形态学技术对经方研究的影响.docx

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1、形态学技术对经方研究的影响（世界中医药杂志）2015年第一期1常用技术概要1.1冰冻切片1.1.技术特点冰冻切片是将新鲜组织快速冷冻后再进行切片。制片周期较石蜡切片短，可用于组织构造的快速观察，可以用于一些不适于石蜡切片制备的组织的观察，如脂肪组织。冰冻切片可以以进行各种染色图。石蜡切片和冰冻切片均可用光学显微镜进行观察。1.1.2应用举例团队对糖尿病并发症有专门的研究。小鼠是一种自发糖尿病模型小鼠，利用小鼠观察了中药对糖尿病并发症的治疗作用。E染色的石蜡切片显示糖尿病小鼠肝脏构造紊乱，肝细胞胞浆有明显空泡，肝细胞有脂肪变性。进而利用冰冻切片进行油红染色，明确空泡内确为脂肪。研究结果显示能改善

2、糖尿病小鼠肝脏构造，对糖尿病造成的肝脏损害具有一定的保护作用。1.2电镜超薄切片1.2.1技术特点光学显微镜可观察细胞的构造，电子显微镜则能观察亚细胞构造。常用的有透射电镜和扫描电镜技术，前者用于观察细胞内的超微构造，如线粒体、内质网等；后者用于观察样本外表的变化，如支气管的微绒毛图。超薄电镜切片需要使用电子显微镜进行观察。1.2.2应用举例我们团队研究了黄芪注射液和葛根素注射液对型糖尿病小鼠肾脏病理改变的影响，在早期光镜仅观察到肾小球体积增大，肾小管上皮细胞有明显空泡，未见其他改变。但通过电镜观察，发现肾小球基底膜有局灶性增厚，系膜基质、系膜细胞增加，间质细胞增生。讲明在早期已经出现了稍微的

3、硬化性改变，且中药能够减轻这些病理损害。利用电镜技术，我们还观察了中药对糖尿病模型小鼠脑微血管病变的影响，通过电镜观察，显示模型组小鼠神经细胞核染色质疏松，线粒体肿胀，粗面内质网缩小，核糖体减少，经过中药治疗后上述改变减轻。讲明中药改善型糖尿病动物模型小鼠脑微血管病变。1.3组织化学技术1.3.1技术特点组织化学是运用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术，对组织与细胞的化学成分、化学反响及其变化规律进行定性、定位和定量研究的科学，是介于这些学科之间的一门边缘科学。其中在实际工作中较常用的是免疫组织化学技术。1.3.2应用举例团队在复制大鼠慢性胃溃疡模型的基础上，通过免疫组化的方法检测增

4、殖细胞核抗原，对半夏泻心汤进行拆方研究。结果表明，半夏泻心汤及其拆方各组均有不同程度的调节胃黏膜细胞增殖作用。拆方各组中，部分药组之间呈协同的作用趋势，部分药组之间呈制约趋势。综合评价其总体疗效，以全方组最佳，进而印证了仲景组方的合理性和科学性。1.4细胞培养技术1.4.1技术特点从组织中获取细胞并使其在体外生长称为原代培养。可以购买细胞株直接进行体外培养。培养的细胞是进行各种医学实验的良好材料。由于细胞种类单一，可用于观察特定细胞对刺激因素的反响，可以进行较深化的机制研究。但由于是体外培养，细胞的反响与体内存在一定的差异。1.4.2应用举例我们团队体外培养了人肾小管上皮细胞，并在此基础上研究

5、中药对肾小管上皮细胞转分化的影响。发现转化生长因子可诱导体外培养的人肾小管上皮细胞发生转分化，中药能够阻断或逆转上皮细胞的转分化。我们还研究了中药对人近曲小管上皮细胞细胞增殖的影响，以及对高糖诱导后细胞内表达的影响。结果显示，葛根素可促进细胞增殖，并且可通过增加内质网伴侣蛋白的表达量，以促进蛋白质正确折叠，来恢复细胞的稳态，进而减轻糖尿病时肾脏的构造损伤。2应用体会以上这些基本的形态学技术能够与经方的研究严密结合起来，为经方的实验研究提供可靠的技术保障。在下面几方面，形态学技术都能够为经方的研究提供技术保障。2.1形态学技术能够客观断定疾病模型的成功与否由于经方是在临床实践中构成的经典方剂，治

6、疗的对象是各种疾病。因而，复制多种疾病的动物模型，并在此基础上研究经方的治疗效果是经方研究中的基础工作。动物的疾病模型复制能否具备与人类疾病类似的改变，直接决定了后续的研究能否能继续，而很多动物的疾病模型病变的判定需要依靠形态学技术，在一些疾病中，形态学改变对于疾病的诊断起关键作用。如真武汤、五苓散、猪苓汤等均可用于治疗糖尿病肾病，若在经方的研究中结合形态学技术则能更客观，研究结果也更容易被接受。糖尿病肾病的主要形态学表现为早期肾小球肥大，晚期为肾间质和肾小球纤维化。我们以往的研究发现，型糖尿病肾病小鼠具有典型的糖尿病肾病的形态改变，黄芪可减轻该小鼠的肾脏病理损害，明确其对糖尿病肾病有治疗作用

7、。2.2形态学技术可用于经方治疗疾病的机理研究在实验研究中，除了观察经方对多种疾病的治疗效果，更重要的是揭示其作用机制和作用环节，进而指导今后的中医临床。我们团队研究了信号通路在糖尿病肾病发病中的作用及其中药的作用位点。由于在一个器官中有多种组织，仅通过分子生物学手段研究某些因子的表达情况，只能讲明在器官中的平均表达水平，无法确定其在某一特定细胞或组织中的表达。如能将形态学技术与分子生物学技术结合起来，既能确定某一种因子的表达高低，又能将这种表达的改变定位，对于治疗的作用机理的研究具有重要意义。我们曾将免疫组织化学技术与临床生化指标检测、分子生物学技术结合起来，不但能讲明中药的治疗效果，还能进

8、行机制研究。除了进行在体实验，还能够在体外培养细胞，利用细胞培养技术进行较深化的机制研究。我们团队发现中药对糖尿病肾病小鼠早期肾脏的内质网应激反响有一定的影响，为了确定中药能否对肾小管上皮细胞的内质网应激有同样的作用，就利用体外培养的肾小管上皮细胞细胞，经过高糖刺激后，观察中药对该细胞内质网应激的影响。发现高糖确实能诱导细胞产生内质网应激，中药对过度的内质网应激有一定的抑制作用。2.3形态学技术可用于经方的配伍研究通过拆方研究，确定最佳的配伍比例，能够为临床医生提供可靠的实验根据。有实验通过复制临床关节炎疾病的大鼠模型，比拟了大鼠造模前后不同配伍比例的芍药甘草汤的治疗效果，发现芍药甘草配伍时的

9、止痛作用起效明显早于其他配伍比例，证明了芍药甘草汤原方配伍应用的科学性和合理性。同时应用了免疫组织化学的方法发现瞬时受体电位通道香草醛亚型，通道蛋白的表达可能是芍药甘草汤临床上发挥止痛作用的分子机制之一，同时也表明干涉该靶点可能是芍药甘草汤中芍药和甘草配伍止痛效应最大化的分子基础。为研究半夏泻心汤的配伍规律，将该方拆成辛开药半夏、干姜，组，苦降药黄芩、黄连，组，甘补组人参、炙甘草、大枣，组，并进行穿插组合成、组，及全方组。复制大鼠慢性胃溃疡模型后，分别给予上述各组药物治疗，比拟各组大鼠血清胃泌素的水平。结果表明、组药物对胃泌素无明显影响；、组药物对胃泌素有明显影响，其中组的作用与组相近。上述结

10、果提示：不同辛味药物之间的配伍，直接影响其生物效应。这一实验结果为性味配伍理论提供了实验支持根据。2.4形态学技术可用于经方及中医基本理论的研究我们团队在复制大鼠模型的基础上，观察了宣肺中药对其的影响，发现应用宣肺中药从肺论治，肺组织病理改变减轻的同时伴见肠组织病理改变呈改善趋势，从侧面印证了中医“肺合大肠脏腑相关理论，肺肠之间存在着一定的相关性及互动调节现象。该项研究即便用了形态学技术，首先证明了模型大鼠具备了的基本病理变化和宣肺中药对此病理改变有减轻作用，进而利用分子生物学技术证明宣肺中药提高了肠组织、降低了的表达，一定程度上证明了肺肠之间存在着一定的特异性互动效应机制，为讨论“肺合大肠中医脏腑相关理论奠定基础。以上仅列举了一些在经方研究中用到的形态学技术，在今后的工作中，能够在更多领域使用形态学技术，形态学技术本身也随着科技的发展不断丰富。古老经方的研究与不断发展的形态学技术相结合，能够从不同角度和侧面阐释经方的组方理念，总结其治疗原则，让更多的学者把握经方的科学内涵，以更方便临床医生在实践使用经方。