乙酰胆碱酯酶在农药乐果检测中的应用.docx

《乙酰胆碱酯酶在农药乐果检测中的应用.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《乙酰胆碱酯酶在农药乐果检测中的应用.docx（7页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、乙酰胆碱酯酶在农药乐果检测中的应用摘要:基于农药乐果对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，构建生物传感器，实现了农药乐果的快速、高灵敏检测。合成了纳米材料铂/碳球(Pt/Cs)，利用其比外表积大、导电性好的优势，构建乙酰胆碱酯酶(AChE)传感器。铂/碳球修饰电极比裸电极的阻抗更低，峰电流增加了147.06%，讲明该材料能很好地保持酶的催化活性。在最优实验条件下，用AChE传感器检测农药乐果，在1.01091.0106g/L范围，乐果浓度的负对数与抑制率呈良好的线性关系，其检出限为7.31012g/L(按抑制率为10%计算)。对纺织品样品进行加标回收实验，测得回收率为86.2%101.7%。关键词:铂/碳

2、球;生物传感器;乙酰胆碱酯酶;乐果;纺织品有机磷农药因效果好、成本低，在我国农村得到了广泛应用。但其在使用经过中，会残留在食品、纺织品中，进入人体，对人体产生致癌、致畸作用，近年来已被明确禁止使用。目前有机磷农药的检测方法中气相色谱质谱法应用最为普遍，但针对热稳定性差的农药(如乐果等)存在重现性差、结果不稳定的问题，而且检测成本较高、时间长、操作复杂，只合适在实验室进行，不适于现场实时检测1。电化学酶传感器法由于成本低、灵敏度高、样品用量少等优点，成为有机磷农药的重要分析方法之一。近年来多种基于乙酰胆碱酯酶(AChE)或者有机磷水解酶的电化学或光学传感器在有机磷农药的检测中发挥了重要作用25。

3、为了保护和提高酶的活性，提高传感器的灵敏度，金胶纳米粒子、碳纳米管等纳米材料被应用于电化学传感器中611。与碳纳米管相比，碳球具有能够负载客体分子的多孔纳米构造，粒度大小较均匀和较好的稳定性等优点1215。而纳米铂则具有良好的导电性和生物相容性，被广泛地应用于酶或生物分子的固定1617。本文合成了一种纳米复合材料铂/碳球，并利用其比外表积大、电子传导性好的优势，制备了灵敏的AChE传感器，用于检测有机磷农药乐果。该传感器具有较好的灵敏度、重现性和稳定性。目前尚未见该材料用于农药乐果检测的报道。1实验部分1.1试剂与仪器氯化硫代乙酰胆碱(ATCl，Sigma公司)，AChE(C3389型，500

4、U/mL，Sigma公司)，乐果标准溶液(分析纯，中国药品生物制品检定所)。实验所用的化学试剂均为分析纯。电化学实验在电化学工作站CHI660E(上海辰华仪器有限公司)上进行，实验采用三电极系统，玻碳电极(GC)为工作电极，铂(Pt)电极为对电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极为参比电极。1.2实验内容1.2.1碳球和铂/碳球材料的制备碳球和铂/碳球根据参考文献18制备，详细如下:碳球的制备以甲醛间苯二酚为先驱体，采用Stber方法，在8mL乙醇与20mL去离子水的混合溶液中参加0.1mL氨水(25%，质量分数)，1h后，参加0.2g间苯二酚，搅拌至完全溶解后，再滴加0.284mL甲醛溶液(

5、37%)，混合液在30搅拌24h，然后将混合液移至水热釜中，100反响24h，混合物经离心分离，100下枯燥48h。然后进行炭化处理，以1/min的升温速率加热至350，保持2h，再以1/min加热至600，煅烧4h，自然冷却至室温。铂/碳球采用乙二醇复原法制备，步骤为:取80mg碳球加至150mL乙二醇溶液中，超声分散30min后得到均匀碳浆，缓慢参加含20mgPt的氯铂酸溶液，搅拌2h后，滴加0.5mol/LNaOH溶液调至pH10.0，升温至130复原3h。冷却后真空抽滤，得黑色产物，用大量的去离子水洗涤，50枯燥12h，得到铂/碳球纳米复合材料。1.2.2电极制备分别取稀释至120U/

6、mL的AChE、0.5%戊二醛和1%的牛血清蛋白按体积比111混合，用交联法将6L111的酶混合液固定到裸电极外表，制作AChE/GC电极。分别取5L的Cs和Pt/Cs以及6L酶混合液，依次滴涂到电极外表，制作AChE/Cs/GC电极和AChE/Pt/Cs/GC电极。1.2.3纺织品样品溶液的制备纺织品样品先剪碎成5mm5mm碎片，称取1g，参加5mL0.2mmol/L磷酸盐缓冲液，90超声提取30min后，冷却待用。2结果与讨论2.1电极的电化学表征在5mmol/L铁氰化钾溶液中，依次对裸玻碳电极(GC)、碳球修饰电极(Cs/GC)、铂/碳球修饰电极(Pt/Cs/GC)进行循环伏安扫描，结果

7、如图1所示。由图1可知，GC电极的氧化峰电流为49.77A，Cs/GC电极的氧化峰电流为59.21A，峰电流升高了18.97%，Pt/Cs/GC电极的氧化峰电流为78.78A，峰电流升高了58.29%。由此可知，玻碳电极在碳球修饰后，反响外表积增大，电催化活性加强，反响速率加快，并且Pt/Cs/GC电极的导电性大于Cs/GC电极。在铁氰化钾溶液中，依次对裸GC电极、Cs/GC电极、Pt/Cs/GC电极进行沟通阻抗扫描，结果如图2所示。由图2可知，Cs/GC电极的电阻约为700，Pt/Cs/GC电极的电阻约为200，AChE/Pt/Cs/GC电极的电阻约为1000。所以Pt/Cs/GC电极的导电

8、性比Cs/GC电极强，灵敏度更高;AChE为非导电物质，能够阻碍电子的转移，所以AChE/Pt/Cs/GC电极的电阻较大，讲明酶已被很好地固定在电极上。2.2不同AchE传感器的电化学行为图3为不同电极在1.5mmol/L氯化乙酰胆碱(ATCl)PBS缓冲溶液中的差分脉冲伏安图。由图可知，AChE/GC电极上的峰电流为0.7136A，AChE/Cs/GC电极上的峰电流为1.260A，AChE/Pt/Cs/GC电极上的峰电流为1.763A。与AChE/GC电极相比，电极经Cs和Pt/Cs修饰后电流值分别增加了76.57%和147.06%。由此可知，用Cs和Pt/Cs修饰的玻碳电极，具有较高的电催

9、化活性以及较好的电极灵敏度，且用Pt/Cs具有更好的效果。2.3有机磷农药的抑制AChE能够催化底物氯化乙酰胆碱生成胆碱和乙酸，而产物胆碱可在电极上发生电化学氧化反响。有机磷农药会抑制AChE的催化活性，使底物生成的胆碱减少，氧化电流相应降低。AChE的抑制率公式如下:A=(I0I)/I0100%。其中，A表示AChE抑制率;I0表示酶未被农药抑制时胆碱发生氧化反响产生的峰电流值;I表示酶被农药抑制后电极上产生的峰电流值。图4为参加2.0103g/L的乐果标准液抑制16min前后的差分脉冲结果。由图可知，未加乐果时的峰电流值为2.982A，参加乐果标准液后，峰电流值为1.996A，下降了33.

10、07%。讲明乐果能有效抑制AChE的酶活性。2.4抑制时间的选择在1.5mmol/L的ATCl溶液中参加2.0106g/L乐果标准液后，每隔2min用差分脉冲伏安法扫描，作抑制率与时间的折线图。结果显示，随着抑制时间的增加，抑制率增大。16min后，抑制率趋于平缓。因而，选择乐果对酶的最佳抑制时间为16min。2.5标准曲线的绘制在AChE/Pt/Cs/GC电极上，参加不同浓度的乐果标准溶液，16min后用差分脉冲伏安法扫描，计算乐果的抑制率，绘制乐果浓度的负对数与抑制率的关系曲线。结果表明，抑制率随其浓度的增加而增加，在1.01091.0106g/L浓度范围内，抑制率(A)与乐果浓度(C)的

11、负对数呈良好的线性关系。线性方程为A=7.100lgC+89.07，相关系数(r2)为0.9967。根据抑制率为10%计算，得到检出限为7.31012g/L。2.6实际样品的检测将AChE/Pt/Cs/GC修饰电极置于含有1.5mmol/LATCl的PBS溶液中，用差分脉冲伏安法扫描，记录其峰电流。然后将电极置于含有1.5mmol/LATCl的纺织品样品提取液(PBS提取，不含农药)中，参加3种不同浓度的乐果标准品后，进行差分脉冲伏安法扫描，平行测定5次，计算其平均回收率(见表1)。结果显示，样品的回收率为86.2%101.7%，相对标准偏差(SD)为1.7%10.4%，方法的准确度与精细度能够知足实际检测的需求。3结论利用新型的纳米材料铂/碳球，构建乙酰胆碱酯酶生物传感器。铂/碳球/乙酰胆碱酯酶修饰电极能够催化底物氯化硫代乙酰胆碱的氧化复原反响。农药乐果对乙酰胆碱酯酶的催化活性能够产生抑制，纳米材料铂/碳球的纳米构造能够辅助固定生物分子，提高检测灵敏度。据此能够实现对纺织品中农药乐果的测定，建立纺织品中农药乐果的挑选方法。与传统的气相色谱质谱方法相比，该方法能够大大减少有机试剂的消耗，缩短检测时间。