跨膜蛋白16F对乳腺癌细胞的影响.docx

《跨膜蛋白16F对乳腺癌细胞的影响.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《跨膜蛋白16F对乳腺癌细胞的影响.docx（7页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、跨膜蛋白16F对乳腺癌细胞的影响摘要:目的讨论跨膜蛋白16FTMEM16F在乳腺癌细胞中的表达，说明敲除TMEM16F对T47D乳腺癌细胞增殖和迁移的影响。方法应用Westernblotting检测MDA-MB-231、T47D乳腺癌细胞TMEM16F蛋白表达。应用CCK-8细胞增殖实验检测敲除TMEM16F对T47D乳腺癌细胞增殖的影响。应用细胞划痕实验检测敲除TMEM16F对T47D乳腺癌细胞迁移的影响。结果West-ernblotting结果显示，在乳腺癌细胞中有TMEM16F蛋白表达。CCK-8细胞增殖实验结果显示，与ScrambledshRNA组比拟，敲除TMEM16F后T47D乳腺

2、癌细胞增殖能力降低P=0.0370。划痕实验结果显示，与对照组比拟，敲除TMEM16F后T47D乳腺癌细胞的迁移能力加强P=0.0027。结论TMEM16F在T47D乳腺癌细胞中高表达，敲除TMEM16F能够抑制T47D乳腺癌细胞增殖而促进T47D乳腺癌细胞迁移。关键词:乳腺癌；跨膜蛋白16F；增殖；迁移跨膜蛋白16Ftransmembraneprotein16F，TMEM16F又称作AnoctaminANO6，是TMEM16家族的成员之一1，是1个具有10次跨膜构造的蛋白。它在人类很多组织胃上皮细胞、成骨细胞、淋巴细胞、血小板细胞、脉管系统以及肾脏中都有表达2，与多种疾病的发生发展密切相关。

3、TMEM16F构造还不明确，目前主要有3种讲法：1TMEM16F具有磷脂翻转功能，这与其他TMEM16家族成员不同3-4，在细胞膜上存在磷脂分布不对称性，外小叶上富含鞘磷脂和磷脂酰胆碱，内部小叶上含有磷酯酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺，这种磷脂不对称分布由一种依靠ATP的蛋白scramblease维持。无论在生理还是病理条件下Ca2+依靠的scramblease激活通过催化使磷酯酰丝氨酸快速外翻到细胞外表，而使这种膜不对称性崩塌5。2研究6-7发现，TMEM16F作为一种Ca2+激活的非选择性阳离子通道在血凝固期间能够对血小板造成磷脂翻转。3有研究8以为TMEM16F是Ca2+激活的阴离子通道。200

4、9年，研究9发现TMEM16家族中的很多成员都在肿瘤中过表达。研究10也发现TMEM16家族中的TMEM16A、TMEM16F、TMEM16K通常在同一组织中表达，并且TMEM16A基因定位于人类染色体11q13区域ampliconcore，此区域很多基因在乳腺癌、肺癌中高表达，且在癌症发生发展经过中都有重要作用11。2013年，有研究12表明在TMEM16F和TMEM16A稳定敲除的ELA细胞中，细胞迁移速率下降，并且TMEM16F会促进成肌细胞C2C12增殖13-14。TMEM16F与TMEM16A同源，TMEM16F与乳腺癌的相关性及对乳腺癌细胞迁移和增殖的影响还需进一步研究。本研究拟讨

5、论TMEM16F在乳腺癌细胞中的表达，瞬时转染靶向TMEM16F的特异性shRNA到乳腺癌细胞T47D中，检测TMEM16F对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响。1材料与方法1.1细胞培养乳腺癌MDA-MB-231、T47D细胞均来自美国菌种保藏中心于5%CO2、37的恒温箱内，在含10胎牛血清以色列BiologicalIndustries公司和1青霉素和链霉素的DMEM胎牛血清培养液中培养。1.2转染鼠源TMEM16F的smallhairpinRNAshRNA，上海吉凯基因公司，序列为ATGTACTCACGTAGTGATA，用scrambledshRNATTCTCCGAACGTGTCACGT作为阴性

6、对照。采用Lipofectamin2000美国Invitro-gen公司在无血清的培养基中瞬时转染T47D细胞的靶向TMEM16F特异性shRNA。转染48h后将细胞用于后续实验。1.3Westernblotting检测细胞转染48h后将T47D细胞在含有RIPA缓冲液和蛋白酶抑制剂混合物中国Beyotime公司的冰冷裂解缓冲液中匀浆。在含有蛋白酶抑制剂和PMSF细胞裂解缓冲液试剂盒，中国BeyotimeBio-technology公司的冰冷RIPA缓冲液中，将细胞裂解物以13400r/min离心15min，使用BCA方法测定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE分离蛋白质，通过湿转膜方法转移到PV

7、DF膜上。用5的脱脂奶粉封闭，然后用TMEM16F抗体11000，美国Thermo公司4下过夜孵育。用-actin作为内参对照，然后将PVDF膜用与辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔二抗110000，美国Abcam公司室温下孵育1h。使用显色加强的化学发光检测液ECL美国BIO-RAD公司进行显影。1.4CCK-8实验通过CCK-8试剂盒中国Biosharp公司检测细胞活力。将转染48h后的T47D细胞2103/孔接种到96孔板中。细胞在培养基中生长24h后与CCK-8溶液一起温育2h。采用酶标仪美国MolecularDevices公司450nm波长测量。1.5细胞划痕实验细胞转染48h后将细胞11

8、06/孔接种在6孔板中。用200L移液管尖端轻轻刮擦汇合细胞，然后PBS轻轻洗涤。使用光学显微镜在0、24h分别获得图像，并记录划痕面积。1.6统计学分析应用GraphPadPrism62.02软件进行统计学分析，计量资料以x-s表示，2组比拟采用t检验。每组实验重复3次，P0.05为差异有统计学意义。2.1乳腺癌细胞中TMEM16F蛋白表达结果显示，TMEM16F在乳腺癌细胞T47D及MDA-MB-231中均有表达，在乳腺癌细胞T47D表达水平高于乳腺癌细胞MDA-MB-231。可见TMEM16F与乳腺癌密切相关，见图1。2.22组乳腺癌细胞T47D中TMEM16F蛋白表达比拟相对于转染TM

9、EM16FscrambledshRNA组1.000.00，靶向TMEM16F的特异性shRNA组0.420.12对TMEM16F表达有明显抑制作用，2组比拟差异有统计学意义t=6.072，P=0.0261。2.3敲除T47D乳腺癌细胞TMEM16F后对细胞增殖能力的影响结果显示，特异性靶向TMEM16F的shRNA体外转染乳腺癌细胞T47D，敲除TMEM16F后T47D细胞增殖能力减弱。与对照组scrambledshRNA组，1.000.00比拟，敲除T47D细胞中TMEM16F后细胞增殖0.500.14差异有统计学意义t=5.055，P=0.0370。2.4敲除T47D乳腺癌细胞TMEM16

10、F后对细胞迁移能力的影响结果显示，转染TMEM16FshRNA后，T47D细胞的迁移能力加强，见图3。与对照组scrambledshRNA组，31.450.94%比拟，敲除T47D细胞中TMEM16F后的细胞迁移率46.740.42%增高，差异有统计学意义t=19.17，P=0.0027。研究1表明TMEM16家族介入多种生理功能离子运输、磷脂翻转以及其他膜蛋白监管等。YU等10发现TMEM16家族中TMEM16F与TMEM16A密不可分，TMEM16F具有scramblease活性，而TMEM16A没有。并且通过TMEM16A与TMEM16F结合的杂交蛋白确定了TMEM16F区域负责scra

11、mblease活性。除此之外，scramblease区域电脑模型显示出它能够向细胞膜外表构成1个凹槽来帮助磷脂穿梭于细胞膜的双分子层，最终这个凹槽能够与其他的蛋白互相作用来调节磷脂翻转10。2013年研究12发现ELA细胞中稳定敲除TMEM16F和TMEM16A后细胞的迁移速率下降。但是TMEM16A和TMEM16F在细胞迁移经过中扮演不同角色，进而影响细胞迁移机制中的不同组分，TMEM16A更倾向于转向经过，TMEM16F更类似于迁移经过中的“引擎，影响迁移速率12。研究13-15表明TMEM16A能够促进癌细胞增殖，TME-M16A在乳腺癌细胞中能够通过ERK/AKT信号通路促进乳腺癌细胞

12、增殖。2014年ZHAO等16研究发现TMEM16F可以以通过ERK/AKT通路类似地调节C2C12细胞，促进成肌细胞增殖。本研究结果证明，无论是三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231，还是PR、ER阳性乳腺癌细胞T47D中，TMEM16F均表达，讲明乳腺癌细胞与TMEM16F相关。CCK-8实验结果发现TMEM16F敲除后T47D细胞生存能力降低，证明TMEM16F可能促进T47D乳腺癌细胞增殖。细胞划痕实验发现TMEM16F敲除后的T47D细胞迁移率增加，证明TMEM16F可能会抑制T47D乳腺癌细胞的迁移。综上所述，TMEM16F在T47D乳腺癌细胞中高表达，敲除TMEM16F能够抑制T47D乳腺癌细胞增殖而促进T47D乳腺癌细胞迁移。但TMEM16F在乳腺癌细胞增殖、迁移经过中详细作用机制需进一步研究。乳腺癌患者治疗通常采用全身、局部或者综合治疗17。固然通过活检或者常规影像学和放射学检查能够获得相应的疾病进展状况，但在没有相应标志物的情况下可能导致治疗无效，因而寻找到新的靶向标志物至关重要。本研究提示TMEM16F可能成为乳腺癌细胞治疗的新的靶向标志物。