全国艾滋病检测技术规范.doc

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1、全国艾滋病检测技术规范National Guideline for Detection of HIV/AIDS（2004 年版）中国疾病预防控制中心二四年八月前 言为贯彻和落实中国预防与控制艾滋病中长期规划（18982010 年） 和中国遏制与防治艾滋病行动计划（20012005 年） ，加强全国艾滋病检测工作的规范化管理和质量控制，确保检测的准确性和可靠性，保证艾滋病检测实验室安全，及时有效地发现艾滋病病毒（HIV）感染者和上报疫情，在对 1997 年卫生部颁发的“全国艾滋病检测工作规范”修订的基础上，经卫生部同意于 2003 年 5 月由中国疾病预防控制中心颁发了全国艾滋病检测技术规范（试

2、行） （下称规范（试行） ） 。在规范（试行） 使用期间，卫生部和财政部共同制定了艾滋病免费自愿咨询检测管理办法（试行） 、 艾滋病及常见机会性感染免、减费药物治疗管理办法（试行） ，卫生部与中医药管理局共同制定了关于艾滋病抗病毒治疗管理工作的意见 ，另外国家还颁布了实验室生物安全通用要求（GB 18489-2004） 和医务人员艾滋病病毒职业暴露防护工作指导原则（试行） 等重要政策法规。根据我国艾滋病流行形势以及防治工作对实验室检测技术和策略的需求，一年来，在广泛听取各有关管理部门和使用单位意见的同时，中国疾病预防控制中心多次组织全国艾滋病检测实验室审评和技术指导专家组、顾问组及艾滋病专家咨

3、询委员会检测组成员，对规范（试行） 内容多次进行修改、补充和审定，于 2004 年 8 月完成了全国艾滋病检测技术规范 （下称规范 ）正式版本的最终审定。为了有效配合艾滋病自愿咨询检测（VCT）和抗病毒治疗工作，本次对规范（试行） 进行了重要修改和增补，包括：（1）对原有章节（样品的采集和处理，HIV 抗体、抗原检测,HIV 核酸定性检测，艾滋病检测实验室安全防护，实验室质量管理与考评，诊断试剂临床质量评估）的修改，使其更加符合目前艾滋病防治工作的需求，更加具有可操作性；（2）新增有关内容，包括艾滋病的 VCT 策略，婴幼儿HIV 感染诊断和 CD4+/CD8+ T 淋巴细胞检测，HIV RN

4、A 定量测定（病毒载量测定） ，并根据新颁布的文件、法规进一步明确了实验室的生物安全和职业暴露预防。修订后的规范共 10 章，包括：样品的采集和处理、HIV 抗体检测、HIV 核酸定性检测、HIV RNA 定量测定（病毒载量测定） 、CD4+ 和 CD8+ T 淋巴细胞检测、HIV 抗原检测、艾滋病实验室安全防护和职业暴露预防、艾滋病实验室质量管理、艾滋病实验室质量考评办法和 HIV 诊断试剂临床质量评估方案。本规范上报卫生部，经获准由中国疾病预防控制中心发至全国艾滋病实验室及有关单位。本规范将为国家、卫生部与财政部等部委下发的关于艾滋病防治工作的各项政策法规的有效实施提供强有力的技术支持。感

5、谢对规范修订工作做出重要贡献的全国艾滋病检测实验室审评和技术指导专家组和顾问组的专家，感谢对规范修订提出重要参考建议的卫生部艾滋病专家咨询委员会检测组专家，感谢全国艾滋病实验室网络的有关管理和技术人员对规范提出了许多具有可操作性的建议。本规范自发布之日起实施，同时中止全国艾滋病检测技术规范(试行) 。本规范适用于全国所有的艾滋病检测实验室。本规范解释权属中国疾病预防控制中心。I目 录第一章 样品的采集和处理11 范围12 规范性引用文件13 操作步骤13.1 样品的采集和处理13.2 样品的保存13.3 样品的运送23.4 样品的接收2第二章 HIV 抗体检测31 范围32 规范性引用文件33

6、 HIV 抗体检测实验室34 HIV 抗体检测的目的和要点34.1 HIV 抗体检测的目的34.2 HIV 抗体检测的要点35 常规 HIV 抗体检测的方法和程序45.1 HIV 抗体检测筛查试验45.2 HIV 抗体确认试验66 HIV 抗体检测的替代策略86.1 替代策略96.2 替代策略106.3 替代策略117 HIV 抗体检测情况季报的时间和程序12第三章 HIV 核酸定性检测131 范围132 规范性引用文件133 实验室条件13II3.1 实验室功能分区133.2 人员143.3 设施和设备144 方法和试剂144.1 方法144.2 试剂145 扩增目的基因片段155.1 样品

7、的采集和处理155.2 核酸提取155.3 逆转录155.4 PCR 扩增156 扩增产物分析及结果报告156.1 常用的扩增产物分析156.2 结果判定和报告157 实验室管理157.1 生物安全167.2 严格执行分区制度167.3 仪器和材料的专用制度167.4 单向流向制度167.5 废弃物处理制度16第四章 HIV RNA 定量测定（病毒载量测定）171 范围172 规范性引用文件173 实验室条件173.1 实验室功能分区173.2 人员183.3 设施和设备184 方法和试剂184.1 方法184.2 试剂195 实验室管理195.1 生物安全195.2 严格执行分区制III度1

8、95.3 仪器和材料的专用制度195.4 单向流向制度195.5 废弃物处理制度205.6 质量控制和评价206 HIV 核酸定量检测的意义206.1 辅助诊断206.2 早期诊断206.3 病程监控206.4 指导治疗方案及疗效判定216.5 预测疾病进程21第五章 CD4+和 CD8+T 淋巴细胞检测221 范围222 规范性引用文件223 实验室条件223.1 人员223.2 设施和设备223.3 功能分区224 样品采集、运输和接收224.1 样品的采集224.2 样品运输234.3 样品接收235 方法236 实验资料的记录237 结果报告248 质量控制和评价259 检测 CD4+

9、、CD8+ T 淋巴细胞的意义25第六章 HIV 抗原检测261 范围262 规范性引用文件263 实验条IV件263.1 人员263.2 设施和设备263.3 防护用具263.4 实验材料264 抗原检测264.1 适用范围264.2 试剂265 HIV P24 抗原检测方法275.1 试验准备275.2 试验操作275.3 试验结果275.4 结果报告和解释27第七章 艾滋病实验室安全防护和职业暴露预防291 范围292 规范性引用文件293实验室生物安全级别293.1 艾滋病血清学检测293.2 HIV 分离、研究294 实验室安全防护294.1 个人防护及保健294.2 实验室管理要求

10、304.3 实验室的安全操作314.4 避免利器的使用324.5 样品的采集324.6 带入和带出实验室的物品325 废弃物处置和消毒335.1 废弃物处置335.2 HIV 常用的消毒方法336 实验室意外和事故处理33V6.1 意外和事故336.2 意外和事故的紧急处理措施336.3 意外和事故登记、报告和检测347 艾滋病的职业暴露后预防347.1 职业暴露347.2 HIV/AIDS 的职业暴露后预防348 安全药品储备点的建立及管理机制37第八章 艾滋病实验室质量管理391 范围392 规范性引用文件393 质量保证（QA）393.1 行政支持393.2 实验室规范化建设393.3

11、人员培训及其评价393.4 标本采集、运送和处理393.5 检测方法和试剂的选择393.6 设备维护与校准393.7 文件和文件管理404 质量控制（QC）414.1 质控血清的制备和保存414.2 质控图的建立及应用424.3 “即刻法”质控445 质量评价（EQA）455.1 评价体系455.2 实验室室间质量评价及质量考评45第九章 艾滋病实验室质量考评办法461 范围462 规范性引用文件463 考评目的464 考评对象及组织单位46VI5 考评内容和方式466 考评工作程序477 考评结果的判定487.1 判分原则487.2 常规评分标准487.3 考评结果的判定488 考评结果的处

12、理498.1 对考评合格实验室的资格认证和鼓励498.2 对考评成绩较差实验室的整顿措施498.3 各参评实验室考评资料汇总及存档49第十章 HIV 诊断试剂临床质量评估方案501 范围502 规范性引用文件503 评估目的504 评估组织及参加单位504.1 国家级评估504.2 省级评估505 评估程序505.1 国家级评估505.2 省级评估516 评估结果的分析及统计处理517 评估结果的收集、分析、上报和反馈52附表 1 HIV 抗体筛查报告53附表 2 HIV 抗体复检化验单54附表 3 HIV 抗体确认检测报告单55附表 4 HIV 感染流行病学监测疫情报告单56附表 5 HIV

13、 抗体替代策略检测报告单 57附表 6 HIV 抗体检测数季报表58附表 7 艾滋病职业暴露个案登记表59附表 8 艾滋病防治工作人员职业暴露事故汇总表62全国艾滋病检测技术规范1第一章 样品的采集和处理1 1 范围范围本章规定了用于艾滋病病毒（HIV）检测的血清、血浆和全血样品的采集和处理方法，适用于 HIV 抗体检测、抗原检测、核酸检测、CD4+/CD8+T 淋巴细胞测定和 HIV 分离培养。2 2 规范性引用文件规范性引用文件Guidelines for Using HIV Testing Technologies in Surveillance WHO/CDS/CSR/EDC/2001

14、.16 UNAIDS/01.22E ISBN 9713-92-063-7.3 3 操作步骤操作步骤3.1 样品的采集和处理艾滋病检测最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血。唾液或尿液有时也可作为测试样品。常用的血液样品的采集和处理方法如下：3.1.1 血清样品采集和处理3.1.1.1 用一次性注射器（或真空采血管）抽取一定量静脉血，室温下自然放置 12h，待血液凝固、血块收缩后再用 3、000r/min 离心 15min，吸出血清备用。3.1.1.2 如用滤纸片采样，则手指或耳垂局部严格按常规进行消毒，在刺破皮肤后，迅速把滤纸片沾上，切勿让血液滴落在其它物体表面造成污染。采血后要待血样干燥后

15、再包装送检。3.1.2 抗凝血样品采集和处理3.1.2.1 用加有抗凝剂的真空采血管（或一次性注射器抽取静脉血，转移至加有抗凝剂的试管），反复轻摇，分离血浆和血细胞备用。3.1.2.2 应根据实验要求选用适当的抗凝剂，如 CD4+/CD8+T 淋巴细胞测定可选用 K3EDTA 或肝素或枸橼酸钠，HIV 病毒分离、核酸定性/定量检测可选用 K3EDTA 或枸橼酸钠。3.1.2.3 用于核酸定性检测时，采集的抗凝全血应在 48h 内分离 PBMC 和血浆，否则应在2448h 内分离血浆和血细胞。病毒载量测定不同方法对样品的要求见第四章 4.1 中表2；CD4+/CD8+T 淋巴细胞测定样品采集要求

16、见第五章 4.1。3.1.3 采集样品注意事项3.1.3.1 采集样品原则上应按临床采血技术规范操作（试剂盒说明书有特殊要求除外） 。3.1.3.1 采集样品时应注意安全，建议采用真空采血管及蝶形针具，以避免直接接触血液；直接接触 HIV 感染者/艾滋病（AIDS）病人血液/体液的操作,应戴双层手套。3.2 样品的保存3.2.1 用于抗体检测的血清或血浆样品，应存放于-20以下，短期（1 周）内进行检测的样品可存放于 2-8。全国艾滋病检测技术规范23.2.2 用于抗原和核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于-20以下，进行病毒 RNA 检测的样品如需保存 3 个月以上应置于-80。3.2.3 用

17、于 CD4+/CD8+T 淋巴细胞测定的样品不能长期保存，样品采集时间超过 48h 则不可检测。3.3 样品的运送3.3.1 实验室间传递的样品应为血清或血浆，除特殊情况外一般不运送全血。3.3.2 应采用 WHO 提出的三级包装系统3.3.2.1 第一层容器：装样品，要求防渗漏。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。随样品应附有送检单，送检单应与样品分开放置。3.3.2.2 第二层容器：要求耐受性好、防渗漏、容纳并保护第一层容器，可以装若干个第一层容器。将试管装入专用带盖的容器内，容器的材料要易于消

18、毒处理。3.3.2.3 第三层容器：放在一个运输用外层包装内，应易于消毒。在第三层容器外面要贴标签（数量，收、发件人） 。3.3.3 血清和血浆样品应在 28条件下由专人运送。用于 CD4+/CD8+T 淋巴细胞测定的样品应在室温下 1823运送。每一包装的体积以不超过 50ml 为宜。3.3.4 运送感染性材料必须有记录。3.3.5 如分离血浆仍有困难，可直接将抗凝血-20以下冻存，采用冰壶冷藏运输，避免冻融。3.3.6 特殊情况下如需对个别样品进行复测，可以用特快专递形式投寄，但必须按三级包装系统将盛样品的试管包扎好，避免使用玻璃容器，以保证不会破碎和溢漏。3.4 样品的接收3.4.1 含

19、有感染性样品的包裹必须在具有处理感染源设备的实验室内由经过培训的、穿戴防护衣的工作人员打开，用后的包裹应进行消毒。3.4.2 核对样品与送检单，检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器消毒，同时报告有关领导和专家。3.4.3 检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。如果污染过重或者认为样品不能被接受，则应将样品安全废弃。并要将样品情况立即通知送样人。3.4.4 打开标本容器时要小心，以防内容物泼溅。样品处理时若内容物有可能溅出，则应在生物安全柜中戴手套进行。同时应戴口罩、防护眼镜，以防皮肤或粘膜污染。3.4.5 因特殊临床治疗导

20、致自发荧光的样品不可用于荧光方法测试。3.4.6 接收样品时应填写样品接收单。全国艾滋病检测技术规范3第二章 HIV 抗体检测1 1 范围范围本章规定了 HIV 抗体的检测方法、检测程序、检测报告及检测策略，适用于各级各类医疗机构、疾病预防控制机构、检验检疫机构、采供血机构及卫生保健机构。可作为对 HIV 感染者/AIDS 病人的诊断、报告和处理的实验室依据。2 2 规范性引用文件规范性引用文件Revised recommendations for the selection and use of HIV antibody tests. WHO/UNAIDS Revised version 2

21、001.实验室生物安全通用要求（GB 19489-2004） 。3 3 HIVHIV 抗体检测实验室抗体检测实验室应符合全国艾滋病检测工作规范（1997 年版） 中对检测实验室人员、建筑设施和设备等条件的要求。应符合实验室 生物安全通用要求 （GB 19489-2004）对 II 级生物安全实验室（BSL-2）的各项要求。实验室的质量保证按本规范第八章规定执行。实验室安全防护按本规范第七章规定执行。4 4 HIVHIV 抗体检测的目的和要点抗体检测的目的和要点4.1 HIV 抗体检测的目的4.1.1 HIV 抗体检测可用于监测、诊断、血液筛查。4.1.2 以监测为目的的检测是为了解不同人群 H

22、IV 感染率及其变化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。4.1.3 以诊断为目的的检测是为了确定个体 HIV 感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。4.1.4 以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播 HIV 而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。4.2 HIV 抗体检测的要点4.2.1 筛查试验阳性不能出阳性报告。4.2.2 严格遵守实验室标准操作程序（SOP） 。4.2.3 严格按照试剂盒说明书操作。4.2.4 注意防止样品间交叉污染。全国艾滋病检测技术规范45 5 常规常规 HIVHIV 抗体检测的方法和程序抗体检

23、测的方法和程序HIV 抗体检测分为筛查试验（包括初筛和复检）和确认试验。5.1 HIV 抗体检测筛查试验5.1.1 筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、批批检合格、在有效期内的试剂。推荐使用经临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。5.1.2 筛查方法5.1.2.1 常用的筛查方法是酶联免疫试验（ELISA）目前国内外主要使用第三代（双抗原夹心法）试剂，少数使用第二代试剂。血源筛查仍以第三代 ELISA 为主，国际上有些国家和地区已将线性免疫酶测定（第四代 ELISA 试剂）用于血源筛查。第四代 ELISA 试剂是最近发展起来的 HIV 抗原抗体联合测定试剂，可同时检测 P24 抗原和

24、抗 HIV-1/2 抗体。与第三代抗 HIV-1/2 试剂相比，检出时间提前了 49.1d。其优点在于能同时检测抗原抗体，降低血源筛查的残余危险度。5.1.2.2 快速检测（RT）及其它检测 随着对 HIV 感染者和 AIDS 病人抗逆转录病毒治疗的进展，及对无症状 HIV 感染者提供自愿咨询检测（VCT）的迫切需求，简便、快速的 HIV 检测方法被广泛应用。常用的主要有以下几种：（1）明胶颗粒凝集试验（PA）：PA 是 HIV 血清抗体检测的一种简便方法，是将 HIV 抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温（一般为室温） 。当待检样品含有 HIV 抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与

25、抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA 试剂有两种，HIV-1 和 HIV-2 抗原共同致敏的 PA 试剂（AFD HIV-1/2 PA） ，已经我国食品药品监督管理局（SFDA）注册批准；HIV-1、HIV-2 抗原分别致敏的 PA 试剂（SERODIA-HIV-1/2）可初步区分 HIV-1 型和 HIV-2 型，目前我国尚未引进。（2）斑点 EIA 或称斑点 ELISA（dot-EIA）：以硝酸纤维膜为载体，将 HIV 抗原滴在膜上成点状，即为固相抗原。加血清样品作用，以后步骤同 ELISA。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在 10 min 以内

26、，使用抗原量少。（3）斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验：与斑点 EIA 相似，也是以硝酸纤维膜为载体。区别在于不用酶标记抗体，而代之以红色的胶体金（或胶体硒）A 蛋白，用渗滤法作为洗涤方法。试剂稳定，可室温长期保存。试验时不需任何设备，迅速、简便、特异性较好，敏感性约相当于中度敏感的 ELISA，适用于应急检测、门诊急诊个体检测。目前已有在国内被 SFDA 批准注册的国外进口试剂和国内产品。一般可在 1030min 内判读结果。（4）艾滋病唾液检测卡：在硝酸纤维膜上包被人工合成的 HIVgp41/gp36 蛋白抗原，可同时检测含在唾液中的 HIV-1/HIV-2 抗体，原理为酶免疫间接法。主

27、要检测唾液中的 HIV IgA 与IgG 抗体，敏感性特异性与 ELISA 相近，可避免静脉穿刺。但样品预处理时间长且售价较高。以唾液为样品测定 HIV 抗体的 ELISA、免疫印迹法（WB）试剂已经美国 FDA 批准。全国艾滋病检测技术规范5（5）其它快速筛查试验方法：家庭 HIV 检测（Home Access System）等。5.1.2.3 尿液 HIV 抗体检测1996 年美国 FDA 首次批准 HIV-1 尿液 ELISA 试剂，我国也正在研制尿液 HIV 抗体检测试剂。主要适用于静脉注射毒品（IDUs）人群和其它高危人群的大面积流行病学调查、监测。筛查阳性者仍需采血做确认试验才能确

28、定。5.1.3 筛查试验根据检测目的选用符合要求的筛查试剂对样品进行初筛和重复检测（复检） 。5.1.3.1 初筛试验：以第三代 ELISA（双抗原夹心法）为例。（1）实验准备：试验开始前将试剂和样品放置在室温(1823), 按实验室 SOP 做好试剂准备。磷酸盐缓冲液：若液体内有结晶,应放置在 37直至溶解，用蒸馏水 1：25 稀释浓缩液，4保存 2 周。TMB 底物液：使用前配制，TMB 液和过氧化脲液等量混匀。1M 硫酸终止液：85 ml 蒸馏水中加入 5 ml 浓硫酸。备好试剂盒、待检样品和外部对照质控血清后，按试剂盒说明书以及质控和安全防护要求进行筛查检测。（2）实验操作装好所需使用

29、数目的孔条,每孔均加入 100l 样品稀释液。设 3 个阴性对照孔，1 个HIV-1 阳性对照孔，若需要可再设 1 个 HIV-2 阳性对照孔。每孔加入 50l 待检样品及对照（对照要后加） ，未用孔用样品稀释液加满以溶解结合物球，以免堵塞洗板机孔。可震摇 15S，372孵育 605min。置洗板机上洗涤 6 遍（用洗液将反应孔完全加满,静置 3060S,共洗涤 6 遍，洗完后孔上方及底部不应残存液体,禁止在滤纸上拍干） 。每孔加入 100l 底物液，勿搅动，室温避光孵育 302min。每孔加入 100l 1M 硫酸终止反应，充分混匀。在 2h 内置于酶标仪读数，单波长 450nm，或双波长

30、450/630nm 测 OD 值。（3）实验结果阴性对照（NC） ，HIV-1 阳性对照（PC1） ，HIV-2 阳性对照（PC2）NC 必须0.25 方可用，排除 NC0.25 的值，计算 NC 平均值。NC 界限范围：0.6 倍 NC 均值NC1.4 倍 NC 均值。符合以下条件的实验成立：两个以上的 NC 可用。PC1-NC 均值 0.4，PC2-NC 均值 0.4Cut off 值 = 阴性对照均值 + 0.100小于 Cut off 为阴性，大于或等于 Cut off 为阳性（4）报告：对呈阴性反应的样品，可由实施检测的实验室出具 HIV 抗体阴性报告；对呈阳性反应的样品，须进行复检

31、，不能出阳性报告。5.1.3.2 复检试验：对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛查试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告 HIV 抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认（见图 1） 。全国艾滋病检测技术规范6图图 1 1 HIVHIV 抗体筛查检测流程抗体筛查检测流程5.1.4 初筛试验结果的报告对 HIV 抗体筛查试验，呈阴性反应者可出具“HIV 抗体阴性”报告（可用附表 1） ；对初筛试验呈阳性反应者不能出阳性报告，可出具“HIV 抗体待复查”报告（附表 1） 。5.1.5 初筛试验呈阳性反应样品的转送如需送上级实验室进行复

32、测或确认，需要填写“HIV 抗体复测送检单” （附表 2） ，经 1 名检验人员和 1 名具有中级以上技术职称的人员审核签字。送当地艾滋病筛查中心实验室，再转送艾滋病确认实验室，或在本实验室复检后直接送确认实验室。5.1.6 对筛查阴性和阳性者，均需做好检测后咨询。5.2 HIV 抗体确认试验5.2.1 确认试验的试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。5.2.2 确认试验方法包括免疫印迹试验（WB） 、条带免疫试验（LIATEK HIV） 、放射免疫沉淀试验（RIPA）及免疫荧光试验（IFA） 。国内常用的确认试验方法是 WB。5.2.3 确认检测流程有 HIV-1/2 混合型和单一的 HIV-1 或 HIV-2 型。先用 HIV-1/2 混合型试剂进行检测，如果呈阴性反应，则报告 HIV 抗体阴性；如果呈阳样 品初筛检测初筛检测筛查试剂阳性反应阴性反应重复检测重复检测原有试剂加另外一种筛查试剂一阴一阳均阴性反应均阳性反应送确认实验室确认报告阴性全国艾滋病检测技术规范7性反应，则报告 HIV-1 抗体阳性；如果不满足阳性标准，则判为 HIV 抗体检测结果不确定。如果出现 HIV-2 型的特异性指示条带，需用 HIV-2