慢病毒下的胃癌细胞论文-精品文档.docx

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1、慢病毒下的胃癌细胞论文1材料与方法1.1方法1.1.1STAT3-shRNA慢病毒表达载体的构建选择GenBank提供的STAT3基因序列NM_139276.2为靶基因，委托上海纽恩公司设计多个RNA干扰靶点序列，结合设计软件评估测定结果及公司设计经历，最终确定并合成shRNA序列：5-AACTTCAGACCCGTCAACAAA-3，进一步合成双链DNAoligo，退火后与Age和EcoR双酶切载体pLKD.CMV.GPR.U6.shRNA连接，转化细菌感受态细胞，对长出的克隆进行PCR鉴定，测序比对正确后，抽提重组质粒，与包装质粒psPAX2、外膜质粒pMD2.G共转染293T细胞完成病毒组

2、装。离心去除细胞碎片并用0.45mPESfilterflask过滤收集上清液，100000g，4超速离心2h后得到浓缩的STAT3-shRNA病毒液。同法构建阴性对照病毒。进一步梯度感染293T细胞，荧光显微镜下计算绿色荧光蛋白greenfluorescentprotein，GFP数目，计算病毒滴度。测得干扰病毒滴度为：3.80108Tu/ml，阴性对照病毒滴度为：6.51108Tu/ml。1.1.2细胞培养用含10小牛血清、1的青/链霉素双抗的RPMI1640培养基于37，5CO2的培养箱中培养SGC-7901细胞，每3天按13的比例传代。1.1.3慢病毒转染SGC-7901细胞实验共分为3

3、组：实验组STAT3-shRNA转染组、阴性对照组空病毒载体转染组、空白对照组正常SGC-7901细胞。SGC-7901细胞按1106个/孔均匀接种至6孔板，长至汇合度为3040时，参加慢病毒感染复数MOI=20，12h后更换为新鲜的无病毒培养基。1.1.4激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白greenfluorescentprotein，GFP各组细胞按2103个/孔均匀接种至装有灭菌爬片的24孔板中，48h后弃培养基，PBS溶液洗3次，4%多聚甲醛固定10min，轻轻取出爬片并倒扣于载玻片上，甘油封片后用激光共聚焦显微镜观察。1.1.5Real-timePCR检测STAT3基因表达收集各组细胞

4、1106个，trizol法抽提总RNA，紫外分光光度计测RNA纯度及浓度后逆转录为cDNA，反响条件为：4260min，955min，55min。取2lcDNA模板进行PCR。STAT3上游引物序列为：5-GAGGACTGAGCATCGAGCA-3，下游引物序列：5-CATGTGATCTGACACCTGAA-3，扩增产物长85bp；内参引物-actin上游序列为：5-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3，下游引物序列：5-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3，扩增产物长140bp。PCR反响条件：9530s，955s及6030s共循环40次。每个样本设3个复孔，采用2-C

5、t公式比拟mRNA相对表达水平，Ct=目的基因Ct值-内参基因Ct值。1.1.6Westernblot检测STAT3、Bcl-2、survivin及Mcl-1蛋白表达收集各组细胞，裂解缓冲液裂解液蛋白酶抑制剂混合物=5002冰上裂解1520min，4、12000r/min离心15min以分离细胞碎片。BCA蛋白定量法测蛋白浓度，参加上样缓冲液煮沸至完全变性。50g总蛋白提取物在10SDS-PAGE凝胶上分离，然后转至PVDF膜90V，1.5h。室温下用含5脱脂奶粉的TBST溶液孵育1h以阻断非特异性结合，一抗STAT3稀释比例为12000，Bcl-2、survivin及Mcl-1稀释比例为1：

6、2004孵育过夜，TBST洗膜3次5min；二抗1250037孵育2h，TBST洗膜3次5min，最后用ECL化学发光法显影。应用QuantityOne软件分析图像，蛋白相对表达强度用目的基因条带灰度值/-actin条带灰度值表示。1.1.7MTT法分析5-Fu的化疗敏感性将细胞均匀接种至96孔板5103个/孔，贴壁后参加5-Fu至终浓度分别为0、5、10、15、20、50、100g/ml，每个浓度设3个复孔。48h后每孔加20l5mg/ml的MTT溶液，37孵育4h，弃培养基，每孔加150mlDMSO溶液。摇床上震荡15min，用酶标仪测定570nm处吸光度值absorbance，A。以不加

7、5-Fu组作对照，计算各组细胞的增殖抑制率，公式为：增殖抑制率100=对照组A570nm实验组A570nm/对照组A570nm100%。1.1.8流式细胞仪比拟细胞凋亡差异细胞接种至6孔板，贴壁后参加5-Fu至终浓度为20g/ml。48h后，收集4105个细胞，PBS洗涤2遍后用195lAnnexinV-PE结合缓冲液重悬细胞，参加5lAnnexinV-PE带红色荧光，混匀后室温下避光孵育10min，离心弃上清，参加200l结合缓冲液，尽快送流式细胞仪检测。1.2统计学处理实验均重复3次，使用统计分析软件SPSS17.0处理数据，用均数标准差xs表示数据，以单因素方差分析法比拟多组间差异，组间

8、两两比拟采用LSD-t检验。检验水准=0.05。2结果2.1GFP在SGC-7901细胞中的表达慢病毒感染SGC-7901细胞后，在激光共聚焦显微镜下观察到细胞生长状态良好，可见实验组及阴性对照组均有明显GFP表达图1。2.2STAT3-shRNA转染后STAT3mRNA及蛋白表达情况Real-timePCR结果表1所示，阻断STAT3信号后，STAT3mRNA相对表达水平下降为0.460.04，明显低于空白对照组1.000.01、阴性对照组0.930.05P0.05。免疫印迹结果图2、表1显示，STAT3蛋白相对表达强度在空白对照组、阴性对照组及实验组中依次为0.780.07、0.750.0

9、5、0.470.04，表明STAT3-shRNA可明显下调STAT3蛋白活性P0.05，而阴性对照组和空白对照组之间无明显差异P=0.528。2.3抑制STAT3表达后SGC-7901细胞对5-Fu的敏感性MTT结果表2示，与阴性对照组及空白对照组相比，实验组细胞增殖抑制率明显升高P0.05，表明STAT3-shRNA能抑制细胞增殖，加强细胞对5-Fu的化疗敏感性。2.4慢病毒介导shRNA抑制STAT3后细胞凋亡率的变化抑制STAT3后细胞凋亡率39.162.25，较阴性对照组23.432.86、空白对照组23.751.23明显升高，差异有统计学意义P0.05，表明抑制STAT3表达能加强5

10、-Fu的凋亡诱导作用表3。2.5STAT3信号通路阻断后抗凋亡蛋白表达情况Westernblot结果表明图3、表4，Bcl-2、Mcl-1及survivin的蛋白表达水平在实验组中分别为0.470.03、0.350.02、0.450.02，空白对照组中为0.810.06、0.520.05、0.710.03，阴性对照组为0.780.07、0.490.01、0.670.05。与阴性对照组相比，实验组上述蛋白水平分别下调约40、29、33P0.05，而两对照组之间无统计学差异P0.05。3讨论5-Fu是胃癌化疗的一线药物，其通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶影响DNA的生物合成，属于抗代谢类化疗药物，然而

11、其疗效往往因癌细胞获得多药耐药性multidrugresistance，MDR而遭到极大影响4。MDR的构成机制特别复杂，耐药蛋白过表达、细胞凋亡异常、转录因子活化、药物代谢异常等皆可诱导MDR。研究证实，化疗药物发挥细胞毒性作用的主要机制是诱导凋亡，可由于肿瘤细胞内在的抗凋亡程序激活，使得其对化疗药物耐受，最终导致化疗失败5。STAT3作为络氨酸信号通路中的重要转录因子，通过调控多个下游靶分子介导细胞的增殖、分化及凋亡。在正常细胞中，STAT3的活化快速而短暂，而在肿瘤细胞中STAT3却能异常的持续活化，促进细胞不断增殖，抑制凋亡，诱导肿瘤血管生成及免疫逃逸，最终促进肿瘤发生与发展。Bcl-

12、2、Mcl-1、survivin均是STAT3通路下游的靶基因，其中Bcl-2及Mcl-1是Bcl-2家族蛋白的主要成员，依靠线粒体途径抑制促凋亡因子的释放，抑制细胞凋亡6；survivin则是凋亡抑制蛋白IAPs家族成员，主要依靠Caspase途径抑制细胞色素C释放进而抑制凋亡7。近来的研究以为，STAT3的异常活化与肿瘤细胞耐药有关，抑制STAT3可逆转细胞的化疗抵抗性。Liu等和Gu等9分别在黑色素瘤及头颈部鳞癌中发现，耐药细胞中STAT3表达水平较不耐药细胞明显上调，沉默STAT3可抑制肿瘤生长，逆转耐药细胞的化疗抵抗性。Duan等10发现，转染IL-6STAT3的活性配体可诱导卵巢癌

13、细胞对紫杉醇耐药，利用siRNA沉默STAT3可加强紫杉醇的抗肿瘤活性。目前，STAT3沉默对胃癌细胞化疗敏感性影响的研究相对甚少，鉴于此，本实验拟阻断胃癌SGC-7901细胞的STAT3信号通路，观察5-Fu化疗敏感性的变化。RNA干扰RNAinterference，RNAi技术是利用体外合成的RNA序列特异性地结合并降解同源目的mRNA，使目的基因功能完全或部分丧失的生物学经过，可通过2种途径实现：一种是直接向细胞转染小干扰RNAsiRNA，另一种则是通过质粒、病毒或细菌载体将短发夹RNAshRNA传递至靶细胞11。siRNA由于存在易被血清核糖核酸酶降解、稳定性差、转运效率差等缺乏之处，

14、因而本实验选择愈加特异、稳定的shRNA以抑制靶基因表达。本研究通过构建靶向STAT3基因的慢病毒载体，介导shRNA转染SGC-7901细胞，在激光共聚焦显微镜下可观察到明显的GFP表达，real-timePCR及免疫印迹结果表明干扰后STAT3mRNA表达抑制率约为54，蛋白水平下降达40，讲明STAT3在基因及蛋白水平均得到有效抑制。MTT及流式细胞仪检测发现STAT3-shRNA可加强5-Fu的增殖抑制及凋亡诱导作用，提示SGC-7901细胞对5-Fu的化疗敏感性升高。为了说明其化疗增敏的机制，进一步检测了STAT3下游靶分子Bcl-2、Mcl-1、survivin蛋白的表达，发现三者

15、的活性均明显下调，这与Liu12、Wen等13的实验结果一致，讲明STAT3-shRNA能通过抑制STAT3表达进而下调该通路下游的抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1、survivin的活性，诱导肿瘤细胞凋亡，使5-Fu的抗肿瘤活性加强。总之，慢病毒介导的STAT3-shRNA能靶向抑制SGC-7901细胞中STAT3基因表达，通过阻断STAT3信号通路使下游的抗凋亡信号Bcl-2、Mcl-1、survivin的表达下降，促进细胞凋亡，在一定程度上提高胃癌细胞对5-Fu的化疗敏感性。本实验结果表明，靶向STAT3的基因治疗联合化疗，能逆转胃癌细胞对5-Fu的抵抗性，有可能成为胃癌治疗的有效新途径。但本实验仅为初步的体外实验，肿瘤细胞的耐药是涉及多种机制的复杂经过，尚需进一步开展动物实验验证。