普纳替尼对人血管内皮细胞的影响.docx

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1、普纳替尼对人血管内皮细胞的影响1方法1.1Ponatinib细胞毒活性测定采用CCK-8法4检测Ponatinib对正常HUVECs的细胞毒作用。用含10%FBS的DMEM高糖培养基于37、5%CO2培养箱中培养HUVECs细胞，收集58代处于对数生长期的细胞消化、重悬、计数，以5104/mL密度每孔100L接种细胞至96孔板。待细胞贴壁后，去除培养液，对照孔参加不含药物的新鲜培养液100L，给药组每孔参加不同浓度的含药培养液100L，设3个复孔，于37、5%CO2培养箱中继续培养48h，每孔参加CCK-8试剂10L，于CO2培养箱中孵育1h后，用酶标仪于450nm波长下测定吸光度A值。使用G

2、raphPadprism5.0软件拟合非线性曲线，并计算Ponatinib对HUVECs细胞的半数抑制浓度IC50。抑制率A阴性A样品/A阴性1.2Ponatinib对细胞迁移能力影响采用体外划痕试验5观察Ponatinib对HUVECs细胞迁移能力的影响。将5104/mL的HUVECs细胞接种至24孔板，每孔500L，24h后，用灭菌的10L枪头在单层细胞上呈“一字划痕，吸掉培养液，用PBS清洗3遍，去除划掉的细胞，每孔参加药物浓度依次为0.01、0.05、0.10mol/L的含药培养液500L，每个浓度设置3个复孔，以不含药物的孔作为阴性对照，于37、5%CO2培养箱中继续培养，直至阴性对

3、照组划痕两侧的细胞布满划痕后拍照观察，并对各组迁移至划痕中央的细胞进行计数，计算迁移率。迁移率药物组划痕区域细胞数/对照组划痕区域细胞数1.3Ponatinib对细胞成管能力影响采用体外血管构成试验6考察Ponatinib对HUVECs细胞成管能力的影响。将100L枪头、96孔板、Matrigel基质胶置于4冰箱过夜预冷。于96孔板参加Matrigel基质胶50L/孔，37、5%CO2培养箱中温孵0.51h。取融合80%90%HUVECs细胞以3.0104/孔的密度接种到96孔板，分别参加10L的含药培养液使Ponatinib终浓度依次为0.01、0.05、0.10mol/L，每组设3个复孔。

4、温孵10h后于倒置显微镜低倍镜下观察拍照，记录各组细胞成管情况，根据管型情况进行评分：细胞构成闭合的多边形评4分，细胞排列呈多边形但未闭合评3分，细胞排列呈线性构造评2分，细胞未成管散在或聚集成簇评1分7。1.4Ponatinib对细胞NO释放的影响将HUVECs细胞以1106/孔的密度接种至6孔板，24h后，每孔参加浓度依次为0.01、0.05、0.10mol/L的含药培养液2mL，每个浓度设置3个复孔，以不含药物的孔作为阴性对照，于37、5%CO2培养箱中继续培养2448h，取细胞上清液100L，根据NO硝酸复原法试剂盒讲明书的方法进行检测。1.5统计学分析采用GraphPadprism5

5、.0软件进行One-wayANOVA分析8。数据采用xs表示。2结果2.1HUVECs细胞毒作用结果表明Ponatinib对HUVECs细胞株增殖显示出较强的抑制作用。随着药物浓度的升高，抑制率也升高，在0.110mol/L呈现出典型的浓度相关性图1。使用GraphPadprism5.0软件计算得到Ponatinib对HUVECs细胞的IC50为0.690.05mol/L。另外，0.01、0.05、0.10mol/L浓度的Ponatinib对HUVECs细胞的抑制率小于10%，对细胞的增殖影响较小，可作为Ponatinib的非毒性剂量用于考察该药物对细胞迁移、成管及NO水平的影响。2.2细胞迁

6、移能力影响一样作用时间下，给药组的细胞向划痕中央迁移的数量明显少于对照组，讲明经药物处理后的HUVECs细胞的划痕愈合能力与对照组相比拟差，且随着Ponatinib浓度的增加，差异越显著P0.05图2和表1，即Ponatinib对血管内皮细胞迁移能力的影响呈剂量相关性，药物浓度为0.01mol/L时已经到达半数抑制率。2.3细胞成管能力的影响由HUVECs细胞成管图像可得，不同浓度Ponatinib作用下，HUVECs细胞在Matrigel基质胶上血管构成情况存在显著差异图3。成管评分结果显示，0.05、0.10mol/L的Ponatinib组评分均显著低于对照组P0.05图4，讲明非毒性剂量

7、的Ponatinib能剂量相关地抑制HUVECs细胞的血管构成能力。2.4细胞NO释放水平影响不同浓度Ponatinib处理HUVECs细胞24h和48h后，采用硝酸复原法间接检测细胞上清液的NO浓度，结果显示，一样作用时间下，给药组的细胞培养液中的NO浓度明显低于对照组P0.05表2，表明Ponatinib抑制HUVECs细胞NO的合成与释放，且作用时间越长，NO浓度降低越显著。3讨论Ponatinib为典型的靶向抗癌药物，为小分子多激酶抑制剂，主要作用于BCR-ABL、血管内皮生长因子受体VEGFR等多种激酶。FDA相关资料报道，Ponatinib诱发血栓及其他血管毒性与Ponatinib

8、对VEGFR的抑制作用有关，并预测可能与索拉菲尼Sorafenib、帕唑替尼Pazopanib、舒尼替尼Sunitinib及贝伐单抗Bevacizumab等VEGF信号通路VSP抑制剂血管不良反响机制密切相关9。近年来，VSP抑制剂如索拉菲尼等引发的血管毒性不良反响频繁报道10。VSP抑制剂通过阻断VEGF-VEGFR互相作用，阻断其下游信号PI3K/AKT/eNOS等通路的传递，进而影响血管内皮细胞的增殖、迁移及血管构成等正常生理功能，导致血管内皮损伤11；另外，当血管内皮细胞功能受损时，其凝血与抗凝血、纤溶与抗纤溶的平衡会失调12。而凝血系统激活、纤溶系统失活及血小板黏附聚集是血栓构成的重

9、要环节。NO是由血管内皮细胞产生的一种气体信号分子，通过促进血管舒张、抑制血小板聚集和白细胞黏附调节血管的功能13。正常生理状态下，机体主要通过AKT/eNOS通路调节p-eNOS的表达，进而调控血管内皮细胞对NO的合成释放来实现对血管收缩和舒张功能的调节14。NO活性降低会诱发多种病理变化，包括改变内皮的抗凝功能，干扰内皮的生长和再生功能15。本文以此为研究根据，从Ponatinib对正常血管内皮细胞的功能影响方面初步考察Ponatinib致血栓的相关机制。研究发现，Ponatinib对HUVECs细胞的IC50为0.690.05mol/L，而45mg单次口服剂量的Ponatinib在恶性血

10、液病患者体内的血药浓度峰值Cmax为0.1610.098mol/L16，即Cmax范围为0.0630.25mol/L，结合细胞毒性实验数据分析，在此浓度范围内的Ponatinib对人血管内皮细胞有不同程度的毒性作用；另外，本研究还发现低于人体内Cmax的Ponatinib0.010.1mol/L能够显著抑制HUVECs细胞的迁移、血管构成及NO的释放P0.05。提示Ponatinib可能通过抑制内皮细胞增殖、迁移、血管构成，影响NO合成导致内皮细胞功能障碍，进而改变血管内皮的抗凝、生长及再生功能，最终诱发动静脉血管狭窄、血栓等病理变化。对PI3K/AKT/eNOS等信号通路相关机制有待进一步研究。目前，Ponatinib在临床治疗中具有不可替代性，因心血管毒性影响其使用，等待该药全面评估安全性并通过改造恢复其临床广泛应用。