叶酸抑制胃癌细胞论文-精品文档.docx

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1、叶酸抑制胃癌细胞论文1实验资料1.1实验分组按事先转染的成分不同以及后续培养基不同分为先行PLK1siNA干扰然后在无叶酸培养基中培养72h组(Null+PLKS组)、先行PLK1siNA干扰然后在正常叶酸浓度培养基中培养72h组(Control+PLKS组)、无PLK1siNA而用PBS作对照的转染然后在无叶酸培养基中培养72h组(Null+PBS组)、无PLK1siNA而用PBS作对照的转染然后在正常叶酸浓度培养基中培养72h组(Control+PBS组)。1.2实验方法1.2.1PLK1siNALipofectamineTM2000的转染转染经过严格根据讲明书施行。其基本步骤为:转染前2

2、4h，在每块6孔板的每个孔内用2mL不含双抗的PMI1640培养基接种对数生长期的肿瘤细胞5105个。经过24h，细胞融合度为40%。用250LOptiMEM培养基稀释siNA(siNA的量为100pmol)，混匀。用250LOptiMEM稀释50LLipofectamineTM2000，混匀，室温下静置5min。将以上混合转染试剂和siNA稀释液混匀，室温下静置20min。转染复合物参加到6孔细胞板中，前后轻摇细胞板混合均匀。转染6h后换新鲜培养基。1.2.2ealtimePC和Westernblot验证PLK1siNA干扰的效果细胞置于37、5%CO2培养箱中培养72h，然后用IPA和Tr

3、izol分别提取蛋白和NA。蛋白以GAPDH为内参，用Westernblot检验其表达差异。siNA经反转录成cDNA后行ealtime检测PLK1siNA的转录水平差异。PLK1和GAPDH的引物由上海生工合成，引物序列见表1。1.2.3CCK8检测细胞增殖情况经不同PLK1siNA干扰或者PBS作为对照的干扰组，6h后，胰酶消化收集细胞，将其按96孔板每个孔2000个细胞的密度接种，每次取5复孔，按4组要求分别参加正常叶酸浓度的培养基和不含叶酸的培养基后，分别培养72h，然后弃去培养基，分别参加上述对应的培养基100mL和CCK810L的混合液，在培养箱内孵育3h，检测吸光度，观察细胞增殖

4、情况。1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡和增殖情况在6孔板转染后，经不同PLK1siNA干扰或者PBS作为对照的干扰组，干扰6h后吸去干扰液，按4组要求分别参加正常叶酸浓度的培养基和不含叶酸的培养基，培养72h。收取上清液中的悬浮细胞+胰酶消化后的细胞，离心，PBS洗2次。然后按AnnexinV试剂盒操作流程染色。实验总共设一个阴性对照管、AnnexinV和PI单染管和实验管，每管细胞约1106。室温避光孵育15min，流式上机检测细胞凋亡情况。对于周期，收集的各组细胞参加70%(PBS稀释)20无水乙醇23mL，4固定6h以上。1500r/min去上清，1mLPBS1500r/min5min清

5、洗1遍，参加200LPBS重新悬浮，调整细胞浓度为106107，参加1%的nase60L，37摇床水浴30min。参加20L250g/mL的PI，室温避光孵育10min上机检测。1.2.5Westernblot检测Bcl2表达情况IPA提取蛋白后，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物研究所)测定蛋白浓度，调整浓度后用SDS上样缓冲液加热变性后，蛋白电泳检测蛋白表达差异。1.3统计学方法使用SPSS190软件包进行统计处理。所有结果用均数标准差(x珋s)表示。各组间差异比拟使用析因方差分析，多组间均数比拟采用F检验，均数间的两两比拟采用q检验，P005为差异有统计学意义。2结果2.1各组PLK1

6、mNA水安然平静蛋白表达情况转染72h后检测PLK1mNA和蛋白的表达情况。eal-timePC检测发现胃癌细胞系SGC7901和BGC823，PLK1mNA在用PLK1siNA干扰的PLKS组较PBS干扰的PBS组明显降低，见图1。同样，在蛋白表达水平上，Westernblot显示经PLK1siNA干扰，胃癌细胞系SGC7901和BGC823的PLK1蛋白水平也明显降低，见图2及图3。2.2各组SGC7901和BGC823细胞增殖情况比拟在接种一样数目细胞的前提下，细胞数目少反映PLKS组细胞增殖较慢。析因方差分析显示叶酸缺乏和PLK1siNA对SGC7901和BGC823细胞增殖均有明显影

7、响，且叶酸缺乏和PLK1siNA对胃癌细胞系SGC7901和BGC823有交互作用(P值分别为0046和0006)。因NullPLKS组均数NullPBS组均数+ControlPLKS均数ControlPBS组均数(SGC7901和BGC823细胞系计算值分别为02270316和03090485)，所以叶酸缺乏和PLK1对胃癌细胞系SGC7901和BGC823的增殖抑制具有协同作用。2.3各组SGC7901和BGC823细胞凋亡情况比拟AnnexinV检测细胞凋亡情况，流式图横坐标为标FITC的AnnexinV，纵坐标为PI。SGC7901的早期凋亡(Q4象限)在NullPLKS组、NullP

8、BS组、ControlPLKS组和ControlPBS组分别为(2642150)%，(513124)%，(1017176)%和(6.17247)%。BGC823的早期凋亡(Q4象限)在NullPLKS组、NullPBS组、ControlPLKS组和ControlPBS组分别为(2428290)%，(688205)%，(13302.58)%和(5.80301)%。析因方差分析得出，PLK1siNA能促进凋亡，但叶酸缺乏对凋亡影响不大;叶酸缺乏与PLK1siNA之间有交互效应。因NullPLKS组均数NullPBS组均数+ControlPLKS均数ControlPBS组均数(SGC7901和BGC

9、823细胞系计算值分别为:26429.13和24281438)，所以叶酸缺乏能加强PLK1对胃癌细胞系SGC7901和BGC823的促凋亡作用。2.4各组SGC7901和BGC823细胞周期情况SGC7901G2/M比例在NullPLKS组、NullPBS组、ControlPLKS组和ControlPBS组分别为(2088255)%，(832218)%，(1949198)%和(748168)%;BGC823G2/M比例在各组分别为(2295271)%，(1161266)%，(2201294)%和(1003247)%。对数据进行统计，发现PLK1siNA能提高G2/M比例(P005)，但叶酸缺乏

10、不能，而且叶酸缺乏和PLK1siNA之间也无交互作用(P005)。见图6及图7。2.5各组SGC7901和BGC823细胞Bcl2蛋白表达情况叶酸缺乏和PLK1siNA均能降低Bcl2的表达，而且叶酸缺乏和PLK1siNA对BCL2的表达有交互效应(P005)。鉴于两者NullPLKS组均数NullPBS组均数+ControlPLKS均数ControlPBS组均数，叶酸缺乏和PLK1siNA具有拮抗作用。3讨论肿瘤是一个全身性疾病，手术对肿瘤尤其是中晚期肿瘤其是胃癌治疗效果有限。基于肿瘤发生、发展机制的综合治疗，尤其是联合治疗有其特有的优势。PLK1作为PLK家族中被研究最多的一员，不仅在很多

11、肿瘤中表达升高，而且它的升高还对诸如胃癌、结直肠癌的预后判定具有价值。PLK1介入了数个至关重要的有丝分裂步骤，如激活CDC25c磷酸化酶、调节有丝分裂经过等。PLK1具有介入多个肿瘤发生、发展步骤的特点。所以，PLK1被以为是重要的分子靶标，并被广泛关注。Bcl2是一个经典的抗凋亡蛋白，降低Bcl2能促进肿瘤凋亡，抑制肿瘤生长。本实验运用PLK1的si-NA敲低PLK1后，胃癌细胞系SGC7901和BGC823的增殖降低，凋亡增加，细胞阻滞在G2/M期，且叶酸缺乏联合PLK1siNA能抑制Bcl2的表达，提示降低PLK1可能通过Bcl2途径起作用，这与其他研究的结果类似。叶酸是生物体代谢重要的一碳单位，叶酸类似物如甲氨蝶呤被用作肿瘤的治疗。本研究证明PLK1siNA能抑制胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡，叶酸缺乏也能抑制肿瘤的增殖，且叶酸能协同PLK1siNA抑制肿瘤细胞增殖和促进细胞凋亡。但在抑制胃癌细胞Bcl2的表达上有拮抗作用。笔者以为，这可能与蛋白的作用往往不是与浓度呈线性关系有关，该结果有待进一步研究。叶酸缺乏和PLK1siNA协同抑制肿瘤的意义在于，使用PLK1抑制剂时补充叶酸，尤其是大量补充应慎重。不仅如此，PLK1抑制剂联合临床使用的抗叶酸制剂，如甲氨蝶呤、普拉曲沙(pralatrexate)等，能否到达更好治疗肿瘤的目的也值得深化研究。