基因克隆及生物信息学分析.docx

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1、基因克隆及生物信息学分析（基因组学与应用生物学杂志）2015年第四期1结果与分析1.1小桐子JcMSRA基因全长cDNA的克隆以小桐子叶片材料提取总RNA，并反转录cDNA为模板，扩增JcMSRA基因cDNA全长序列。结果表明，扩增得到的产物约0.9kb(图1A)。将目的条带切胶回收后与T/A克隆载体pEASY-T1连接，转化大肠杆菌，菌落PCR验证阳性克隆(图1B)。挑取阳性克隆过夜摇菌，提取重组质粒pEASY-T1-JcMSRA(图1C)，并以M13通用引物进行测序。1.2小桐子JcMSRA基因的生物信息学分析经测序分析，本研究克隆的小桐子JcMSRA基因的cDNA序列全长879bp，包含

2、一个完好的开放阅读框(780bp)，编码259个氨基酸(图2)。通过将JcMSRA编码框与其基因组序列(Jcr4S03665,1464816350位,1702bp)比对，发现JcMSRA基因包含2个外显子(长度分别为528bp与252bp)与1个内含子，且内含子的序列(924bp)较2个外显子都长，符合AT/GT的剪切规则。ProtParam分析结果显示，JcMSRA编码的蛋白质分子量为29.1kD，理论等电点为8.75，且单体亚基不稳定，讲明其属于多聚体蛋白质。另外，该蛋白质N端不含信号肽，预测其亚细胞定位可能性最大的为线粒体、其次为细胞核。ExPASy的COILS预测发现，该蛋白质在190

3、220位有一个明显的卷曲螺旋区域(图3A)。作为一种超二级构造，卷曲螺旋一般由27个短的琢-螺旋组成，是很多转录因子与功能蛋白质的构造元件，该卷曲螺旋出现的位置正好是其二级构造中琢-螺旋最长的部位，与SOPM服务器预测的构造吻合(图3B)。分别以大肠杆菌(Escherichiacoli)、酿酒酵母(Sa-ccharomycescerevisiae)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、蒺藜苜蓿(Medicatruncatula)、毛果杨(Populustrichocarpa)、家鼠(Musmusculus)、人(Hom

4、osapiens)与小桐子MSRA氨基酸序列进行多重序列比对(图4)，发现MSRA氨基酸序列在N端与C端都没有同源性，差异变化较大，而在中部相对保守。MSRA属于单构造域蛋白，位于该酶蛋白活性中心的核心氨基酸残基为Phe102、Trp103、Tyr132、Glu144、Tyr184(图4,菱形标注)，而-GCF-W-保守序列的Cys与C端的两个保守Cys残基主要起维持酶活性中心构造的功能。将小桐子MSRA氨基酸序列进一步与MSR家族的三类不同(MSRA,MSRB,fRMSR)的MSR氨基酸序列进行多重序列比对，并构建系统进化树(图5)。由图中能够看出，不同的MSR被聚类为明显的三条分支，印证了

5、MSR三个家族在氨基酸一级序列及高级构造等方面的进化差异性。我们得到的小桐子MSR被归入了MSRA分支中，与小桐子的近科物种毛果杨(Populustrichocarpa)在进化上距离较远，序列类似性仅为22.19%，而与芸豆(Phaseolusvulgaris)、棉花(ssypiumbarbadense)、油菜(Brassicanapus)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)的亲缘关系较近，序列类似性分别为70.30%、68.82%、61.65%、60%。目前，通过X-晶体射线衍射法已经获得了几种(如大肠杆菌,毛果杨,牛)MSRA的高分辨率三维构造。我们通过同源建模方法构建了小桐

6、子MSRA的三维空间构造并进行了氨基酸残基能量评估(图6)。综合研究MSRA的晶体构造显示，其外表都有一个口袋状构造，且该构造周围的氨基酸残基相对保守，后被证明是底物甲硫氨酸亚砜的结合位点。小桐子MSRA蛋白的底物结合位点氨基酸构成为Tyr132、Glu144、Tyr184，另外，-GCFW-保守序列中的最后两位氨基酸Phe102、Trp103也介入了催化中心的构成(图6A)，而-GCFW-保守序列构造域中的Cys101以及C端的保守Cys251、Cys257在维持结合位点空间构造方面也是不可或缺的。Ramachandram能量图分析显示有96.9%的氨基酸残基处于能量稳定区域，讲明预测的三维

7、构造可信(图6B)。小桐子MSRA空间构造核心区域是3段琢-螺旋包裹的6条茁-折叠片层构造，呈现琢/茁卷状，二级构造组成顺序以茁1-琢1-茁2-茁3-琢2-茁4-琢3-茁5-茁6排列，并且茁1与茁6较短，而核心4条茁-折叠较长，在拓扑构造上排列为反平行方式。另外，在茁2与茁3之间有1段极短的琢-螺旋，在琢2与茁4之间存在2条反平行的极短茁-折叠与1段极短琢-螺旋，而在靠近N末端还存在1段极短琢-螺旋，C端存在2段极短琢-螺旋。蛋白质核心区域被两端柔性区包裹，包括N端的92个氨基酸残基(Met1-Glu92)与C端的33个氨基酸残基(Ala227-Gly259)。2讨论甲硫氨酸亚砜复原酶作为生物

8、体内的抗氧化修复因子属于多基因家族，目前已经报道的甲硫氨酸亚砜复原酶有三个亚家族，不同家族固然催化类似的反响，但没有一级氨基酸序列及三维构造类似性(Rouhieretal.,2006)。最早被报道的两个亚家族是MSRA与MSRB，MSRA与MSRB能够分别特异性地复原Met-S-SO与Met-R-SO，且两者既能够催化游离的甲硫氨酸亚砜，可以以催化蛋白外表的甲硫氨酸亚砜。第三个MSR家族最早在大肠杆菌中发现，命名为fRMSR(freemethionine-R-sulfoxidereductase)，而该酶只能催化游离的甲硫氨酸亚砜。MSRA最早从大肠杆菌中分离出来的，是一类相对较小的胞质酶，编

9、码该酶蛋白的基因广泛存在于生物界，如梭状芽孢菌(Clostridiumsp.Ohilas)、金属复原菌(Shewanellaoneidensis)、嗜热古生菌(T.kod-akaraensis)、酵母菌、拟南芥、杨树、果蝇、小鼠、大鼠及人。该亚家族不同种属间同源性不高，但其催化部位的氨基酸序列是非常保守的。在N端存在一个保守序列-GCFWG-(尤其是中心的Cys)，这一序列的突变将导致MSRA完全失活；另外，在C端存在两个保守的复原型Cys残基，以上三个保守的Cys在空间构造上共同介入MSRA催化中心的构成(Rouhieretal.,2007)。MSRB最初也是从大肠杆菌中发现的，且在黄单孢菌

10、(Xanthomonascampestris)、梭状芽孢菌(Clostriidiumsp.Ohila)、拟南芥、烟草、果蝇及人等生物体中都存在，属多基因亚家族，在不同生物体(如人,小鼠等)中一般都有3个MSRB，主要定位于内质网与线粒体，其N端定位信号肽在不同的MSRB中较为保守。MSRB在其N端同样存在-GCGWP-保守序列，除此之外，大部分MSRB在其C端仅存在一个保守的Cys残基(Dingetal.,2007)。与MSRA不同，MSRB中还包含两个-CXXC-保守序列，用于结合Zn2+或Fe2+，共同构成MSRB的活性中心(Olryetal.,2005)。目前关于MSRA与MSRB的表达

11、、调控及作用机理的研究主要集中在微生物及动物中，如大肠杆菌、酵母菌、小鼠及人等，而对于植物MSR的研究报道近几年才逐步增加，本研究中克隆的小桐子MSRA基因也是初次报道。研究发现，拟南芥中至少存在5个编码不同形式的MSRA基因AtMSRA1-At-MSRA5，同时存在至少9个MSRB基因AtMSRB1-AtMSRB9；另外，在毛白杨中发现9个MSR基因，包括5个MSRA与4个MSRB；在水稻中发现4个MSRA与3个MSRB基因。利用在线软件预测发现，不同的MSR在植物细胞中有不同的定位，目前发现的包括细胞质、叶绿体、线粒体、内质网及分泌型MSR等(Rouhieretal.,2007)。芯片数据

12、与转录组数据都表明不同亚细胞定位的MSR有着不同的组织表达形式，胞质型MSR通常在所有组织器官中都有表达，叶绿体型MSR主要在绿色组织尤其是叶中表达。Romero等(2004)通过RT-PCR分析了拟南芥不同MSR类型的组织表达特异性，结果表明，AtMRA4在除根以外的所有组织中的表达量都很丰富，其总表达量在所有MSRA中也是最高的；AtMSRA2和AtMSRA3表达量仅次于AtMSRA4，且主要在根和茎中表达；而AtMSRA1和AtMSRA5在所有组织中的表达量都很少；AtMSRB2、AtMSRB6的表达量在叶和其它绿色部位中最高，而AtMSRB5、AtMSRB7、AtMS-RB8、AtMS

13、RB9则主要在根中高表达。大量数据表明，各种生物与非生物胁迫能够诱导高等植物不同MSR基因的表达，强光与盐胁迫能够强烈诱导拟南芥质体型AtMSRA4的表达(Gustavssonetal.,2002)。定位在内质网中的AtMSRB3可去除在植物受冷胁迫时内质网中积累的MetSO和ROS，过表达AtMSR-B3能够提高拟南芥植株的耐寒性(Kwonetal.,2007)。而水稻OsMSRB1.1在遭到包括盐、甘露醇、低温、甲基紫精和ABA在内的非生物胁迫时表达量上升，而高温处理则会使OsMSRB1.1表达量下降(Guoetal.,2009)。以上事实讲明MSR基因表达种类的多样性与组织特异性、表达调

14、控的复杂性以及与植物应答逆境胁迫的关联性，同时也暗示其在植物抗逆性研究中的应用前景。3材料与方法3.1实验材料及处理供试小桐子种子采自云南省楚雄州元谋县。选取饱满的小桐子种子，用1.5%CuSO4消毒20min，无菌水漂洗5次，于26的恒温培养箱中吸涨24h(李忠光和龚明,2010)。将吸涨的种子在无菌水中漂洗3次，播于垫有5层用无菌水湿润滤纸的白磁盘(24cm伊16cm)中，于相对湿度75%、昼夜温度26/20、光周期16/8h的恒温培养箱中萌发5d。之后将发芽的种子播于消毒的培养土中并于同样恒温培养箱中培养15d至第二片真叶展开。取第二片真叶材料，液氮速冻后置于-80冰箱中用于RNA的提取

15、。3.2菌株与主要试剂大肠杆菌Trans1-T1(DH5琢)菌株由本实验室保存；TransZolUp、DNase玉、TransStartTaqDNAPoly-merase、Amp、X-gal、IPTG、2伊EasyTaqPCRSuperMix(+dye)、TransScriptTwo-StepRT-PCRSuperMix、EasyPureQuickGelExtractionKit、EasyPurePlasmidMin-iPrepKit、pEASY-T1CloningKit、Trans2KPlus域DNAMarker购自全式金生物技术有限公司；引物合成和测序由深圳华大基因有限公司完成。3.3实验

16、方法3.3.1总RNA的提取及cDNA第一链的合成取0.2g小桐子叶片材料，根据王海波等(2014)的方法利用TransZolUp试剂提取并纯化总RNA。以AnchedOli(dT)18为逆转录引物，利用TransScriptTwo-StepRT-PCRSuperMix合成第一链cDNA。3.3.2小桐子JcMSRA基因全长cDNA的克隆以拟南芥MSRA全长mRNA序列(XM_002510-827.1)为种子序列，对我们高通量测序得到的小桐子低温锻炼转录组(GenBank登录号:GAHK00000000.1)的45251条Unigenes进行本地Blast，得到小桐子MSRA基因的序列Unig

17、ene850_JC-CK_1A(GAHK0-1013398,1714bp)。序列分析表明其包含全长F(780bp)。以此序列为基础设计全长cDNA克隆引物，并送深圳华大基因合成。引物序列为：上游F(5-ACACAACTTAACTCAACACGTCA-3)；下游R(5-AACCCAGCAAACTGTATAAAAAC-3)。以3.3.1中反转录cDNA模板，使用TransStartTaqDNAPolymerase进行PCR扩增，扩增条件为：945min寅9430s,54.930s,721min35寅7220min。扩增完成后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，利用EasyPureQuickGel

18、ExtractionKit从琼脂糖凝胶中回收目的基因片段(879bp)，并与克隆载体pEASY-T1连接，转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，涂LB抗性平板(LB-Amp垣IPTG垣X-gal)，过夜生长，挑取白斑菌落进行菌落PCR鉴定。阳性克隆取名为pEASY-T1-JcMSRA，并送深圳华大公司利用pEASY-T1质粒上的M13F与M13R通用引物进行双向测序。3.3.3小桐子JcMSRA基因的生物信息学分析利用Spidey软件进行克隆cDNA序列与基因组序列比对以确定JcMSRA基因内含子与外显子的构造。利用BioEdit软件将JcMSRAcDNA序列翻译成氨基酸序列，利用在线工具

19、ProtParam计算蛋白质的理论分子量、等电点等基本参数。利用WolfSpt在线软件对蛋白质进行亚细胞定位预测，并利用SignalP3.0Server分析蛋白质信号肽序列，接着利用在线工具TMHMM与Proscale检测其跨膜构造与亲水/疏水特性。分别利用SOPM与ExPASy的COILS软件分析其二级构造与卷曲螺旋构造。利用NCBICDD工具进行构造域与功能元件的鉴定。从Gen-Bank下载其它物种MSR氨基酸序列，利用ClustalX进行序列类似性比对，然后用MEGA4.0软件通过邻接法构建系统进化树，并采用泊松法进行检验。利用Phyre2进行蛋白质三维构造的同源建模，利用VMD软件显示其三维空间构造，并结合Ramachandram图验证模型的准确性。