猪非典型瘟病毒感染诊断研究-精品文档.docx

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1、猪非典型瘟病毒感染诊断研究摘要：年月四川省某规模化猪场出现临产母猪产弱子、发抖、死胎，且死胎率达，哺乳仔猪成活率明显降低，其中以全身性或局部性阵发痉挛为典型症状。用扩增及序列分析确诊该猪场感染了一种新型的猪非典型瘟病毒。这是四川省初次检测到并报道，可为该病的研究和防控提供了一定的参考。关键词：阵发痉挛；猪非典型瘟病毒；诊断猪非典型瘟病毒，是近年来新发现的一种新型瘟病毒，与猪瘟病毒，、牛病毒性腹泻病毒，、边界病毒，等同属瘟病毒属黄病毒科。猪群感染该病毒后可引起新生仔猪的先天性震颤症型；，俗称“仔猪抖动病，其特征是在出生后数小时内可观察到骨骼肌的双侧痉挛收缩，并造成无法吮乳的现象，严重时可损伤仔猪

2、的脑和脊髓，给养猪业造成宏大的经济损失。该病呈广泛的地理分布，病毒检出率也在日趋上升，自年在美国报道该病毒以来，又逐步在德国、荷兰、西班牙、奥地利和中国等地相继被报道，。近年来，已经引起越来越多的学者的关注，。年，该病在国内外的报道中被指出能够造成规模化猪场哺乳仔猪的发病率以及的病死率。经遗传进化分析表明复杂多样，不同地区的分离株具有高度可变性。本试验中对该猪场的患病猪及死亡猪进行临床诊断和实验室确诊，最终确诊为感染。这也是初次证实了四川规模化猪场存在感染。材料与方法材料病料来源采集四川省某规模化发病猪场的新鲜死胎、弱仔。主要试剂与仪器试剂盒，上海英骏生物科技有限公司产品；、酚、试剂，公司产品

3、；三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇等试剂，成都科龙化工公司产品；酶，默克集团产品；，东洋纺生物科技有限公司产品；、试剂盒，大连宝生物公司产品；产物纯化试剂盒，北京鸿跃创新有限公司产品；感受态细胞，北京天根生化科技有限公司产品；培养基，青岛海博试剂有限公司产品；高速离心机，公司产品；普通仪、核酸蛋白电泳仪、凝胶成像系统，公司产品。引物参照文献，中瘟病毒，通用引物序列，猪瘟病毒、猪繁衍与呼吸综合征，、猪圆环病毒型，和猪伪狂犬病病毒，的特异性检测引物，由生工生物工程上海股份有限公司合成表。方法核酸的提取取心、脾、肺、肾、脑、淋逢迎等组织器官并将其剪碎，同时取适量全血，所有样本都一式两份，分别根据和的提取方

4、法进行操作。提取的和置于保存备用。利用试剂盒将反转录成并置于待用。检测对提取的和反转录后的模板，进行扩增反响。取扩增产物经的琼脂糖凝胶核酸电泳和凝胶成像扫描仪进行检测。产物的纯化、克隆以及转化对检测呈阳性的产物根据纯化试剂盒讲明书进行操作纯化目的条带，并根据载体讲明书进行加样，酶连体系如下：回收产物，连接。将上述的连接产物根据感受态细胞操作讲明书进行转化，将菌液涂布在加了氨苄青霉素的平板上，过夜培养。菌落鉴定以及测序在培养箱过夜培养的平板上随机挑取单菌落置于的无菌水中，并取作为模板做菌落鉴定，将鉴定为阳性的菌液参加含氨苄青霉素的液体培养基中，摇菌后送至生工生物工程上海股份有限公司测序。类似性及

5、进化树分析将测序结果在上进行比对后，使用软件进行类似性比对以及的邻近法构建系统进化树，并通过自举分析作置信度检测，自举数据集为次。发病情况、临床症状和病理剖检年月以来，四川某规模化猪场，母猪陆续出现产死胎、木乃伊胎，死胎、木乃伊率达。随后发现部分母猪整窝出现初生仔猪全身不自主地抖动，头部摇摆，后肢无力，不能站立，行动缓慢，无法进行吸吮乳汁，但未见瘫痪症状，部分猪只逐步出现死亡，个别猪只在周周后可康复但同时也表现为预后不良。母猪发病率约为，不同窝内发病率为，发病母猪各种胎龄均有发生。对消瘦的病死仔猪进行解剖，发现其脑血管周围、脑部、肺脏有出血，脾脏局部坏死灶和边缘梗死的情况图；其他组织器官无明显

6、病理变化。检测提取所采集的心、脾、肺、肾、脑、淋逢迎等组织和全血的和，用方法对、和等病原进行检测，结果均为阴性；再使用瘟病毒属通用引物对以上进行扩增，并对产物进行电泳检测，扩增片段约为，与预期的相一致图。序列分析将克隆转化后测序得到的序列在上进行序列比对，结果显示是毒株。用分子生物学软件将测序得到的基因序列和上已经发表的参考序列进行序列同源性比对。结果显示该病毒的核苷酸序列与其他参考株的核苷酸及氨基酸同源性分别为和，与其同源性最高的是德国株。系统进化树分析为了进一步确定该病毒与国内外已发表的参考毒株之间的遗传进化关系，运用生物学软件的邻近法构建其系统进化树状图，结果如图所示。从核苷酸系统进化树

7、中能够看出，瘟病毒目前可分为两大分支，为一大分支，其他瘟病毒为另外一大支，该病毒与、同属瘟病毒属，但与亲缘关系较近且单独聚为一支。本研究鉴定的与德国毒株、澳大利亚毒株以及中国毒株、的序列亲缘关系较近，但单独聚为一支，讲明本研究鉴定的可能是一株新的毒株。在过去的十几年中，越来越多的新型瘟病毒已在国内外被发现，在美国，德国，荷兰和奥地利等很多国家已被鉴定。年，在澳大利亚的数个猪场的新生仔猪群中爆发了重复性肌阵挛“颤抖仔猪，大量仔猪可见营养失调，尤其是这种震颤综合征的并发症。由于此病爆发，仔猪总体死亡率增加，且每头母猪的断奶仔猪数降低了超过。年，通过宏基因组测序初次在美国的猪群中发现并确定一种与型相

8、关的新型瘟病毒，。该病毒能够在患病仔猪的不同组织、体液和中枢神经系统中检测到，并且在呈阳性的母猪和先天性震颤感染的仔猪的血清中检测到特定抗体，同时对感染仔猪的中枢神经系统进行组织学检查发现小脑和脊髓的白质出现中度的髓鞘构成减少。在本试验中，通过方法在哺乳仔猪中检测到，这是四川省初次检测到并报道该病毒。本研究中患病猪的临床症状为典型症状全身性或局部性阵发痉挛。首先利用方法排除了、和等病毒的感染。运用瘟病毒通用引物对样本进行扩增，电泳结果显示扩增片段与预期目的条带相近，经过序列分析比对，讲明该毒株是一株。通过克隆测序，本研究鉴定的病毒与其他参考株的核苷酸及氨基酸同源性分别为和；从目前的研究来看，与

9、中国广州毒株和同源性相对较低，分别为和。系统进化树构建和同源性分析表明，中国发现的毒株存在地域差异性。遗传进化结果表明本研究鉴定的可能是一种新的毒株。本研究初次在四川地区规模化猪场确定的感染，且有与国内毒株具有明显的遗传差异，我们将进一步对该病毒的分子特征和致病机制进行探究。由于该病目前也没有预防用生物制品，建议该猪场应加强猪场管理，严格执行检疫制度，坚持自繁自养，减少健康猪同病猪之间直接或间接的接触。严禁从有疫病的国家和地区引进种猪、猪精液与胚胎和血液制品，从非疫区引进的种猪要严格检疫。引进种猪到猪场后应严格隔离观察周以上。同时加强猪舍消毒，实行全进全出制度。使用优质疫苗对猪群进行免疫，提高防疫效果。