陆川猪FTO基因的克隆及生物信息学讨论.docx

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1、陆川猪FTO基因的克隆及生物信息学讨论摘要：为了获得广西陆川猪肥胖相关基因(FTO)编码区序列(CDS)，试验利用基因克隆技术，从陆川猪背最长肌组织中提取总RNA，扩增出FTO基因CDS，并运用Lasergene7.0、ExpasyProtaram、ExpasyProtscale、NPS在线蛋白分析系统和SWISS-MODEL在线分析预测系统等分析软件对扩增出的序列进行生物信息学分析。结果表明：通过克隆测序得到的陆川猪FTO基因CDS全长为1518bp，与GenBank中公布的乌金猪FTO基因CDS的同源性为99.9%，与苏钟猪FTO基因CDS的同源性为99.6%；陆川猪存在第1050位点的C

2、G，碱基G为陆川猪所特有，导致天冬氨酸突变为谷氨酸；通过建立系统进化树发现，陆川猪与乌金猪的遗传距离近期，它们聚为同一支；陆川猪FTO氨基酸组成中亮氨酸含量最高，占氨基酸总数的11.7%，FTO蛋白具有较强的亲水性；陆川猪FTO蛋白的二级构造包含螺旋、无规则卷曲和延伸链。讲明陆川猪FTO基因具有高度的保守性，今后在陆川猪脂肪沉积的研究中，FTO基因可作为主要候选基因之一。关键词：陆川猪；FTO；基因；克隆；软件；生物信息学分析肥胖相关基因fatmassandobesityassociatedgene,FTO是第一个被发现与一般人群肥胖有关系的可靠候选基因，近年来因其可调节脂肪细胞沉积，进而调控

3、肥胖发生而广受人们的关注1。JFischer等2研究发现，敲除小鼠的FTO基因后，突变后的小鼠不再肥胖，而缺失FTO基因会导致刚出生的小鼠发育比拟缓慢、脂肪组织和去脂体重显著减少，进而减少肥胖的发生。研究发现，FTO基因在调节能量平衡、新陈代谢、食欲、去甲基化等方面具有非常重要的作用3-5。目前，人、山羊、牛等物种的FTO基因序列已在GenBank上公布。关于FTO基因在猪上的研究也有一些报道，如Z.Q.Du等6研究发现，猪的FTO基因定位在6号染色体上；如黄英等7以乌金猪的脂肪组织作为模板，成功克隆得到FTO基因序列；付言峰等8成功克隆得到苏钟猪的FTO基因。然而到目前为止还未见关于广西地方

4、优良品种陆川猪FTO基因编码区序列CDS的克隆及生物信息学分析的报道。本试验采用基因克隆技术，从陆川猪背最长肌组织中克隆FTO基因，并运用生物软件对该基因的序列进行生物信息学分析，旨在为弄清陆川猪FTO基因表达与脂肪沉积的相关性奠定基础。1.1试验动物陆川猪,由广西畜牧所提供，屠宰后采集陆川猪的背最长肌组织，装入灭菌消毒的冻存管中,立即置液氮中冷冻，迅速转入-80冰箱中保存，备用。1.2主要试剂RNAisoPlus、反转录试剂盒，均由TaKaRa公司生产；胶回收试剂盒，上海捷瑞生物工程有限公司生产；大肠杆菌DH5感受态细胞，南京诺唯赞生物科技有限公司生产；DL-2000Marker，广州东盛生

5、物科技有限公司生产；2TaqMasterMis，康为世纪生物科技有限公司生产。2.1陆川猪背最长肌组织总RNA的提取及反转录剪取约100mg组织样品置预冷过的研钵中，参加液氮迅速研磨成粉末状后转入1.5mLEP管中，参加RNAisoPlus1mL，之后根据反转录试剂盒讲明书提取RNA，以总RNA为模板进行反转录。反转录体系总体积为20L：OligodTPrimer1L，10mmol/LdNTPMixture1L，模板RNA2L，5PrimeScriptBuffer4L，RNase抑制剂0.5L，PrimeScriptRtase1L，无RNA酶水10.5L。反转录程序：4230s；955s；55

6、s。2.2引物的设计参照参考文献错误!未定义书签。设计FTO基因引物序列，并由深圳华大基因科技有限公司合成。引物序列：FTO-F5-ATGAAGCGAACCCCAACC-3和FTO-R5-CTAGGGTTTGGCTTCCAG-3，估计FTO基因的扩增片段大小为1518bp。2.3FTOcDNA的克隆反响体系总体积为15L：2TaqMasterMix7.5L，上、下游引物各0.5L，cDNA1L，无RNA酶水5.5L。反响程序：95预变性5min；95变性30s，56退火30s，72延伸1min，共35个循环；最后72再延伸5min。取PCR产物6L，用1.5琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色后c用紫

7、外凝胶成像仪观察并拍照。根据胶回收试剂盒讲明书回收纯化FTO基因目的片段，将目的片段与pMD18-T克隆载体连接过夜；次日将连接产物转化至大肠杆菌DH5感受态细胞中，用菌液涂布LB平板，次日挑选阳性克隆至含氨苄西林的LB液体培养基中。取含有目的片段的重组菌液，送至深圳华大基因科技有限公司测序。2.4陆川猪FTO基因与同物种间的序列比对利用Lasergene7.0生物分析软件对陆川猪FTO基因CDS与同物种间FTO基因CDS进行同源性及氨基酸突变分析。2.5陆川猪FTO基因同源性比拟及系统进化树构建利用Lasergene7.0生物分析软件中MegAlign程序对测序得到的陆川猪FTO与其他物种F

8、TO基因CDS进行同源性分析并构建系统进化树。2.6陆川猪FTO氨基酸组成分析利用NCBI在线预测软件ORFFinder将测序得到的FTO核苷酸序列翻译成氨基酸序列，然后利用ExpasyProtaram在线分析系统对陆川猪FTO的氨基酸序列进行分析。2.7陆川猪FTO亲疏水性分析利用ExpasyProtscale在线分析系统对陆川猪FTO的亲疏水性进行分析。2.8陆川猪FTO基因二级、三级构造的预测分别利用NPS在线蛋白分析系统和SWISS-MODEL在线分析预测系统预测和分析陆川猪FTO蛋白的二级、三级构造。3结果与分析3.1陆川猪FTO基因CDS的PCR扩增采用RT-PCR方法成功克隆得到

9、陆川猪FTO基因，其PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果条带位置与预期序列长度1518bp一致，见图1，因而能够初步确定此条带为陆川猪FTO基因CDS。经深圳华大基因科技有限公司测序发现，获得了陆川猪FTO基因CDS，其长度为1518bp。3.2陆川猪FTO基因与同物种间的序列比对通过克隆得到的陆川猪FTO基因CDS与GenBank中公布的猪FTO基因(NM_001112692)CDS的同源性为99.5%；用陆川猪FTO基因CDS与NCBI中发表的乌金猪(JQ031263)和苏钟猪(JX873956)这两种猪的FTO基因CDS进行比照，同源性分别为99.9%和99.6%，证明所克隆的片段为

10、陆川猪FTO基因CDS序列。陆川猪FTO基因CDS与其他猪相比，存在第1050位点的CG，碱基G为陆川猪所特有，导致天冬氨酸突变为谷氨酸。此外，与GenBank中公布的猪FTO基因(NM_001112692)相比，陆川猪FTO基因CDS第38位点的GA，导致甘氨酸突变为谷氨酸，第509位点的CT，导致丙氨酸突变为缬氨酸，第614位点的GA，导致丝氨酸突变为天冬酰胺，第796位点的AG，导致天冬酰胺突变为天冬氨酸，第988位点的GA，导致丙氨酸突变为苏氨酸；第213位点的AG，第594位点的CG，但均为同义突变。与GenBank中公布的苏钟猪(JX873956)相比，陆川猪FTO基因CDS第61

11、4位点的GA，导致丝氨酸突变为天冬酰胺，第1330位点的GA，导致丙氨酸突变为苏氨酸；第213位点的AG，第594位点CG，但均为同义突变。与GenBank中公布的乌金猪(JQ031263)相比，陆川猪FTO基因CDS第163位点的TG，导致半胱氨酸突变为甘氨酸。3.3陆川猪FTO基因同源性比拟及系统进化树构建利用Lasergene7.0生物分析软件中的MegAlign程序对测序得到的陆川猪FTO基因编码区序列与NCBI中的乌金猪(JQ031263)、牛(BC140478)、人(NM_001080432)、绵羊(EU072419.1)、苏门答腊猩猩(NM_001132778)、山羊(NM_00

12、1319276)的FTO基因编码区序列进行同源性比拟，结果同源性分别为99.9%、87.9%、87.3%、87%、86.8%和86.7%。3.4陆川猪FTO氨基酸组成分析利用ExpasyProtaram在线分析系统分析陆川猪FTO的氨基酸序列，揣测出陆川猪FTO蛋白分子质量为58132.05u，等电点为5.19。3.5陆川猪FTO蛋白的亲疏水性分析借助ExpasyProtscale在线分析系统预测FTO的亲疏水性，其中正数表示疏水，数值越大表示疏水性越强；而负数表示亲水，数值越小表示亲水性越强。4讨论与结论近年来，FTO基因可通过调控机体摄食和脂肪代谢影响肥胖而广受学者的关注9。在动物营养与肉

13、质调控领域中，FTO基因在影响动物肉品质的关键因素脂肪沉积和代谢方面的研究也获得了一定进展。林亚秋等10克隆出简州大耳羊FTO基因，并发现24月龄山羊股二头肌和背最长肌FTO基因表达量要比810月龄、13月龄高，背最长肌FTO基因表达量与其肌内脂肪IMF含量呈负相关，相关系数r等于-0.415。李倩等11研究发现，FTO基因在成都麻羊臂三头肌中的表达量与IMF含量的相关系数是-0.821，呈高度负相关，讲明在山羊肌内脂肪沉积中FTO基因很可能发挥了重要调控作用。林森等12克隆出藏鸡FTO基因CDS，并发现藏鸡不同发育阶段不同肌肉组织中FTO基因表达水平与其IMF含量呈不同程度的相关。付言峰等8

14、研究发现，FTO基因在苏钟猪不同组织中的表达量不同，从低到高的排序为背最长肌肝脏肺脏心脏背膘，这与M.B.Madsen等13以哥廷根小型猪作为试验动物的研究结果一致。陈友贵等14研究发现，10月龄贵州白冼猪不同组织中FTO基来由小到大的顺序是胃肝脏大肠肌肉肺脏小肠心脏肾脏脾脏。朱琳娜15研究发现，180日龄脂肪型猪种金华猪的肌肉和脂肪组织中FTO基因表达量要比同日龄瘦肉型长白猪和中间型长金猪高，此研究结果讲明此基因与肥胖和机体能量代谢间的相关性较高。黄英等7研究发现，云南乌金猪脂肪和肌肉中均有FTO基因的表达，但肌肉中的表达量比脂肪低。本试验克隆得到陆川猪FTO基因CDS，长度为1518bp，

15、与GenBank中公布的中国云南地方脂肪型猪种乌金猪FTO基因CDS的同源性为99.9%，与江苏自主培养杂交瘦肉型苏钟猪FTO基因CDS的同源性为99.6%。此外，陆川猪FTO基因CDS与其他猪相比，存在第1050位点的CG，碱基G为陆川猪所特有，导致天冬氨酸突变为谷氨酸。研究发现，猪FTO基因定位在调控诸多脂肪性状的数量性状位点的6号染色体区域上6，16。故FTO基因的表达很可能与陆川猪的脂肪沉积和代谢存在密切关系，进而对陆川猪优质肉质性状的构成造成影响，其潜在的机制需要进一步讨论。用生物软件分析陆川猪与乌金猪、牛、人、绵羊、苏门答腊猩猩、山羊这几个物种的FTO基因CDS的同源性，发现同源性到达86.7%以上；同时构建物种系统进化树，结果表明，陆川猪与乌金猪遗传距离近期，它们聚为同一支。对陆川猪FTO氨基酸组成分析发现，亮氨酸含量最高，占氨基酸总数的11.7%，FTO蛋白具有较强的亲水性；对陆川猪FTO蛋白二级、三级构造进行预测，发现其包含螺旋、无规卷曲和延伸链。本试验成功克隆了陆川猪FTO基因的CDS序列，其突变位点可能影响陆川猪肌内脂肪沉积，进而影响肉质，今后对陆川猪脂肪沉积进行研究时能够FTO基由于主要候选基因之一，本试验为深化揭示FTO基因在陆川猪脂肪沉积和脂肪代谢中的调控作用奠定了基础。