螺旋螺旋-螺旋结构特点总结螺旋结构特点总结;天然蛋白质以右手型螺旋为主；天然蛋白质以右手型螺旋为主；氢键氢键是稳定是稳定螺旋的主要化学键；螺旋的主要化学键；每个螺旋周期包含每个螺旋周期包含3.6个氨基酸残基

11、，螺个氨基酸残基，螺距为距为0.54 nm，每个氨基酸沿螺旋轴的长度，每个氨基酸沿螺旋轴的长度上升上升0.15 nm；肽链中氨基酸侧链肽链中氨基酸侧链R分布在螺旋外侧，分布在螺旋外侧，其形状、大小及电荷影响其形状、大小及电荷影响螺旋的形成。螺旋的形成。（2）折叠折叠折叠是天然蛋白质中另一种基本结构折叠是天然蛋白质中另一种基本结构组件，又称组件，又称片层。片层。是是L. Pauling和和R. B. Corey继发现继发现-螺旋螺旋结构后在同年发现的另一种蛋白质二级结结构后在同年发现的另一种蛋白质二级结构。构。（2）折叠折叠折叠结构是由两条肽链或一条肽链内折叠结构是由两条肽链或一条肽链内的各肽段

12、之间的的各肽段之间的C=O与与NHH形成氢键形成氢键而构成的，它是一种肽链相当伸展的重复而构成的，它是一种肽链相当伸展的重复性结构。性结构。可分为平行式和反平行式两种类型。可分为平行式和反平行式两种类型。（2）折叠折叠 平行式平行式反平行式反平行式所有肽所有肽链的链的N-N-端都在端都在同一边同一边相邻两相邻两条肽链条肽链的方向的方向相反相反（2）折叠折叠两条或多条链两条或多条链平行，氢键交联平行，氢键交联, , 锯齿状锯齿状（2）折叠折叠其结构要点如下：其结构要点如下：肽主链处于最伸展的构象，主要作用力肽主链处于最伸展的构象，主要作用力-氢键氢键多在股间而不是股内。多在股间而不是股内。碳原子

13、位于折叠线上，由于其四面体性质，碳原子位于折叠线上，由于其四面体性质，连续的酰胺平面排列成折叠形式。在折叠片上的连续的酰胺平面排列成折叠形式。在折叠片上的侧链都垂直于折叠片的平面，并交替地从平面上侧链都垂直于折叠片的平面，并交替地从平面上下两侧伸出下两侧伸出。（2）折叠折叠其结构要点如下：其结构要点如下：平行折叠片比反平行折叠片更规则平行折叠片比反平行折叠片更规则，且一般是，且一般是大结构，而反平行折叠片可以少到仅由两个大结构，而反平行折叠片可以少到仅由两个股股组成。平行的组成。平行的片层结构中，两个残基的间距为片层结构中，两个残基的间距为0.65 nm；反平行的；反平行的片层结构，则间距为片

14、层结构，则间距为0.70 nm。（2）折叠折叠主要是由两条肽主要是由两条肽链之间形成。链之间形成。也可以在同一肽也可以在同一肽链的不同部分之间链的不同部分之间形成。形成。氢键氢键（3）转角转角蛋白质分子中，肽链经常会出现蛋白质分子中，肽链经常会出现180的的回折，在这种回折角处的构象就是回折，在这种回折角处的构象就是转角，转角，也被称为也被称为弯曲、弯曲、回折和发夹结构。回折和发夹结构。转角使肽链走向改变，一般含有转角使肽链走向改变，一般含有216个个氨基酸残基氨基酸残基 。（3）转角转角主要结构特点有：主要结构特点有：转角中，第一个氨基酸残基的转角中，第一个氨基酸残基的-CO-与第四个残基的

15、与第四个残基的-NH-形成氢键。形成氢键。转角的特定构象在一定程度上取决转角的特定构象在一定程度上取决于它的氨基酸组成。于它的氨基酸组成。（3）转角转角-转角转角（4）无规则卷曲）无规则卷曲无规则卷曲又称为自由回转，指没有特定无规则卷曲又称为自由回转，指没有特定规律的松散肽链结构。规律的松散肽链结构。肽的这种构象可能对蛋白质多变的立体结肽的这种构象可能对蛋白质多变的立体结构与复杂功能具有贡献，已经鉴定到某些构与复杂功能具有贡献，已经鉴定到某些蛋白质中仅有这种结构，称为固有的无结蛋白质中仅有这种结构，称为固有的无结构蛋白质。构蛋白质。 1蛋白质分子的二级结构蛋白质分子的二级结构 螺旋螺旋折折叠片

16、叠片转角转角无规无规卷曲卷曲1蛋白质分子的三级结构蛋白质分子的三级结构蛋白质三级结构是指上述蛋白质的蛋白质三级结构是指上述蛋白质的螺旋、螺旋、折叠以及折叠以及转角等二级结构受转角等二级结构受侧链和各主链构象单元间的相互作用，侧链和各主链构象单元间的相互作用，从而进一步卷曲、折叠成具有一定规从而进一步卷曲、折叠成具有一定规律性的三维空间结构。律性的三维空间结构。蛋白质三级结构的稳定主要靠次级蛋白质三级结构的稳定主要靠次级键，包括疏水作用、氢键、盐键、范键，包括疏水作用、氢键、盐键、范德华力等，还有二硫键等，其中疏水德华力等，还有二硫键等，其中疏水作用是主要作用力。作用是主要作用力。1蛋白质分子的

17、三级结构蛋白质分子的三级结构磷酸丙糖异构酶的三级结构磷酸丙糖异构酶的三级结构 1蛋白质分子的三级结构蛋白质分子的三级结构在蛋白质二级结构与三级结构之间，在蛋白质二级结构与三级结构之间，还有一些过渡结构层次，主要是超二级还有一些过渡结构层次，主要是超二级结构和结构域。结构和结构域。超二级结构是由超二级结构是由S. T. Rao和和M. G. Rossmann于于1973年提出的，指多肽链年提出的，指多肽链上若干相邻的构象单元彼此作用，进一上若干相邻的构象单元彼此作用，进一步组合而成的结构组合体。超二级结构步组合而成的结构组合体。超二级结构有有（螺旋（螺旋-环环-螺旋）、螺旋）、（折叠（折叠-螺螺

18、旋旋-折叠）、折叠）、（发夹）、希腊钥匙等（发夹）、希腊钥匙等多种组合类型。多种组合类型。 1蛋白质分子的三级结构蛋白质分子的三级结构常见的超二级结构常见的超二级结构 1蛋白质分子的三级结构蛋白质分子的三级结构结构域结构域是主要存在于球状蛋白质分子是主要存在于球状蛋白质分子中的两个或多个相对独立的、在空间上中的两个或多个相对独立的、在空间上可以明显区分的三级折叠实体。一个分可以明显区分的三级折叠实体。一个分子中的结构域区间以共价键相连。子中的结构域区间以共价键相连。 1蛋白质分子的三级结构蛋白质分子的三级结构免疫球蛋白的一个结构域免疫球蛋白的一个结构域丙酮酸激酶的一个结构域丙酮酸激酶的一个结构

19、域1蛋白质分子的三级结构蛋白质分子的三级结构2蛋白质分子的三级结构蛋白质分子的三级结构无三级无三级结构结构形成三形成三级结构级结构2蛋白质分子的三级结构蛋白质分子的三级结构2蛋白质分子的三级结构蛋白质分子的三级结构 肌红蛋白的三级结构肌红蛋白的三级结构3蛋白质分子的四级结构蛋白质分子的四级结构蛋白质四级结构是指在亚基和亚基之间通过蛋白质四级结构是指在亚基和亚基之间通过疏水作用等次级键结合成为有序排列的特定疏水作用等次级键结合成为有序排列的特定空间结构。空间结构。四级结构的球状蛋白质往往由几个被称为亚四级结构的球状蛋白质往往由几个被称为亚基的单位组成，这些单位有时也称为单体。基的单位组成，这些单

20、位有时也称为单体。亚基通常由一条多肽链组成，有时含两条以亚基通常由一条多肽链组成，有时含两条以上的多肽链，单独存在时一般没有生物活性。上的多肽链，单独存在时一般没有生物活性。3蛋白质分子的四级结构蛋白质分子的四级结构蛋白质可据四级结构分为单体蛋白质、蛋白质可据四级结构分为单体蛋白质、二聚体、三聚体二聚体、三聚体寡聚体和多聚体。寡聚体和多聚体。寡聚蛋白质可以由单一类型的亚基组成，寡聚蛋白质可以由单一类型的亚基组成，称为同聚蛋白质，也可以由几种不同类型称为同聚蛋白质，也可以由几种不同类型的亚基组成，称为杂聚蛋白质。的亚基组成，称为杂聚蛋白质。3蛋白质分子的四级结构蛋白质分子的四级结构血红蛋白血红蛋

21、白A A 烟草斑纹病毒的外壳蛋白烟草斑纹病毒的外壳蛋白3蛋白质分子的四级结构蛋白质分子的四级结构3蛋白质分子的四级结构蛋白质分子的四级结构四、蛋白质结构与功能的关系四、蛋白质结构与功能的关系自学。自学。第四节第四节 蛋白质结构测定与多肽人工合成蛋白质结构测定与多肽人工合成一、一级结构的研究方法一、一级结构的研究方法二、研究蛋白质构象的方法二、研究蛋白质构象的方法三、肽的人工合成三、肽的人工合成一、一级结构的研究方法一、一级结构的研究方法1测定氨基酸的组成测定氨基酸的组成2蛋白质的蛋白质的N-末端和末端和C-末端的测定末端的测定3二硫键的拆开和肽链的分离二硫键的拆开和肽链的分离4肽链的部分水解和

22、肽段的分离肽链的部分水解和肽段的分离5肽段氨基酸顺序的测定肽段氨基酸顺序的测定6二硫键位置的确定二硫键位置的确定1测定氨基酸的组成测定氨基酸的组成确定蛋白质所含氨基酸的种类，并明确确定蛋白质所含氨基酸的种类，并明确每种氨基酸有多少。每种氨基酸有多少。目前较为成功的是将蛋白质经目前较为成功的是将蛋白质经6 mol/L HCl在在110下水解下水解24 h后，用氨基酸自动后，用氨基酸自动分析仪进行测定。分析仪进行测定。 2蛋白质的蛋白质的N-末端和末端和C-末端的测定末端的测定（1）N-末端测定方法末端测定方法（2）C-末端分析方法末端分析方法（1）N-末端测定方法末端测定方法O2NFNO2+ H

23、2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸2,4-2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-N-端的游离端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNPDNP）。）。在酸性条件下水解，得到黄色在酸性条件下水解，得到黄色DNP-DNP-氨基酸。该产物能够氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的用乙醚抽提分离。不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色谱法进行氨基酸可以用色谱法进行鉴定。鉴定。Sanger Sanger 法法 （1）N-末端测定方法末

24、端测定方法EdmanEdman法法 此法最大优点是除去此法最大优点是除去N N末端氨基酸后剩下的肽链部分仍末端氨基酸后剩下的肽链部分仍是完整的。是完整的。因此，可以用来一步步地测定多肽链因此，可以用来一步步地测定多肽链N N末端的氨末端的氨基酸顺序。氨基酸自动分析仪就是根据此原理制成的。基酸顺序。氨基酸自动分析仪就是根据此原理制成的。NH2CHCOR2NCSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCHCOR1HNNH CHCOR2SNHCNHOCR1CHNCOCHNHSCR1苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯苯乙内酰硫脲苯乙内酰硫脲NH2CHCOR2+（1）N-末端测定方法末端测定方法丹磺酰氯法丹磺

25、酰氯法 N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-N-端氨端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰- -氨基酸。氨基酸。此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰- -氨基酸有氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到以达到1 1 1010-9-9molmol。（1）N-末端测定方法末端测定方法氨肽酶法氨肽酶法 从多肽从

26、多肽链的链的N-N-端逐个的向里水解端逐个的向里水解。可根据可根据不同的反应时间测出酶水解所释放不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的的N-N-末端残基顺序末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为亮氨酸残基为N-N-末端的肽键速度最大末端的肽键速度最大。（2）C-末端分析方法末端分析方法H2NCH CROHNCH CROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCH CRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸 多肽与肼在

27、无水条件下加热，多肽与肼在无水条件下加热，C-C-端氨基酸即从端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-C-端端氨基酸分离。氨基酸分离。肼解法肼解法 （2）C-末端分析方法末端分析方法羧肽酶水解法羧肽酶水解法 能从多肽链能从多肽链的的C-C-端逐个的水解。根据不同的反应端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的从而知道蛋白质的C-C-末端残基顺序末端残基顺序。目前常用的

28、羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y。A A和和B B来自来自胰脏；胰脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自面包酵母来自面包酵母。羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端末端氨基酸残基；氨基酸残基；B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末端残基的末端残基的肽键肽键。但实际有时相连的氨基酸以相近的速度释放，结但实际有时相连的氨基酸以相近的速度释放，结果不好分析。果不好分析。（2）C-末端分析方法末端分析方法羧肽酶水解法羧肽酶水解法 （2）C-末端分析方法末端分析方法氨基酸的释放氨基酸的释放量（摩尔数）量（摩尔数）反应时间反应时间GlySerVal判断序列判断序列 -Val-Ser-Gly-COOH羧肽酶水解法羧肽酶水解法 第五节第五节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质