病原性真菌的ITS测序.docx

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1、病原性真菌的ITS测序（国际检验医学杂志）2014年第十二期资料与方法一般资料实验菌株：大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、阴沟肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌，共种细菌；白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌，共种真菌。所有实验菌株均按要求分离纯化，并经西安交通大学医学院第一附属医院检验科微生物实验室全自动细菌鉴定药敏分析仪鉴定。标本从西安交通大学医学院第一附属医院中心、肝胆外科、胸外科、肾内科、肿瘤外科等多个科室收集例临床疑似真菌感染患者的穿刺引流液标本，另采集健康人全

2、血标本，提取人类基因组。方法标本的采集在严格无菌操作下，用一次性无菌注射器穿刺患部，抽取引流液，将注入抗凝管，剩余注入血培养瓶中进行培养。静脉穿刺采集健康人外周血，注入抗凝管。抗凝标本放入冰箱中暂存。标本预处理将抗凝管中的引流液标本颠倒混匀，取放入灭菌管中，参加充分颠倒混匀，离心，弃上清液，沉淀物于冷冻保存，以备提取之用。标本中真菌基因组的提取用缓冲液重悬经预处理的标本，参加溶壁酶，用加样器吸打混匀，水浴后应用，提取，操作步骤根据试剂盒讲明书。检测真菌通用引物的特异性实验所用真菌通用引物参照等设计：；：；：。反响体系包括：，上游引物，下游引物，酶，模板，灭菌超纯水。反响条件：预变性；变性，退火

3、，延伸，共个循环；最后延伸。产物用琼脂糖凝胶电泳检测，电泳电压为，电泳时间为，采用溴化乙锭染色，在凝胶成像分析系统拍照保存。制备梯度菌悬液为了检测真菌通用引物的敏感度，本研究用麦氏单位约的白色念珠菌菌液参加纯水，得到约的菌液，然后进行倍比稀释，取、个稀释度的菌液涂布沙保罗平板，每个稀释度个平板，每个平板涂，培养后计数菌落，选用个平板的平均菌落数作为参考菌数。提取真菌、反响体系及条件同上。真菌通用引物产物的测序应用纯化产物。测序反响体系包括：灭菌去离子水，测序引物，纯化的产物。反响条件：预变性；变性，退火，延伸，共个循环。测序产物按试剂盒纯化，然后在仪上变性，条件为：，。用基因分析仪进行测序。测

4、序结果的比对登陆：，将测序结果与核酸数据库进行比对。统计学处理应用进行数据分析，采用配对四格表资料的检验对培养法和测序法的阳性率进行比拟，为差异有统计学意义。结果真菌通用引物特异性种真菌的经引物和扩增后均产生单一条带，经与标记物比对，产物大小和预期相符，而种细菌及人类基因组经后无任何条带，见图。真菌通用引物敏感性引物最低检测限为，最低检测限为，见图。真菌通用引物检测临床标本见图。测序结果株阳性临床标本经测序均得到较好的序列，与核酸数据库进行比对后均可将病原性真菌鉴定到种的水平。测序法与培养法检测阳性率比拟例穿刺引流液中，培养法检出例阳性标本例白色念珠菌和例光滑念珠菌，这例标本经测序法检测也均为

5、阳性；例培养法检测的阴性标本中有例标本为测序法检测阳性例白色念珠菌、例光滑念珠菌、例热带念珠菌。测序法阳性率是，培养法阳性率是，测序法阳性率是培养法的倍，二者差异有统计学意义，。见表。讨论真菌感染的发病率逐年增加，尤其对于急性播散性念珠菌感染，早期快速地检测和鉴定对选择抗真菌药物非常重要，而传统培养方法的敏感性低且耗时长，这给检测手段提出了新的要求，因而寻找一种快速的检测和鉴定真菌感染的方法势在必行。测序法以其高敏感性和特异性，而成为一种极具前景的真菌感染检测方法。在病原学诊断中，区被越来越广泛地应用于菌种鉴定。但是，目前并没有一个真正意义上的真菌通用引物。因而，本研究首先验证了所用引物的特异

6、性，结果表明这对引物能够用于扩增临床上常见的病原真菌，且不会将细菌及人类的扩增出来。为了排除假阳性、最大限度地筛检病原菌，并保证片段长度能够在种的水平对常见真菌进行鉴定，本研究用了对通用引物，其中的扩增产物包括：的端、区、的端；的扩增产物包括：的端、区、区、的端。研究结果表明，引物最低检测限为，引物最低检测限为，且对同一标本，二者测序比对结果一致。测序法具有较高的检测敏感性和特异性，能够在少量的临床标本中检测到真菌，并能够将检测时限缩短至，而临床上传统的真菌培养表型鉴定方法一般需的时间才能得到结果，且有的真菌难以培养鉴定。另外，表型鉴定方法数据库中的信息也是有限的，而绝大多数真菌的基因已被测序完成，数据库特别完善，为真菌测序鉴定提供了充分的保障。真菌感染主要以念珠菌为主，尤以白色念珠菌所占比例最大。本研究结果表明穿刺引流液感染真菌均为念珠菌，主要以白色念珠菌为主，占。综上所述，本研究通过应用对真菌通用引物进行测序来鉴定菌种，探索出了一套切实可行的方法，较传统的培养方法快速，且特异性和敏感性更高。后期工作可进一步收集其他标本类型并仅采用敏感度更高的作为通用引物进行检测，进一步验证该方法，使之成为一套成熟的、临床实用性强的真菌检测手段。