针叶树根腐病的研究进展.docx

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1、针叶树根腐病的研究进展（生物技术通报杂志）2014年第七期1大伏革菌介绍大伏革菌从属于担子菌门Basidiomycota、伞菌纲Agaricomycetes、多孔菌目Polyporales、原毛平革菌科Phanerochaetaceae，是一种常见的木材腐朽菌。在自然环境中，大伏革菌子实体通常生长在树桩和倒木上，其生长对湿度的要求较高。一般情况下，被侵染树桩在1年后开场出现子实体，3-4年后子实体成熟22。成熟的子实体开场产生担孢子，担孢子是侵染树木的主要形态，它能够被广泛的传播，在距离产孢中心250m远的地方均有担孢子出现。担孢子大多在晚上释放，影响其构成速率的主要因素有温度和空气湿度等。另

2、外，大伏革菌经过菌丝断裂经过能够产生无性孢子，无性孢子可以以侵染树桩，但到目前为止，关于无性孢子传播方式的研究较少。大伏革菌菌株有同核体和异核体之分，同核体是指在菌丝体中细胞核的基因型一样，它是由基因型一样的菌丝融合而成；异核体是指带有不同遗传性状的两个单倍体菌丝互相融合，导致菌丝体中并存有两种或以上不同遗传型的核。大伏革菌同核体和异核体菌株之间在形态上无明显区别，但在性质上有较大差异，十分是在防治病原菌方面，同核体菌株的孢子产量比异核体菌株大得多，但只能在室内实验室条件下防治异担子菌，其生长速率和防治效率均比异核体菌株小，在林地中易退化23，24，故在防治异担子菌中没有实际应用价值。因而，目

3、前无论进行室内研究还是生产商业制剂均采用异核体菌株。2大伏革菌防病历史及商业化菌剂发展1950年，英国人Rishbeth20首先提出用大伏革菌防治异担子菌，大伏革菌能够像异担子菌一样侵染树木活组织，通过优先占领生态位来控制异担子菌在该树桩上的生长，其侵染经过不依靠其他微生物的辅助作用。大伏革菌在自然状态下侵染松树的概率很高，这样能够保护松树免受异担子菌侵染。在英国，大伏革菌侵染树桩概率和侵染面积均比异担子菌高，但两者侵染树桩的季节不一样，大伏革菌孢子对于枯燥的环境更敏感，在暖和且极其枯燥的情况下，大伏革菌产孢率降低，与异担子菌间竞争减弱，导致异担子菌大范围侵染树桩。在芬兰，大伏革菌和异担子菌孢

4、子出现的时间大致一样，在5月末到8月末大伏革菌孢子出现概率最大，此时能够显著降低异担子菌的侵染率。Meredith25通过试验证实，大伏革菌孢子即便比异担子菌孢子沉降低，可以以降低异担子菌侵染面积。最初应用大伏革菌作为生防剂时，在接种量和应用剂型方面还难以把握。1963年，Rishbeth22制作了片状的生防剂，用以溶解稀释后喷洒于伐桩外表。试验得出在20条件下，溶解稀释后的孢子悬浮液在48h后孢子活力没有显著降低，但实际应用中建议现用现配。此剂型主要缺点是在森林中使用时至少要提早1h水化，实际经常需要通宵浸泡。1968年，Rishbeth优化了生防剂型，以乳化油替代了片剂应用于森林中9，但乳

5、化油较易污染，很难维持无菌状态。1970年，产品被重新包装，新的包装形式是将孢子悬浮液混合于蔗糖溶液中，将此混合物密封于聚氯乙烯小袋中，此商品克制了过去出现的问题，且保存时间长。因而，英国人将该混合物发展为商业化菌剂，商品注册名为“PGS26。PGS只能施用于松树上，在4条件下保存7个月。此后，多个国家如保加利亚、加拿大、芬兰、法国、德国和波兰等将此商品应用于林地进行野外防治，获得了较好效果。与此同时，各国科学家们都在研究合适本人国家的生物防治菌剂。1970年，波兰商业化的生防菌剂产生，注册名为“IBL。此商品是将大伏革菌的孢子和菌丝接种于灭菌后的山毛榉木屑中，将此混合物放于聚乙烯的小袋中，可

6、应用于松树和云杉上，在枯燥低温环境下可存放1年。1991年，芬兰科学家从云杉树桩上分离得到一株异核体大伏革菌，将其做成可湿性粉剂，混合硅胶后，密闭封存在箔衬袋中，此商品注册名为“Rotstop，其可应用于松树和云杉上，在零下18条件下可存放18个月；8下存放1年；室温下可存放1星期。但打开包装后必须在24h内使用26。与此同时，美国也生产了大伏革菌商品化制剂，但是未获得认可。在Fennos-candia地区，每年有62000hm2的欧洲云杉使用大伏革菌来防治异担子菌；在整个欧洲，每年有超过20万棵树木使用此方法来进行根腐病的防治27，28。中国对针叶树干基腐朽病的防治研究较少。作者于2012年

7、在中国东北林区及云南省广泛采集和分离野生大伏革菌，并且通过室内培养基及木桩实验，比照了我国的和国外引进的野生大伏革菌对中国小孔异担子菌的防治效率。实验结果表明，中国大伏革菌防治小孔异担子菌的效率较国外大伏革菌差。3大伏革菌防病机制早期研究表明，大伏革菌抗异担子菌的机制可能有3种：菌丝干预、营养竞争和诱导寄主抗性。3.1菌丝干预菌丝干预是在真菌竞争间普遍存在的一种现象，大伏革菌能够引起异担子菌菌丝构造及功能变化，在一定程度上造成异担子菌死亡。它们之间的菌丝干预形式和Ascoboluscrenulatus与Coprinusheptemerus之间干预形式类似，即在两者接触区域，质膜内陷，构成超大的

8、质膜囊泡，细胞里的内含物通过此囊泡外泄，细胞逐步瓦解、死亡，而且在两者接触区域无可见的线粒体，连结线粒体的电子致密物质沉积29，30。Mgbeahuruike等31在2013年指出，大伏革菌培养经过中分泌的微小粒子能够抑制异担子菌早期葡萄糖代谢经过的关键酶表达。同时，由于大伏革菌的干预作用，两种菌丝交互作用中异担子菌编码信号转导经过中的关键蛋白的基因表达水平降低，使其竞争力减弱。3.2营养竞争大伏革菌作为营养竞争者，通常和病原菌之间竞争碳、氮和铁等营养元素，进而限制其增长，营养竞争的关键在于其能够快速的在树桩上定殖，占领更多的生态位，致使异担子菌不能够继续侵染树桩。Krik和Rennerfel

9、t32在1957年证明大伏革菌比异担子菌能更快的侵染树桩，也能在已被病原菌侵染的树桩上代替异担子菌。这和大伏革菌胞外酶的分泌有必然联络，由于大伏革菌作为一种常见的木材腐朽菌，能够产生很多胞外酶，这些酶能够降解木材组织，利用降解产物来知足本身对于营养物质的需求，同时到达定殖于树木上的目的。一般情况下，不同大伏革菌菌株产生某种酶的酶活性不一样，酶活越高，定殖树木的速率就越大，生物防治的潜能也就越大。大伏革菌产生的胞外酶有：脱氢酶、磷酸酶、纤维素酶、漆酶和通用过氧化物酶等。Anna等33在2008年指出，大伏革菌产生的漆酶较少，过氧物酶、纤维素酶、磷酸酶和脱氢酶含量高。漆酶主要介入木质素氧化和杀菌的

10、酚类物质降解和脱毒经过，大伏革菌缺少漆酶就讲明大伏革菌不是致病菌。另外，大伏革菌产生P2O酶，该酶介入到木质纤维素的氧化解聚中，主要作用方式是给过氧化物酶木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶提供H2O234。一般情况下，呼吸酶的活性如脱氢酶和磷酸酶能够作为真菌降解经过强弱的量度，磷酸酶的活性受脱氢酶的影响。2000年，Varela和Martinez35在大伏革菌中发现木质素过氧化物酶，大伏革菌高的过氧化物酶活性象征着树木木质素生物降解的开场，这对于白腐菌是必要的经过。3.3诱导寄主抗性施用大伏革菌能使寄主细胞产生有毒的代谢物质，这些代谢物质限制了异担子菌进一步生长。在植物生命活动中，细胞程序化死亡对

11、于植物正常生理活动是很重要的，而在这一经过中半胱氨酸起着重要的调解作用。研究发现，预处理大伏革菌后，调节半胱氨酸蛋白酶产生及坏死细胞死亡的基因高度转录36，37，寄主部分细胞程序化死亡，进而使由异担子菌侵染引起的寄主组织坏死斑停止继续扩展38。最重要的是，施用腐生营养型大伏革菌后能够提高寄主的局部抗性，使寄主细胞壁木质化和栓化，强度增加，阻止了异担子菌的侵染定殖。在大伏革菌预处理过的组织中，DAHPS和SAMS两个基因高度转录，DAHPS基因可产生合成木质素经过中第一个酶39，而SAMA基因则编码不同木质素衍生物合成经过中的关键酶40。木质素及其衍生物的合成，能够阻止病原菌产生的酶和毒素的浸透

12、和扩散，进而保护树木组织。因而，这两个基因的高度转录讲明了它们在阻止异担子菌侵入的经过中的起着关键作用。4大伏革菌防病经过对周围环境的生态影响在森林生态系统中，根际周围存在着很多生物，如细菌、菌根真菌和昆虫等，这些生物中有的能起到保护树木的作用，它们通过营养竞争等手段来对抗木材腐朽菌。细菌在整个树木腐朽经过中非常重要，如固氮细菌对腐朽经过中氮平衡的维持起到重要作用41。与化学防治相比，生物防治是一种环境友好的防治方法，其对靶标生物影响较小。然而，大规模的应用生物防治剂会不可避免地对针叶树树桩上的真菌、细菌群落及地表植被造成很大的影响42-46。使用Rotstop处理初期，大伏革菌在树桩上占主导

13、地位，这并不影响其他微生物定殖树桩。但是，由于大伏革菌生长速率较快，限制了其他微生物的营养利用，以致可减少达15%的物种丰富度。处理6年后，大伏革菌渐渐失去主导地位，而Resiniciumbicolor、Hypholomacapnoides和Sistotremabrinkmannii等真菌逐步增加46。在意大利，施用大伏革菌2年就会对该地区真菌区系造成很大影响47。另外，有研究表明大伏革菌的生长能够显著降低腐朽初期阶段细菌的丰富度43。而应用单一基因型的Rotstop生物制剂在短时间内不会对当地大伏革菌种群基因型造成威胁48。5野生大伏革菌挑选经过、指标及防病注意事项商业化生物制剂所用菌株均是

14、从野外采集、分离，纯化，最后通过一定的试验验证而得到的防治效果最好的菌株。Rotstop制剂所用菌株是同一种异核体菌株，PGS所用菌株是从野外采集选取的近10种菌株，而IBL选取的菌株则更多。这3种商业化制剂选取的野生大伏革菌菌株均是从野外的腐朽树桩、原木或裸露的木片上采集和分离的。采集工作是一个持续的经过，我们必须不断更新和补充菌株，挑选效果最好的菌株来防治异担子菌。挑选可用于商业化的高效大伏革菌没有固定的程序，总体来讲分为3个方面。1在MEA培养基上测量大伏革菌生长速率和拮抗异担子菌效率。实际工作中，IBL在MEA中添加了愈创木酚，测量其酚氧化酶活性；Rotstop在MEA中添加了木质素染

15、料，测量其分解木质素的活性，这些对于挑选高效菌株都是必需的。2室内测量木桩上大伏革菌防治异担子菌效率。其中，IBL选择测量被异担子菌侵染后木片失重率和预处理大伏革菌然后接种异担子菌木片失重率，失重率测量同样适用于室内木桩挑选生防菌。3在野外伐桩上测量前面挑选过的高效大伏革菌防治异担子菌效率。PGS和IBL在松树上进行，Rotstop在云杉上进行，经过野外伐桩防治效率的检验，最终确定商品化的菌株。2011年，Anthony23改进了室内挑选菌株的培养基，他所用的木锯屑改进培养基是和自然介质最接近且最合适大伏革菌生长的培养基，能够用于快速挑选高生长率和拮抗作用的大伏革菌，而室内树桩挑选关键看其在树

16、木上的生长速率。他在2012年指出，大伏革菌的两个疏水蛋白Pgh1和Pgh2在其防治异担子菌中发挥重要作用，强拮抗作用菌株在木锯屑培养基的单菌落中Pgh1高度表达，拮抗能力和两菌株接触时Pgh1、Pgh2的转录水平呈正相关49。所以，在挑选高效菌株时，可以以从基因水平入手，这样使结果更为准确。作者在前人研究的基础上，从别人很少研究的酶活角度入手，研究大伏革菌纤维素酶活力与其木桩拮抗率的关系，试验得出，两者在0.01水平上显著相关。纤维素酶能够降解新鲜树桩及其根部组织细胞壁纤维素构造，使真菌能够快速定殖于树桩，这是高效生防菌株所必须的，故作者以为能够将大伏革菌胞外纤维素酶活作为高效生防菌株挑选的

17、指标之一。另外，在挑选经过中还发现大伏革菌的控制效率和其孢子悬浮液的浓度、异担子菌的孢子悬浮液浓度以及这两个菌株孢子比例密切相关50。1960年，Meredith25发现防治松树根腐病所需的异担子菌和大伏革菌孢子悬浮液浓度比例是1/10时最有效，但在防治挪威云杉时，比例为1/2.5，每种寄主要求的比例不一样。而且防治效率和喷洒的大伏革菌孢子悬浮液的面积成一定数量关系，大伏革菌喷洒面积越大，异担子菌侵染树桩面积越小51。Dumas52在2011年得出，一些化学物质，如木质素磺酸铵木铵，ALS能够刺激大伏革菌的萌发和生长，当大伏革菌孢子溶解于1%或2.5%的木铵溶液时，大伏革菌在任何温度下的萌发率

18、均比溶解于水中高，且其萌发管更长，将此悬浮液喷洒于伐桩外表时，大伏革菌能够更快定殖于伐桩外表，进而防止异担子菌侵染伐桩。大伏革菌是一种有两极杂交系统的异核体真菌，通过配对实验和DNA印迹分析得出，欧洲的大伏革菌菌株之间是互交可育的，而且其欧洲种群和北美洲种群间也是互交可育的。因而，可以以通过优良菌种杂交来到达提高大伏革菌防治效率的目的24。6结语大伏革菌菌株作为防治针叶树根腐病的有效菌株已经被广泛使用。但随着野外防治时间增加，大伏革菌优良基因退化，且病原菌构成一定的抗性。此时，使用新的挑选方案对于大伏革菌的广泛应用具有一定的好处。随着分子生物学、转录组学及基因组学等相关技术的发展，我们能够将研究目光聚焦在与大伏革菌本身拮抗能力相关的基因及拮抗异担子菌经过中相关基因转录水平的变化上，利用分子育种技术培育高效大伏革菌。