脊髓灰质炎病毒灭活试验.docx

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1、脊髓灰质炎病毒灭活试验（1）目的测定消毒剂对脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）灭活所需的剂量，以验证病毒污染物消毒实用剂量。（2）实验原理用细胞感染法测定消毒剂作用前后（或实验组与对照组）样本中脊髓灰质炎的量。以细胞病变作为判断指标，确定各组病毒的感染滴度，计算消毒剂对脊髓灰质炎的灭活率。（3）试验分组1）试验组。根据所测消毒剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量估计，设定适宜的浓度与作用时间组（不少于 1 个浓度，3 个作用时间），对作用时间的设计应不短于 30s。2）阳性对照组。用去离子水代替消毒剂，按试验组规定步骤加入脊髓灰质炎悬液进行试验和培养，观察脊髓灰质炎生长是否良好。3）阴性对

2、照组。用不含脊髓灰质炎的完全培养基作为阴性对照，观察所用培养基有无污染，细胞是否生长良好。（4）脊髓灰质炎悬液定量灭活试验操作程序1）从液氮中取出冻存的试验宿主细胞，在 37温水中迅速融化，并用细胞维持液洗涤两次后，转种于加有 10ml 完全培养基培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。2）取出低温冻存的脊髓灰质炎-1 毒株，37水浴融化，用细胞维持液作 10 倍稀释，然后接种于含已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待 3/4 细胞出现病变时，收获病毒。收获时，将培养液取出，用超声波或反复冻融破碎宿主细胞，尽快离心，并将含病毒的上

3、清液按每管 1.0ml 分装于无菌离心管（1.5ml）中，冷冻保存于-80备用。3）取待测消毒剂，用灭菌硬水稀释至所需浓度的 1.25 倍，于 201水浴中备用。4）取 100l 有机干扰物质与 100l 病毒原液混合，于 201水浴中作用 5min，加入 0.8ml 待检消毒剂，立即混匀并记时。作用规定时间，立即取出 0.1ml，加入中和剂中混匀；或用经鉴定合格的除药方法处理。5）阳性（病毒）对照组试验中，用无菌去离子水代替消毒剂。6）各组分别进行病毒滴度测定，可采用终点稀释法或噬斑法进行。7）试验重复 3 次。8）终点稀释法操作步骤：先用细胞维持培养液对待滴定样本做 10倍系列稀释，然后在

4、 96 孔培养板上滴定各稀释度样本中残留的病毒量，每个稀释度做 4 孔（各孔中应该已经长满单层的宿主细胞），在 37，放置 1h2h，以确保残留病毒全部吸附在细胞上。取出培养板，更换细胞维持培养液。继续放入二氧化碳培养箱中（37，5%CO2）培养，逐日在显微镜下观察细胞病变，连续观察 3d，逐孔观察并记录细胞病变情况。终点稀释法病毒感染滴度的计算：以半数细胞感染剂量（TCID50）表示。9）噬斑法操作步骤：先用细胞维持培养液对待滴定样本做 10 倍系列稀释，然后接种于细胞培养瓶中，滴定各稀释度样本中残留的病毒量。接种细胞前，将生长致密的单层细胞中的培养液倾出，加入 1ml 待测样品，放置 37

5、吸符 1h2h，倾出样液，加入含 0.8%琼脂的细胞维持液 3ml，冷却后翻转细胞瓶，放置 37培养 48h72h。然后每瓶细胞加入 2ml 甲醛溶液固定数分钟，用自来水冲洗后加结晶紫溶液染色数分钟，冲洗干净后计数。细胞瓶内圆形不着色的透明区即为一个蚀斑单位，每毫升测试样品中的病毒含量计算：pfu/ml平板平均蚀斑数稀释倍数注意：为了便于计数，病毒蚀斑数一般控制在每细胞瓶10pfu30pfu。（5）平均灭活对数值的计算平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50或 pfu）的为 N0，试验（消毒）组平均病毒感染滴度（TCID50或 pfu）为 Nx。平均灭活对数值 = log Nolog Nx（6）评价规定1）脊灰病毒灭活试验，可用于评价医疗器械、食具、物体表面和皮肤用化学消毒剂对病毒的灭活效果。病毒的灭活滴度，应达到 4 个对数值。2）在正常情况下，3 次试验的平均灭活对数值4.00，可判为对脊髓灰质炎病毒污染物消毒的实验室试验合格。同时，阳性对照组病毒滴度对数值应在 57 之间。（7）注意事项1）操作人员应具有基本的病毒学实验工作经验，尽量使用移液器与无菌一次性吸头。2）在杀菌试验中，每次均应设置阳性对照。3）如使用病毒载体进行试验，可参照上述悬液定量试验程序，并遵照病毒学原理进行适当修改后使用。