食品中玉米赤霉烯酮的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201913）.docx

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1、附件 13食品中玉米赤霉烯酮快速检测 胶体金免疫层析法 (KJ201913)1.范围本标准规定了食品中玉米赤霉烯酮快速检测胶体金免疫层析法。 本标准适用玉米、小麦及其碾磨加工品中玉米赤霉烯酮快速筛选测定。第一法第一法 比色法比色法2.原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的玉米赤霉烯酮经提取后与胶体金标记的 特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条中检测线（T 线）上的抗原结合，从而导致检测线颜 色深浅的变化。通过检测线（T 线）与控制线（C 线）颜色深浅的比较，对样品中玉米赤 霉烯酮进行结果判定。3.试剂及材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，试验用水为 GB/T 6682 规定的二级水。

2、3.1. 试剂3.1.1.乙腈。 3.1.2.甲醇+水（7+3，体积比） 。 3.1.3.稀释缓冲液（胶体金免疫层析检测试剂盒专用提取液或根据产品使用说明书配置） 。3.2. 参考物质玉米赤霉烯酮的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度95%。表1 玉米赤霉烯酮参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子量玉米赤霉烯酮Zearalenone17924-92-4C18H22O5318.36注：或等同可溯源物质。3.3. 标准溶液的配制3.3.1.标准储备液：称取适量标准品，用乙腈（3.1.1）溶解，配制成浓度为

3、100 g/mL的 标准储备液。18 避光保存，有效期6个月。 3.3.2.标准工作液：准确量取标准储备液（100 g/mL） （3.3.1）100 L，置于10 mL容量 瓶中，用乙腈（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1 稀/mL的玉米赤霉烯酮标 准工作液，2 8 避光保存，有效期1个月。3.4. 材料玉米赤霉烯酮胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为玉米、小麦及其碾磨加工品。4.仪器和设备4.1. 移液器：100 L、200 L、1 mL 和 5 mL。4.2. 旋涡混合器。4.3. 离心机。4.4. 电子天平：感量为 0.01 g。5.环境条件环境温度：20 30 。 空气相对湿度：最

4、佳测定湿度 45 %65 %。若湿度低于 45 %，相应延长待测液-试纸条反应时间，以质控实验为准；若湿度为 65 %80 %，微孔与试纸条拆开后立即使用， 避免微孔与试纸条长时间暴露在空气中受潮；避免在湿度 80 %以上湿度进行实验。6.分析步骤6.1. 试样制备按GB 5491扦取的样品充分碾磨或粉碎混匀，过40目筛。6.2. 提取准确称取试样5.0 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入20 mL 甲醇+水溶液 （3.1.2） ，用旋涡混合器振荡3 min，离心分层或静置分层，上清液备用。 准确移取0.8 mL稀释缓冲液（3.1.3）于1.5 mL离心管中，加入25 L上清液

5、，混匀，待 检。6.3. 测定步骤依检验所需，取相应数量的金标微孔和试纸条，做好标记。吸取待检液 200 L 于金标 微孔中，抽吸至孔底的紫红色颗粒完全溶解，孵育 10 min。将试纸条插入金标微孔中，反 应 3 min5 min。 从金标微孔中取出试纸条，弃去试纸条下端的样品垫，观察显色情况，进行结果判定。 （若试剂盒冷藏保存，使用前需恢复至实验环境温度。 ）7.质控试验每批样品应同时进行空白试验和阳性质控试验，可根据检测样品量制定适宜频次的质 控试验。7.1. 空白试验7.1.1.试剂空白试验：除不称取试样外，均按6.2和6.3所述步骤操作。7.1.2.基质空白试验：准确称取空白试样，按6

6、.2和6.3所述步骤操作。7.2. 阳性质控试验准确称取玉米赤霉烯酮含量为60 g/kg的质控样，按6.2和6.3步骤操作。或准确称取空 白试样，加入一定体积的玉米赤霉烯酮标准工作液（3.3.2） ，使玉米赤霉烯酮添加量为60 g/kg，按6.2和6.3步骤操作。8.结果判定通过对比控制 C 线和检测 T 线的颜色深浅进行结果判定。8.1. 无效结果无论样品中有无玉米赤霉烯酮存在，控制C线均会出现一条紫红色条带。若C线未显色， 表明操作不正确或试纸条已失效，检测结果无效（见图1）。图图 1 试纸条目视判定图试纸条目视判定图8.2. 阳性结果控制C线显色，检测T线显色比C线浅或者没有颜色，判定为

7、阳性（见图2） 。8.3. 阴性结果控制C线显色，检测T线显色比C线深或者一致，判定为阴性（见图2） 。图图 2 试纸条目视判定图试纸条目视判定图8.4. 质控试验要求空白试验结果应为阴性，阳性质控试验结果应为阳性。比色法比色法无效无效第二法第二法 消线法消线法9.原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的玉米赤霉烯酮经提取后与胶体金标记的 特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条中检测线（T线）上的抗原结合，从而导致检测线颜 色深浅的变化。通过T线显色与否进行结果判定。10. 试剂及材料同3。11. 仪器和设备同4。12. 环境条件环境温度：10 40 。 空气相对湿度：同5。13. 分析步骤13

8、.1.试样制备同 6.1。13.2.提取准确称取试样5.0 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入12.5 mL甲醇+水溶液 （3.1.2） ，用旋涡混合器振荡3 min，离心分层或静置分层，上清液备用。 准确移取400 L稀释缓冲液（3.1.3）于1.5 mL离心管中，加入上清液(小麦50 L，玉米 80 L） ，混匀，待测。13.3.测定步骤同6.3。14. 质控试验每批样品应同时进行空白试验和阳性质控试验，可根据检测样品量制定适宜频次的质 控试验。14.1.空白试验14.1.1. 试剂空白试验：除不称取试样外，均按13.2和13.3所述步骤操作。 14.1.2. 基质空白试验

9、：准确称取空白试样，按13.2和13.3所述步骤操作。14.2.阳性质控试验准确称取玉米赤霉烯酮含量为60 g/kg的质控样，按13.2和13.3步骤操作。或准确称取 空白试样，加入一定体积的玉米赤霉烯酮标准工作液（3.3.2） ，使玉米赤霉烯酮添加量为60 g/kg，按13.2和13.3步骤操作。15. 结果判定通过观察检测 T 线显色与否进行结果判定。15.1.无效同8.115.2.阳性结果控制C线显色，检测T线不显色，判定为阳性（见图3） 。15.3.阴性结果控制C线显色，检测T线显色，判定为阴性（见图3） 。图图 3 试纸条目视判定图试纸条目视判定图16. 质控试验要求同 8.4第三法

10、第三法 读数仪法读数仪法17. 具体检测步骤及结果判定可参考相应的说明书操作，质控试验参照第一法与第二法。18. 结论本方法筛查出的阳性样品进行确认时，应按 GB 2761 指定方法标准检测并判定。19. 性能指标19.1.检出限60 g/kg。19.2.灵敏度灵敏度95%。19.3.特异性特异性90%。19.4.假阴性假阴性5%。19.5.假阳性消线法消线法假阳性10%。注：性能指标计算方法见附录 A。20. 其他本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为了方便方法使用者，在使用本方法时不 做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，满足本方 法规定的各项性能指标时方

11、可使用。 本方法参比标准为GB 5009.209-2016 食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定。附录 A 快速检测方法性能指标计算表检测结果检测结果b样品情况样品情况a阳性阳性阴性阴性总数总数阳性N11N12N1.=N11+N12阴性N21N22N2.=N21+N22总数N.1=N11+N21N.2=N12+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2显著性差异（2）2=（N12-N21-1）2/（N12+N21） ，自由度（df）=1灵敏度（p+，%）p+=N11/N1.特异性（p-，%）p-=N22/N2.假阴性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-灵敏度假阳性率（pf+，%）

12、pf+=N21/N2.=100-特异性相对准确度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：a样品中实际的公议值结果；b由玉米赤霉烯酮胶体金试纸条检验方法得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11 表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2 表示所有的第二列；N12 表示第一行，第二列。C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。本方法起草单位：成都市食品药品检验研究院。本方法参与单位：江南大学、国家粮食局科学研究院、广东省食品检验所、山东省食品药品检验研究院、浙江省食品药品检验研究院。本方法主要起草人：肖全伟、姚蕾珺、王昕、张敏、胥传来、田洪芸、沈泓、周露