食用油中苯并（a）芘的快速检测胶体金免疫层析法.doc

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1、 0 附件 10食用油中苯并（a）芘的快速检测胶体金免疫层析法（征求意见稿）1 范围本方法规定了食用油中苯并（a）芘的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于食用油中苯并（a）芘的快速测定。2 原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的苯并（a）芘经提取后与胶体金标记的特异性 抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深 浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中苯并（a）芘进行定性判定。3 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。3.1 试剂正己烷：色谱纯。乙腈：色谱纯。二甲基亚砜（DM

2、SO）。NaH2PO42H2O。Na2HPO412H2O。氯化钠。吐温-20。氢氧化钠溶液（2 mol/L）：称取 80g 氢氧化钠用水溶解，并定容至 1L。PBST 溶液：称取 0.2965g NaH2PO42H2O、2.9g Na2HPO412H2O、8.76g 氯化钠与 0.55g 吐温-20 用水溶解并定容至 1L。3.2 参考物质苯并（a）芘参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1， 纯度均95%。表 1 苯并（a）芘参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子质量苯并（a）芘Benzo(a)p

3、yrene50-32-8C20H12252.32注：或等同可溯源物质。 1 3.3 标准溶液的配制苯并（a）芘标准储备液（0.1 mg/mL）：精密称取苯并（a）芘标准品（3.2）适量，置于 10 mL 容量瓶中，用乙腈（3.1.2）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 0.1 mg/mL 的苯并（a）芘 标准储备液；或可直接购买苯并（a）芘标准储备液。0 5 避光保存备用，有效期 1 年。3.4 材料苯并（a）芘胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为食用油。3.4.1 金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体）。 3.4.2 试纸条或检测卡。4 仪器和设备4.1 移液器：100L、1 mL、5mL 和 1

4、0mL。4.2 涡旋混合器。4.3 离心机：转速4000 r/min。4.4 电子天平：感量为 0.01 g。4.5 氮吹仪或空气吹干仪（带温度控制）。5 分析步骤5.1 试样制备取适量有代表性样品充分混匀。5.2 试样提取和净化除脂称取10g油样于离心管中，加入5mL 正己烷（3.1.1）和15mL DMSO（3.1.3）并混合均匀。漩涡振荡2min，然后4000 r/min离心2min。弃去上层正己烷层。加入5mL 正己烷（3.1.1），漩涡振荡30s，然后4000 r/min离心30s。弃去上层正己烷层。加入10mL 氢氧化钠溶液（2 mol/L）（3.1.8）和15mL正己烷（3.1.

5、1），漩涡振荡30s，然后4000 r/min离心30s。吸取上层正己烷层于15mL离心管，4000 r/min离心2min。取全部正己烷层于氮吹管中，50氮吹或空气吹10min，吹干后加入200L DMSO（3.1.3）复溶，混合均匀，此为待测液。5.3 测定步骤打开试纸筒，取出所需数量的红色反应微孔（取出微孔后，立即盖好桶盖，以防受潮） 。往 微孔中加入 200L 的 PBST 溶液，再加入 50L 待测液，上下抽吸 5-10 次至微孔试剂混合均匀， 室温（20-25）反应 7min。将已做好标记的试纸条插入至上述红色微孔中，使样品垫充分进入 样品中，并计时 7min。从微孔中取出试纸条，

6、弃去试纸条下端的样品垫，进行结果判定。5.4 质控试验每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。5.4.1 空白试验 2 称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。5.4.2 加标质控试验准确称取空白试样（精确至0.01g）置于玻璃试剂瓶中，加入一定体积的苯并（a）芘标准储 备液（0.1mg/mL） （3.3.1），使试样中苯并（a）芘浓度为10g/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同 法操作。6 结果判定方式由于长时间放置会引起质控线（C线）与检测线（T线）颜色的变化，需在规定时间内进行 结果判定。试纸条与检测卡如图1所示。结果判定也可根据产品说明书进行。6.1 读数仪测定结果通过

7、读数仪对结果进行判读，根据不同厂家仪器规定进行判读。 无效：质控线（C线）不显色，无论检测线（T线）是否显色，均表示实验结果无效。 阳性：若检测结果显示“+”（阳性），表示试样中含有待测组分且其含量大于等于方法检出 限。 阴性：若检测结果显示“-”（阴性），表示试样中不含待测组分或其含量低于方法检出限。6.2 目视判定通过对比质控线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。 无效：质控线（C线）不显色，无论检测线（T线）是否显色，均表示实验结果无效。 阳性：质控线（C线）显色，若检测线（T线）不出现或出现但颜色浅于质控线（C线），表 示试样中含有待测组分且其含量高于方法检出限，判为阳性。

8、 阴性：质控线（C线）显色，若检测线（T线）颜色深于或等于质控线（C线），表示试样中 不含待测组分或其含量低于方法检出限，判为阴性。6.3 质控实验要求空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。 3 7 结论当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。8 性能指标8.1 检测限：10g/kg。8.2 灵敏度：95%。8.3 特异性：85%。8.4 假阴性率：5%。C TSCSTC TSC TSC TSC TS加样孔无效阴性阳性B检测卡吸水纸NC 膜样品垫无效阴性阳性C 线T 线A试纸条图 1 目视判定示意图 4 8.5 假阳性率：15%。注：性能指标计算方法参见附录 A。9 其他本方法

9、分析步骤和结果判定可以根据厂家试剂盒的说明书进行，但应符合或优于本方法规定 的性能指标。 本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做 限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定 的各项性能指标。 本方法参比标准为 GB 5009.27-2016食品安全国家标准 食品中苯并（a）芘的测定。 本方法使用试剂盒可能与苯并（a）蒽、苯并（b）荧蒽、苯并（e）芘、苯并（j）荧蒽等物 质存在交叉反应，当结果判定为阳性时应对结果进行确证。 5 附录 A定性方法性能计算表表 A.1 性能指标计算方法检测结果检测结果b 样品情况样品

10、情况a 阳性阳性阴性阴性总数总数阳性N11N12N1.=N11+N12阴性N21N22N2.=N21+N22总数N.1=N11+N21N.2=N12+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2显著性差异（2）2=（|N12-N21|-1）2/（N12+N21） ，自由度（df）=1灵敏度（p+，%）p+=N11/N1.特异性（p-，%）p-=N22/N2.假阴性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-灵敏度假阳性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特异性相对准确度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果。b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11 表示第一行， 第一列，N1.表示所有的第一行，N.2 表示所有的第二列；N12 表示第一行，第二列。C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。本方法负责起草单位：广东省食品检验所。验证单位：成都市食品药品检验研究院、中国农业科学院油料作物研究所。本方法主要起草人：熊含鸿、王立亚、简德威、陈思敏、雷毅